Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Классификация, структура и функции Толл-подобных рецепторов 12
1.2 Сигнальные пути, ассоциированные с Толл-подобными рецепторами 21
1.3 Участие Toll-подобных рецепторов в формировании реакций врожденного и приобретенного иммунитета 26
1.4 Экспрессия Толл-подобных рецепторов различными типами клеток 27
1.5 Участие Толл-подобных рецепторов в формировании резистентности организма в отношении различных патогенов 36
1.6 Использование лигандов Толл-подобных рецепторов в медицинской практике 38
1.7 Заключение 40
ГЛАВА2. Материалы и методы 43
2.1 Материалы 43
2.1.1 Бактериальные штаммы 43
2.1.2 Лиганды Толл-подобных рецепторов 2,4,5 43
2.1.3 Лабораторные животные 43
2.1.4 Ферменты и другие реактивы 43
2.1.5 Лабораторное оборудование 44
2.2 Методы
2.2.1 Измерение интенсивности биолюминесценции в организме трансгенных мышей BALB/c в режиме реального времени 44
2.2.2 Определение интенсивности биолюминесценции в органах трансгенных мышей 45
2.2.3 Выделение тотальной РНК из мочевого пузыря мыши 45
2.2.4 Реакция обратной транскрипции 46
2.2.5. Получение гистологических срезов 46
2.2.6. Иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов 47
2.2.7 Окраска гистологических срезов гематоксилином и эозином 47
2.2.8 Постановка полимеразной цепной реакции 47
2.2.9. Определение экспрессии белков методом иммуноблотинга 49
2.2.10. Измерение концентрации цитокинов 50
2.2.11. Культивирование S. typhimurium 51
2.2.12. Модель инфекции S. typhimurium на лабораторных животных 51
2.2.13 Культивирование Е. coli 51
2.2.14 Модель урологической инфекции Е.соИ на лабораторных животных 51
2.2.15 Определение количества бактерий методом высева 52
ГЛАВА 3. Результаты исследований 52
3.1. Анализ способности лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5
активировать транскрипционный фактор NF-kB in vivo 53
3.2 Анализ влияния дозы лигандов TLR на активацию NF-kB в мочевом пузыре. 3.3 Определение типа клеток в печени, в которых происходит активация NF kB в ответ на стимуляцию Толл-подобного рецептора 5 58
3.4 Полногеномный анализ изменения экспрессии генов в печени после введения лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5 59
3.5 Определение влияния стимуляции Толл-подобных рецепторов на уровень секреции цитокинов в гомогенате печени 62
3.6 Определение влияния стимуляции Толл-подобных рецепторов на выживаемость мышей при инфекции S. typhimurium 67
3.7 Определение типа клеток в мочевом пузыре мыши, в котором происходит активация NF-kB в ответ на стимуляцию TLR 5 73
3.8 Определение типа клеток в мочевом пузыре макаки резус, в котором происходит активация NF-kB в ответ на стимуляцию TLR 5 76
3.9 Полногеномный анализ изменения экспрессии генов в мочевом пузыре мыши после введения лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5 78
3.10 Полногеномный анализ изменения экспрессии генов в мочевом пузыре макаки резус после введения лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5 81
3.11 Проверка данных полногеномного анализа транскриптома мыши 84
3.12 Изменение цитокинового/хемокинового статуса в мочевом пузыре мыши 87
3.13 Определение влияния лиганда Толл-подобного рецептора 5 на резистентность мышей к урологической инфекции 88
4. Обсуждение результатов 91
Выводы 105
Список используемой литературы
- Участие Toll-подобных рецепторов в формировании реакций врожденного и приобретенного иммунитета
- Лиганды Толл-подобных рецепторов 2,4,5
- Иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов
- Определение влияния стимуляции Толл-подобных рецепторов на уровень секреции цитокинов в гомогенате печени
Участие Toll-подобных рецепторов в формировании реакций врожденного и приобретенного иммунитета
Для распознавания некоторых лигандов TLR2 необходимо образование гетеро дим еров с TLR1 или TLR6 (Ozinsky A., Underhill D, 2000; Takeuchi О., Kawai Т., 2001; Takeuchi О., Sato S, 2002; Morr M., Takeuchi О. 2002). Так, комплекс TLR2/TLR1 распознает бактериальные триацилированные липопротеины (Jin М, Kim S, 2009), а комплекс TLR2/TLR6 — диацилированные липопротеины (Kang J, Nan X, 2007). Взаимодействия между мономерами различных Толл-подобных рецепторов расширяют спектр их лигандов. Так, в гетеродимерном состоянии они приобретают возможность взаимодействовать со структурами, которые не могут быть распознаны гомодимерами этих рецепторов. Гетеро димер TLR2/TLR1 распознает бактериальные триацильные липопептиды грамотрицательных бактерий. При этом TLR2 взаимодействует с двумя ацильными цепями, a TLR1— с одной ацильной цепью липопептида. Гетеродимер TLR2/TLR6 взаимодействует с диацильными, но не с триацильными липопептидами грамположительных бактерий. Лигандами гетеро димера TLR2/TLR6 также являются липотейхоевая кислота грамположительных бактерий. TLR2 может формировать димеры не только с Толл-подобными рецепторами, но и с другими молекулами, такими как CD36, CD14 и дектин-1 (Hoebe, К., P. Georgel,, 2005; Janot L, Secher Т. ,2008; Ferwerda G, Meyer-Wentrup F, 2008).
Толл-подобный рецептор 3 распознает вирусную дцРНК, которая синтезируется во время инфекции, как промежуточное звено цикла репликации вируса, или является частью вирусного генома (Alexopoulou L, Holt А., 2001) Распознавание TLR3 собственного лиганда происходит вовремя эндоцитоза, или во время фагоцитоза инфицированной вирусом клетки фагоцитирующей клеткой. Также, показано, что TLR3 взаимодействует с дцРНК, высвобождаемой при гибели собственных клеток (Kariko К, Ni Н, 2004), и с микроРНК (Chen X, Liang Н.; 2013). Синтетическим лигандом TLR3 является аналог дцРНК — поли (1:С) (Alexopoulou L, Holt А., 2001). Было показано, что полимер с высокой молекулярной массой (более 5 kb) лучше активирует рецептор, чем полимер с меньшей молекулярной массой (l,5kb) (Zhou Y, Guo M, 2013).
Эктодомен TLR3 состоит из 23 лейцин богатых повторов (leucine rich repeat, LRR). Основным регионом, принимающим участие в распознавании дцРНК, является 20 LRR. В силу своей симметричной природы дцРНК обеспечивает связывание двух молекул TLR3, повёрнутых навстречу друг другу. Такая димеризация является сигналом, активирующим каскад последующих внутриклеточных процессов этого сигнального пути (Liu L, Botos I, 2008).
TLR4 является самым первым представителем семейства Толл-подобных рецепторов, открытым у млекопитающих. Он участвует в распознавании широкого спектра лигандов: пневмолизина пневмококка, липоолигосахарида менингокока, шаперона 60 Chlamydia pneumoniae, гликолипидов Treponema brennaborense, протеина F респираторно-синцитиального вируса, таксола растений и др. Однако, наиболее важной (J)yHra],HefiTLR4 считается распознавание липополисахарида (ЛПС) - основного компонента внешней мембраны грамотрицательных бактерий, который является мощным экзогенным провоспалительным фактором. Для распознаванияЛПС необходимо участие адаптерных молекул (LBP, CD14, MD-2). Первоначально, во внеклеточном пространствеЛПС связывается с растворимым липополисахарид-связывающим белком (LBP), который функционирует как опсонин для гликозилфосфатидилинозитол-связанного белка CD14. Белок CD14 может существовать в двух формах — растворимой и мембраносвязанной. Взаимодействие комплекса ЛПС/LBP с растворимой формой CD 14 предопределяет его связывание и передачу сывороточным липопротеинам высокой плотности (ЛПВП). Показано, что связывание ЛПС с ЛПВП нейтрализует его иммуностимулирующую активность как invitro, так и invivo.Взаимодействие комплекса ЛПС/LBPc мембраносвязанной формой CD 14 катализирует связывание ЛПС с мембрано-ассоциированным протеином MD-2. Далее комплексЛПС/МО-2 взаимодействует с TLR4, вызывая его димеризацию и активацию последующего сигнального каскада (Fujihara М, Muroi М, 2003; Miyake К.2003).
TLR5 распознает основной белок бактериальных жгутиков - флагеллин, молекула которого в зависимости от происхождения состоит из 259-1250 аминокислотных остатков. Согласно современным данным, эктодомен TLR5 на участке связывающего сайта (386-407 аминокислотных остатков LRR14) распознает флагеллиновый мотив, который образован последовательностью, гомологичной сегменту 89-96 аминокислотных остатков флагеллина S. typhimurium (Andersen-Nissen Е., Smith К., 2005, Yoon S., Kurnasov О., 2012).
TLR7 и TLR8 являются филогенетическими гомологами и относятся к подсемейству TLR9 (Takeda К., Akira S., 2007). Оба рецептора локализуются в эндосомах. Hemmi и соавторы показали, что TLR7 человека и мыши способны распознавать синтетические лиганды - производные имидазоквинолинов: Imiquimod (R837, Invitrogen) и Resiquimod (R848, Invitrogen) (Hemmi H, Kaisho T, 2002). Естественным лигандом TLR7 является одноцепочечная вирусная РНК. TLR8 человека также способен распознавать одноцепочечную вирусную РНК и R848, но не R837, тогда как TLR8 мыши не распознает ни один изданных лиганов. Долгое время считалось что данный рецептор у мыши функционально неактивен. C HaKO,Gorden и соавторы показали, что TLR8 мыши активируется при совместной стимуляции производными имидазоквинолинов и олигодеоксинуклеотидами (Gorden К., Gorski К., 2005). TLR9 также локализован в эндосоме иактивируется характерными для бактерий, грибов и вирусов неметилированными последовательностями CpG ДНК, которые не встречаются у млекопитающих. Интернализация CpG-ДНК вызывает транслокацию TLR9 от эндоплазматического ретикулума непосредственно к фаголизосомам и последующую активацию рецептора. Локализация TLR9 на внутренней поверхности мембраны эндолизосомы предотвращает его взаимодействие с собственной ДНК. В эксперименте было продемонстрировано, что TLR9 взаимодействует с CpG-ДНК в кислой среде, созданной в экзолизосоме(Ьа!2 Е, Schoenemeyer А, 2004). Предпосылкой для эффективного распознавания лиганда и активации рецептора является предварительное протеолитическое катепсин-обусловленное расщепление эктодомена TLR9 (Ewald S., Lee В., 2008). В группу протеаз, которые участвуют в расщеплении эктодомена TLR9, входят катепсин-В, -S, -L, -Н, -К и аспарагиновая эндопептидаза (Ewald S., Engel А., 2011). TLR9 существует как предсформированный гомодимер. Его связывание с лигандом приводит к изменению конформационного состояния молекулы рецептора, которое обеспечивает сближение цитоплазматических TIR-доменов разных мономеров и, как следствие, активацию внутриклеточных сигнальных путей. Лиганд TLR10 в настоящее время не определен.
Лиганды Толл-подобных рецепторов 2,4,5
Мышам линии BALB/c подкожно вводили флагеллин 10 мкг/мл, ЛПС 10 мкг/мл или фосфатный буфер. Через 18 часов после инъекции мышей усыпляли и далее производили отбор мочевого пузыря. Все органы немедленно помещали лизирующий буфер Т-рег (кат. №78510, ThermoScientific, США), добавляли керамические гранулы (Matrix D, MPBiomedicals) и гомогенизировали с помощью прибора FastPrep-24 (MPBiomedicals), который работает по принципу шаровой мельницы. Далее все гомогенаты нормировали по белку с помощью peaKTHBaQuickStart BradfordProteinAssay (500-0201, Bio-Rad, США). Разделение белка в полиакриламидном геле проводили по методу Лемли с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану (AmershamBiosciences, США). Для детекции лактоферрина были использованы мышиные моноклональные антитела (кат. № ablOHO, Abeam, США). Для нормирования проб также использовали антитела к белку GAPDH (SantaCruz, США). Для визуализации результата использовали вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (AmershamBiosciences, США), а также хемилюминесцентный субстрат ECL (AmershamBiosciences, США). Люминесценциюдетектировали с помощью светочувствительной пленки (AmershamBiosciences, США). 2.2.10. Измерение концентрации цитокинов
Для определения концентраций хемокинов и цитокинов ((ИЛ- 1а, ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9 ИЛ-10, ИЛ-12 (р40), ИЛ-12 (р70), ИЛ-13, ИЛ-17, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-у, МСР-1, MIP-la, MIP-lp, RANTES, ФНО-а) в исследуемых образцах использовали наборВіо-РІех 23-plex (кат. номеры L60-009RDPD, Bio-Rad, США) для мультиплексного иммуноферментного анализа на магнитных частицах Magpix (Bio-Rad, США).
Подготовку проб и анализ производили согласно методике производителя. На первом этапе разведенные в соотношении 1:10 магнитные частицы с адсорбированными антителами наносили по 50 мкл на 96 луночный планшет. Далее к ним добавляли по 25 мкл разведенных стандартов и нормированных по содержанию общего белка проб. В контрольные лунки добавляли 25 мкл буфера. Далее проводили инкубацию в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. После инкубации планшет промывали 3 раза по 100 буферного раствора на лунку, удерживая его на магнитной подставке. Затем во все пробы добавляли по 25мкл смеси вторичных антител, коньюгированных с биотином, и инкубировали 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Далее удерживая планшет на магнитной подставке, его промывали 3 раза по 100 буферного раствора/лунку.
На следующем этапе к пробам добавляли по 50мкл раствора стрептавидина, коньюгированного с фикоэритрином и инкубировали 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. После инкубации планшет промывали 3 раза по 100 буферного раствора на лунку, удерживая его на магнитной подставке. Далее магнитные частицы ресуспендировали в 125 мкл буфера и выполняли анализ с использованием прибора MAGPIX (Bio-Rad, США). Расчет концентрации цитокинов проводили, используя программное обеспечение прибора. 2.2.11. Культивирование & typhimurium.
На первом этапе бактерии высевали на дифференциально-диагностическую твердую среду Ml08 (HiMedia, Индия) и культивировали в течение 18 часов при темепературе 37С. Затем бактерии культивировали при 37С с шутелированием в среде Лурия-Бертани. Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы.
S. typhimurium культивировали при 37С с шутелированием в среде Лурия-Бертани в течение 18 часов. Затем бактерии осаждали 5000g 10 минут и разводили в стерильном ФСБ. Ориентируясь по стандартам мутности, подготавливали раствор бактерий с концентрацией около 2 106 КОЕ/мл. Точную концентрацию бактерий определяли методом высева на дифференциально-диагностическую твердую среду Ml08 (HiMedia, Индия). Далее бактериальную суспензию вводили перорально по 0,5 мл мышам линии BALB/c, самкам, 18-20 г.Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы. Изменение веса и выживаемость животных оценивали в течение 30 дней.
Культивирование E.coli проводили при 37С без шутелирования в среде Лурия-Бертани в течение двух суток (по методу Natureprotocols). В первый день одну колонию поместили в 10 мл среды. Затем через 16 часов 25 мкл из данной пробирки переносили в колбу с 25 мл свежей среды и инкубировали 32 часа. Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы.
Модель урологической инфекции, вызванной/?, сой , на лабораторных животных. Бактериальную суспензию центрифугировали в течение 3 минут при скорости 5000xg. Надосадочную жидкость удаляли, а бактериальный осадок разводили в стерильном фосфатном буфере до 7,5 единиц МакФарланда. Данную суспензию использовали для инфицирования мышей.
Мышам линии BALB/c (самкам) подкожно вводили раствор для анестезии, содержащий 45 мг/кг Золетила и 7,5 мг/кг Рометара. Далее животным вводили в мочевой пузырь катетер, обработанный стерильным вазелиновым маслом. Затем через катетер в мочевой пузырь вводили 50 мкл полученной суспензии E.coli. Бактериальную суспензию выдерживали в мочевом пузыре в течение 20 минут, затем катетер удаляли. Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы.
Для определения количества бактерий, у зараженных животных отбирали органы (печень или мочевой пузырь). Образцы ткани гомогенизировали с помощью прибора FastPrep-24 (MP Biomedicals). Далее делали серию десятикратных разведений полученных образцов в фосфатном буфере (всего десять разведений). По 100 мкл из каждого разведения высевали на дифференциальную среду (Ml08 и М029 (HiMedia, Индия) для S. typhimuriunm E.coli, соответственно. Далее проводили инкубирование при температуре 37 С. Через 18 часов проводили подсчет выросших колоний. Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы.
Иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов
Наиболее выраженные гистологические изменения, характерные для сальмонельной инфекции (Дьяченко А., Демьянова А., 2010), наблюдались в контрольной группе мышей, которым вводили только S. typhimurium. У данных животных на 1 сутки эксперимента возникло полнокровие вен портальной системы печени с наличием в них небольшого числа форменных элементов крови, отек ткани со значительным сужением пространств синусоидов и единичные мелкие клеточные инфильтраты паренхимы. По периферии печеночных долек часто встречались участки ткани с явлениями различной степени дистрофии гепатоцитов, располагающие вблизи портальных трактов. На 3 сутки эксперимента была отмечена мелкоочаговая и диффузная инфильтрация паренхимы и расширение синусоидов за счет отека ткани на периферии печеночных долек. Ядра гепатоцитов имели различные размеры, встречалось много клеток с крупными ядрами, многочисленными ядрышками и участками конденсации хроматина. Среди клеток воспалительных инфильтратов преобладали нейтрофильные лейкоциты, а цитоплазма гепатоцитов находилась в состоянии зернистой дистрофии. На 6 сутки эксперимента в ткани печени были обнаружены выраженные явления полнокровия вен портальной системы печени, расширение пространств синусоидов, отек ткани, дистрофия печеночных клеток в центральных и особенно периферических отделов печеночных долек. В паренхиме отмечены мелкие очаги кровоизлияния, множественные участки деструкции ткани и образования в этом месте воспалительных инфильтратов, представленных нейтрофилами и макрофагами. Пространства синусоидов заполнены белковыми массами.
В группе животных, которым вводили флагеллин и S. typhimuriumna. 1 сутки эксперимента ткань печени имела практически нормальную структуру с умеренным полнокровием ткани и отсутствием патологически измененных участков ткани. Отмечено лишь некоторое увеличение числа гепатоцитов с крупными ядрами и многочисленными ядрышками и умеренная гиперхромность ядер звездчатых ретикулоэндотелиоцитов. На 3 сутки эксперимента на фоне умеренного полнокровия в периферических отделах печеночных долек наблюдался отек ткани, очаговое расширение просвета синусоидов и явления зернистой дистрофии цитоплазмы гепатоцитов. Отмечены отдельные мелкие воспалительные инфильтраты паренхимы, представленные в основном мононуклеарными клетками с небольшой примесью нейтрофилов. На 6 сутки эксперимента отек паренхимы отсутствовал, но сохранялись мелкие воспалительные инфильтраты преимущественно на периферии печеночных долек. Пространства синусоид имели в основном щелевидный характер, а в цитоплазме гепатоцитов встречались отдельные мелкие вакуоли. Воспалительный инфильтрат носил смешанный характер и был представлен мононуклеарами и нейтрофильными лейкоцитами.
В группе животных, которым вводили только флагеллин, лишь на третьи сутки эксперимента был отмечен некоторый отек ткани печени, характеризующийся расширением пространств синусоидов периферических отделов печеночных долек. В остальные сроки эксперимента гистологическая картина печени не отличалась от контрольной группы, которой вводили только фосфатный буфер, и соответствовала норме.
В целом полученные результаты показывают, что подкожное введение флагеллина, в отличие от липопептида и липополисаарида, достоверно увеличивает резистентность животных к S. typhimurium.
Мочевой пузырь является органом, в котором была обнаружена наиболее высокая активация NF-kB (увеличение в 140 раз по сравнению с контролем) после подкожного введения агониста Толл-подобного рецептора 5 флагеллина. Для того чтобы определить в каких типах клеток происходит активация NF-kB, мы использовали метод иммуногистохимического окрашивания срезов мочевого пузыря на р65 субъединицу NF-kB, которая при активации данного транскрипционного фактора мигрирует в ядро. Следовательно, только те клетки, в которых р65 прокрашивается в ядре, отвечают на введение лиганда.
Эксперимент был выполнен по следующей схеме: мышам линии Balb/c вводили подкожно 5 мкг/мышь флагеллина (лиганд TLR5), 10 мкг/мышь ЛПС (лиганд TLR4), 5 мкг/мышь липопептида (лиганд TLR2). Через 30 минут у всех животных отбирали образцы мочевого пузыря, из которых затем готовили криосрезы. Далее проводили иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани . Срезы инкубировали с антителами против р65 (мечеными зеленым флуорохромом), а также с антителами против цитокератина-8 (мечеными фиолетовым флуорохромом), который является маркерным белком эпителиальных клеток и против (3-актина (мечеными красным флуорохромом), который является маркерным белком мышечных клеток. Ядра клеток были окрашены DAPI. Фотографии срезов представлены на рисунке 22.
Наименьшее количество клеток, у которых был активирован транскрипционный фактор NF-kB, наблюдалось в ответ на липополисахарид и липопетид. При этом, также как и в печени, в ответ на стимуляцию разных рецепторов наблюдалась активация NF-kB в различных типах клеток. Стимуляция TLR4 приводила к активации NF-kB в эпителии, но не в других клетках мочевого пузыря. В ответ на липопептид была обнаружена активация NF-kB в клетках эпителия и собственной пластинки.
В ответ на стимуляцию TLR5 NF-kB активировался в наибольшем количестве клеток, что полностью согласуется с результатами, полученными нами на Balb/cg(IkBa-luc)Xen трансгенных мышах (пункты 3.1, 3.2). Также, как и в ответ на ЛПС, активация NF-kB была обнаружена только в клетках эпителия. Можно предположить, что именно за счет ответа эпителиальных клеток достигалась такая мощная активация NF-kB в ответ на введение агониста Толл-подобного рецептора 5.
Определение влияния стимуляции Толл-подобных рецепторов на уровень секреции цитокинов в гомогенате печени
В данном исследовании представляло интерес определить в каких конкретно типах клеток происходит активация NF-kB в ответ на введение лигандов Тол-подобных рецепторов 2,4,5. Мочевой пузырь представляет собой полый мышечный орган, который состоит из четырех слоев: слизистой оболочки, состоящей из многослойного эпителия (уротелий); собственной пластинки, представленной соединительной тканью, в которой находятся сетки кровеносных и лимфатических сосудов, нервные окончания; мышечного слоя, состоящегоиз пучков гладких мышечных волокон; серозной оболочки. Результаты иммуногистохимического исследования показали, что при введении лигандов TLR2,4,5 активация NF-kB происходит в разных типах клеток. В ответ на флагеллин данный транскрипционный фактор активировался в большом количестве эпителиальных клеток. В ответ на ЛПС также наблюдалась активация в уротелий, однако в гораздо меньшем количестве клеток. При добавлении липопептида была обнаружена активация NF-kB как в эпителиальном слое, так и в клетках собственной пластинки.
На следующем этапе работы мы проверили возможность экстраполяции данных, полученные в предыдущих экспериментах, на другие виды млекопитающих. Для этогобыла выбрана модель примата Масаса mulatta (макака резус). Иммуногистохимическое исследование мочевого пузыря макак резус после введения им агонистов TLR2,4,5 показало результаты, аналогичные полученным на мышах. Флагеллин при подкожном введении проявил себя как наиболее сильный индуктор стимуляции NF-kB в мочевом пузыре. При этом активация данного транскрипционного фактора в группе животных, которым вводили лиганд TLR5 (также, как и в группе, которой вводили лиганд TLR4) была обнаружена только в эпителиальных клетках. В группе животных, которым вводили липопептид наблюдалась активация как в клетках эпителия, так и соединительной ткани.
Из литературных данных известно, что эпителий выполняет не только барьерную функцию, но и активно участвует в развитии иммунных реакций. Songa и соавт. показали, что активация провоспалительных сигнальных путей в клетках уротелия человека приводит к блокированию интернализации E.coli и к последующей элиминации патогена из культуры (Song J, Bishop В, 2009). Также многими исследователями признается, что именно способность бактерий колонизировать эпителиальные клетки является критическим инициирующим событием в развитии инфекции. Поэтому можно предположить, что сильная активация NF-kB в эпителиальном слое мочевого пузыря лигандомТ1 5 может иметь важное значение для развития защитных иммунных реакций в данном органе.
Поскольку NF-kB приводит к индукции экспрессии широкого спектра провоспалительных молекул, мы предположили, что у животных, которым вводили агонисты разных TLR, будет наблюдаться различный профиль экспрессии генов в мочевом пузыре. Исследование было проведено на двух типах животных: мышах линии Balb/c и макаках резус. Мышам линии BALB/c вводили лиганды TLR4 и 5, которые, согласно данным предыдущих экспериментов, вызывали наиболее сильную активацию NF-kB в мочевом пузыре. Макакам резус вводили лиганды TLR2,4,5. Методом микроэррей анализа оценивалось изменение экспрессии 30000 генов. В результате проведенного исследования, у обоих типов животных были отмечены сходные тенденции. В ответ на каждый лиганд TLR в мочевом пузыре наблюдался свой профиль экспрессии генов. При этом в ответ у обоих животных на флагеллин наблюдалосьувеличение мРНК цитокинов цитокинов (CCL2, CCL20, CCL7, CXCL1, CXCL10), антимикробных белков (LCN2, CAMP), костимулирующих молекул (CD40), ростовых факторов (AREG) и др. Мы подтвердили данные микроэррей анализа, проверив выборочно экспрессию 6 генов двумя независмыми методами - ОТ-ПЦР и иммуноблотингом.
На следующем этапе работы мы оценили изменение цитокинового и хемокинового статуса в мочевом пузыре мышей, которым вводили лиганды Толл-подобных рецепторов 2,4,5. Методом мультиплексного иммуноферментного анализа на магнитных частицах был проанализирована динамика изменения концентрации 23 цитокинов и хемокинов (ИЛ- 1а, ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9 ИЛ-10, ИЛ-12 (р40), ИЛ-12 (р70), ИЛ-13, ИЛ-17, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-у, МСР-1, МІР-la, MIP-lp, RANTES, ФНО-a) в мочевом пузыре. Измерения проводились, начиная с 1 часа и заканчивая 48 часами после введения лигандов (всего было взято 6 временных точек). Результаты эксперимента показали, что из 23 определяемых хемокинов и цитокинов изменялась экспрессия только двух: МСР-1 и КС. При этом максимальная концентрация обоих хемокинов наблюдалась через 1 час после введения лиганда TLR5.
Хемокины представляют собой семейство хемоаттрактантых цитокинов, которые играют важную роль в селективном рекрутировании иммунных клеток. МСР-1 (CCL2) является одним из ключевых хемокинов, которые регулируют миграцию и инфильтрацию моноцитов / макрофагов (Deshmane S., Kremlev S., 2009). Тогда как КС является хемоаттрактантом для нейтрофилов (Ritzman А, Hughes-Hanks J, 2010). Поэтому на следующем этапе работы мы проверили будет ли происходить миграция иммунных клеток в мочевой пузырь при подкожном введении лигандов TLR2,4,5. Результаты исследования показали, что в ответ на флагеллин и ЛПС через сутки после введения лигандов наблюдается повышение количества гранулоцитов в мочевом пузыре. При этом в ответ на флагеллин увеличенное количество нейтрофилов сохраняется до четвертого дня после введения лиганда TLR5.
Основываясь на вышеописанных данных, мы предположили, что подкожное введение флагеллина, инициируя развитие иммунных реакций в мочевом пузыре, повысит резистентность данного органа к бактериальным инфекциям. Для проверки данного предположения была выбрана модель на основе Escherichia coli. Данный патоген является наиболее частым возбудителем инфекций мочевого пузыря (до 85% случаев) (М. Hadjifrangiskou, A. Gu, 2012). Уропатогенные штаммы Е. coli имеют ряд особенностей, которые повышают их адаптацию к условиям мочевыводящего тракта.Важным фактором патогенности штаммов E.coli, вызывающих урологические заболевания, являются жгутики, которые обеспечивают продвижение бактерий вверх через уретру к мочевому пузырю (И. А. Жабченко, 2013). Возможно, поэтому распознавание основного компонента жгутиков - белка флагеллина инициирует развитие мощного иммунного ответа в мочевом пузыре. Результаты проведенных экспериментов показали, что введение флагеллина достоверно повышает резистентность организма к урологической инфекции, вызванной , coli.
