Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время эпидемиологическая ситуация по гриппу продолжает оставаться чрезвычайно напряженной во всем мире. Ежегодно регистрируются эпидемические вспышки сезонного гриппа, а также появляются новые потенциально пандемические штаммы вируса гриппа. Ежегодно вирусом гриппа инфицируются до 1 миллиарда человек, от 3 до 5 миллионов из них болеют в тяжелой форме, от 300 до 500 тысяч человек – с летальным исходом. Пандемии гриппа возникают с неопределенной периодичностью, наиболее значимая из них наблюдалась в 1918-1919 гг., которая унесла жизни 50-100 миллионов человек во всем мире [Lambert L.C., Fauci A.S., 2010].
В начале XXI века человечество вновь столкнулось со вспышкой гриппа, вызванной новым вирусом гриппа А субтипа H1N1, которой в июне 2009 года ВОЗ присвоила 6-ю, пандемическую, степень угрозы. К пандемиям приводит появление новых субтипов вируса гриппа, возникающих из-за постоянно происходящих в геноме возбудителя мутаций. Отсутствие иммунитета у людей к новым вариантам вируса гриппа приводит к высокому уровню заболеваемости гриппом и осложняет осуществление профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Вакцинация является самым действенным способом профилактики гриппозной инфекции [Lambert L.C., Fauci A.S., 2010, Nichol K.L., Treanor J.J., 2006]. Большие надежды возлагаются на разработку иммунобиологических препаратов нового поколения, основанных на рекомбинантных технологиях, неотъемлемой частью которых является использование современных сведений по молекулярной генетике вируса гриппа. Это позволяет преодолеть сложности при изготовлении вакцин из эпидемически актуальных штаммов, связанные, в том числе и с антигенной гиперизменчивостью вирусов гриппа [Lambert L.C., Fauci A.S., 2010].
Использование нанотехнологий и наноматериалов является одним из перспективных направлений науки и техники в XXI веке. Особенности поведения веществ в виде наночастиц (размером менее 100 нанометров) дают широкие возможности в целенаправленном получении материалов с новыми свойствами, в том числе с особыми иммунобиологическими характеристиками.
В частности, использование биологических наноструктур на основе рекомбинантных вирусных частиц открывает большие перспективы доставки генетической информации в эукариотические клетки [Тутыхина И.Л. и др., 2009]. В настоящее время для медицинского применения ведутся разработки большого числа генно-терапевтических препаратов и вакцин для генетической иммунизации. Поэтому применение рекомбинантных вирусов при конструировании наноструктур для последующего применения в генной терапии и генетической иммунизации является актуальным направлением медико-биологической науки [Singh P., Gonzalez M.J., 2006].
Генетическая иммунизация основана на введении генетического материала в клетки организма и экспрессии в них генов целевых белков патогена. В результате полученные антигены соответствующих патогенов распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа [Карпов А.П., Тутыхина И.Л., 2007, Knoblich H.V., Sommer S.E., Jackwood D.J., 2000]. Это дает генетическим вакцинам ряд преимуществ по сравнению с традиционными способами иммунизации. Во-первых, отпадает необходимость в получении и очистке антигенов, а значит в работе непосредственно с патогенами. Во-вторых, иммуногенность дозы генетической вакцины по сравнению с традиционной вакциной чаще выше вследствие активной и продолжительной наработки антигена самим организмом. В – третьих, экспрессия антигенов непосредственно в клетках организма позволяет сохранить их нативную структуру и, следовательно, точнее представлять антигенные эпитопы патогена иммунной системе «хозяина». В – четвертых, генетические вакцины безопасны, векторы не реверсируют в патогенную форму, так как направленно лишены соответствующих участков генома. Кроме того, применение различных векторов на основе рекомбинантных вирусов, благодаря присутствию в них молекулярных патоген-ассоциированных структур, индуцирующих врожденный иммунитет, может оказывать дополнительное иммуностимулирующее действие.
В ходе научных поисков в представленной работе было выяснено, что для получения препаратов, предназначенных для людей, в качестве векторов наиболее оптимально использовать аденовирусы человека, эффективно проникающие в человеческие клетки. На сегодняшний момент наиболее изученным и часто используемым генетическим вектором являются рекомбинантные аденовирусные наночастицы на основе аденовируса человека пятого серотипа (РАВН-Ад5). Вакцины на основе РАВН-Ад5 имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, используемые для создания вакцин, РАВН-Ад5 являются репликативно-дефектными и безопасными. Безопасность РАВН-Ад5 на основе аденовирусов человека пятого серотипа с делетированными Е1 и Е3 областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе [Chia W.K., Wang W.W., 2011, Van Kampen K.R., Shi Z., 2005]. Во-вторых, применение РАВН-Ад5 позволяет проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцировать образование мукозального иммунного ответа, что немаловажно при вакцинации против патогенов, инфицирующих слизистые оболочки. В-третьих, разработаны быстрые и гибкие технологии получения РАВН-Ад5, позволяющие реализовать масштабное производство различных кандидатных вакцин на основе РАВН-Ад5 на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают РАВН-Ад5 хорошей технологической платформой для создания вакцин против гриппа, вызванного любыми субтипами вируса гриппа.
Важной частью при разработке вакцинных препаратов является подбор возможных адъювантов, наиболее современными из которых являются молекулярные адъюванты. Способность таких адъювантов повышать иммуногенность вакцинного антигена реализуется через взаимодействие с паттерн-распознающими рецепторами, активация которых приводит к дополнительной стимуляции иммунных реакций. Использование таких молекулярных адъювантов позволяет добиться не только направленной индукции тех иммунных реакций, которые необходимы для формирования максимально результативной защиты организма против того или иного патогена, но и максимально снизить возможные побочные эффекты, которые могут привносить адъюванты. Поэтому актуальным направлением исследований при разработке современных вакцин является подбор молекулярных адъювантов, что также является частью данной диссертационной работы.
Интерес научного сообщества к проблемам гриппа значителен, продолжаются активные поиски надёжных и безопасных иммунобиологических средств защиты населения во многих странах, в том числе и в России.
Данная диссертационная работа, посвященная изучению иммунобиологических свойств РАВН, показателей эффективности и безопасности разработанных кандидатных вакцин, раскрывает новые перспективы в борьбе с гриппом. Использование РАВН для создания вакцин против гриппа является актуальным и представляет самостоятельный научный и практический интерес.
Цели и задачи исследования.
Цель работы: разработка, изучение иммунобиологических свойств и оценка безопасности новых противогриппозных вакцин, основанных на универсальной технологической платформе рекомбинантных аденовирусных наноструктур (РАВН).
В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:
1. Сконструировать рекомбинантные аденовирусные наночастицы (РАВН) на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующие гены антигенов вирусов гриппа человека и птиц.
2. Оценить иммуногенность, активацию клеточного иммунного ответа, а также протективные свойства сконструированных РАВН, экспрессирующих гены антигенов вируса гриппа.
3. Определить возможность индукции перекрестного иммунного ответа, при введении РАВН, экспрессирующей ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H5N1 и субтипа H5N2 .
4. Изучить механизм и степень влияния нового молекулярного адъюванта на иммуногенность РАВН-Ад5.
5. Оценить возможность разработки универсальной противогриппозной вакцины на основе РАВН-Ад5.
6. Разработать технологию получения вакцин на основе РАВН – Ад5 с помощью биореакторов волнового типа.
7. Провести доклинические исследования эффективности и безопасности кандидатной вакцины против гриппа птиц на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих гены гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H5N2.
8. Провести доклинические исследования эффективности и безопасности кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины против сезонного гриппа на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих гемагглютинины (далее НА) вируса гриппа А субтипов H1N1, H3N2 и вируса гриппа B, и содержащей новый молекулярный адъювант.
Научная новизна.
Получены оригинальные РАВН на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующие гены НА следующих вирусов гриппа: вируса гриппа А птиц H5N2 (РАВН-Ад5-HA5-2), вируса гриппа А птиц H5N1 (РАВН-Ад5-HA5-1), вируса гриппа A человека H1N1 (РАВН-Ад5-HA1-1); вируса гриппа A человека H3N2 (РАВН-Ад5-HA3-2), вируса гриппа В (РАВН-Ад5-HAВ), а также конструкция РАВН-Ад5-M4-F1, экспрессирующая ген фьюжн-белка, состоящего из четырех эктодоменов М2-белка вируса гриппа А и флагеллина Salmonella enterica (лиганда для Толл-подобного рецептора 5).
Впервые показана индукция перекрестного гуморального иммунитета к вирусу гриппа А птиц H5N2 при иммунизации мышей РАВН-Ад5, несущими ген НА вируса гриппа А птиц H5N1. Показана длительная (24 недели) перекрестная защита животных, иммунизированных РАВН-Ад5-НА5-1, против летальной дозы вируса гриппа А птиц H5N2 (50ЛД50).
Впервые показана индукция гетеросубтипического иммунного ответа к вирусам гриппа А субтипов H1N1 и H2N3 при вакцинации лабораторных мышей РАВН-Ад5-HA5-2.
Впервые показана способность кислого пептидогликана, растительного происхождения с молекулярной массой 1000–40000 кДа, вызывать активацию Толл-подобного рецептора 4 (TLR4) врожденного иммунитета в условиях in vitro. Данный препарат усиливает иммуногенность РАВН-Ад5, что позволяет использовать его в качестве молекулярного адъюванта для производства противогриппозных вакцин на основе РАВН.
Впервые показана возможность создания универсальной противогриппозной вакцины на основе РАВН-Ад5, несущей фъюжн - белок, состоящий из четырех эктодоменов М2-белка вируса гриппа и лиганда для Толл-подобного рецептора 5 - флагеллина Salmonella enterica (РАВН-Ад5-M4-F1), которая обеспечивала протекцию мышей от заражения летальной дозой вируса гриппа А субтипов H5N2, H2N3, H1N1.
Впервые разработана кандидатная трехвалентная противогриппозная вакцина против сезонного гриппа на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих HA вируса гриппа А субтипов H1N1, H3N2, вируса гриппа B и содержащая молекулярный адъювант. В ходе доклинических исследований установлена её безопасность и эффективность.
Практическая значимость.
Полученные результаты исследований показывают, что РАВН-Ад5 могут служить универсальной технологической платформой для быстрого создания кандидатных противогриппозных вакцин, а предложенная технология – для их масштабного производства, что отвечает задачам здравоохранения РФ в отношении эпидемиологического благополучия населения по гриппу и целям биобезопасности страны.
Разработан лабораторный регламент получения активного компонента (РАВН-Ад5-HA5-2) кандидатной вакцины для специфической профилактики гриппа птиц у людей на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц (утвержден директором ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).
Отдельные результаты работы включены в методические рекомендации и указания, утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко: MP 1.2.2566-09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo», МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах», МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека», МР 1.2.2639-10 «Использование методов контроля количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии», МУ 1.2.2520-09 «Токсико-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов», МУ 1.2.2636-10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов», МУ 1.2.2745-10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных», МУ 1.2.2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных», МУ 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза», МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патенты Российской Федерации 2326942 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии», 2326943 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1», «», 2444570 «Способ получения рекомбинантной вакцины», 2012107028 (заявка) «Рекомбинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека».
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Четвертой международной конференции из серии Наука и бизнес «Нанобио- и другие новые перспективные биотехнологии» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), 9-м международном симпозиуме, посвященном аденовирусам (Стамбул, Турция, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Итоговой конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» (Москва, 2009), Международной конференции Koch Metschnikow Forum (Марбург, Германия, 2010), Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011).
Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела медицинской микробиологии, отдела иммунологии ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. 01 ноября 2011 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 научных работ, из них 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 290 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (236 источников, из которых 10 отечественных и 226 иностранных). Работа содержит 50 таблиц и 57 рисунков.
