Введение к работе
Актуальность темы
Заболеваемость меланомой в последние десятилетия характеризуется неуклонным ростом. На момент обращения до 40% больных имеют диссеминированный процесс, требующий применения химиотерапии, после которой 5-летняя выживаемость не превышает 5%. При генерализованных формах меланомы основным методом лечения является лекарственный с использованием химио- и иммунотерапии. Среди различных средств и методов имммунотерапии меланомы клиническое применение нашли препараты -2b-интерферона. Эффективность консервативного лечения достигает 50%, однако улучшения общей выживаемости достичь не удается. Иммунотерапия применяется при иммуногенных видах опухолей (меланоме, раке почки, немелкоклеточном раке легкого), способных в некоторых случаях к спонтанной регрессии. Предполагают, что механизм спонтанной регрессии связан с активацией эффекторов иммунной системы в частности, Т-лимфоцитов, распознающих и убивающих опухолевые клетки, благодаря экспрессии на их поверхности опухолеассоциированных антигенов [., et al., 2011]. Перспективы развития иммунотерапии меланомы связывают с созданием новых селективных методов, основанных на достижениях молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Одним из таких методов является вакцинотерапия, включающая различные модификации клеточной технологии, среди которых лучшие терапевтические характеристики имеют генно-инженерные и дендритные вакцины. Главная цель иммунотерапии меланомы – увеличение у пациентов популяции CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки [Shanker А., et al., 2009]. Антигенный материал, используемый для создания таких вакцин, может быть в виде цельных опухолевых клеток (аллогенных или аутологичных) или специфических антигенов, РНК, протеинов или пептидных эпитопов, рестриктированных по первому или второму классу гистосовместимости [., et al., 2011]. В экспериментах и в клинике изучаются подходы, использующие аутологичные меланомные клетки, трансфицированные геном интерлейкина-12 (ИЛ-12), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и др. Вакцины на основе ауто- и аллогенных опухолевых клеток, модифицированных указанными генами, проходят клинические испытания [Soiffer R., et. al., 2003; Maio M., et. al., 2002]. Помимо изучения таких вакцин в монорежиме, как правило, в последние годы их комбинируют с адъювантами, которые представлены цитокинами или нагруженными дендритными клетками, инициирующими иммунный ответ презентацией антигенных эпитопов к Т-лимфоцитам [., et al., 2011]. Несмотря на многообразие иммунотерапевтических подходов, механизм действия вакцин связан с презентацией дендритными клетками опухолеассоциированных антигенов Т-клеткам пациента [Nencioni A., et al., 2004]. Чаще всего используется одна-две антигенные детерминанты c целью достичь монотаргетного контакта вакцины с мишенью, что важно, прежде всего, для уменьшения некоторых побочных эффектов. Однако по аналогии с цельноклеточными антибактериальными вакцинами более эффективное их применение определяет большее число присутствующих в них антигенов [Geier D., et. al., 2002].
Для лечения диссеминированной меланомы кожи монотаргетная стратегия создания вакцин пока себя не оправдывает в силу поликлональности опухоли, а также быстрой селекции клонов. Селекция является следствием не только скорости пролиферации в условиях васкулогенной мимикрии, но и влияния микроокружения. Профиль экспрессии опухолеассоциированных антигенов чрезвычайно разнообразен, что требует мультитаргетных контактов с эффекторами для запуска программы клеточной гибели. Для осуществления этого актуально создание коллекции культур клеток меланомы, презентирующих различные опухолеассоциированные антигены. Созданная Коллекция клеточных культур меланомы является источником вакцин, направленных на различные антигенные детерминанты и способных использовать максимальное число клеток-мишеней у разных пациентов на разных этапах роста и метастазирования опухоли. Таким образом, создание Коллекции клеточных линий, их последующая трансфекция, проведение доклинических и клинических исследований определяют стратегию разработки цельноклеточных вакцин, что является актуальным как решение важной проблемы иммунотерапии меланомы.
Цель исследования. Разработать стратегию создания цельноклеточных антимеланомных вакцин.
Задачи исследования.
-
Получить и охарактеризовать из опухолевого материала больных клеточные линии меланомы с экспрессией различных опухоль-ассоциированных антигенов.
-
На основе клеточных линий меланомы, трансфицированных генами
ГМ-КСФ и tag7, разработать новые цельноклеточные аутологичные и аллогенные вакцины.
-
Изучить основные доклинические характеристики новых вакцин.
-
Оценить безопасность применяемых вакцин у больных меланомой.
-
Для оценки специфической активности определить динамику иммунологических показателей в процессе вакцинотерапии.
-
На основе доклинического и клинического изучения сформулировать алгоритм стратегии создания новых цельноклеточных вакцин.
Научная новизна
Впервые в России из метастазов меланомы кожи человека от 68 пациентов, проходящих лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, получены и охарактеризованы по основным биологическим, иммунологическим, молекулярным и морфогенетическим параметрам 19 клеточных линий.
Получены и наработаны для доклинических и клинических испытаний оригинальные клеточные линии меланомы человека mel P и mel Kor, трансфицированные генами tag7 или ГМ-КСФ соответственно. Проведены доклинические исследования цельноклеточных геномодифицированные вакцин «Аллоген» (из клеточной линии mel Р/tag7) и «Мелавак» (из клеточной линии mel Kor/ГМ-КСФ), показавшие их безопасность. Обнаружена взаимосвязь между динамикой клеточного ответа – снижением числа натуральных киллерных Т-клеток (НКТ-клеток) и прогрессированием процесса. Анализ раково-тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов, подтвердивший неоднородность изученных линий клеток и вакцин, позволил установить корреляцию между интенсивностью экспрессии генов раковотестикулярных антигенов (РТА) и степени дедифференцировки клеток в полученных из метастазов клеточных линиях меланомы. На основе результатов доклинического и клинического изучения разработан алгоритм оптимизации создания новых цельноклеточных вакцин из культур опухолевых и дендритных клеток больных меланомой.
Научно-практическая значимость
Создана Коллекция культур клеток меланомы из 19 новых оригинальных клеточных линий – субстрат для создания новых цельноклеточных противомеланомных вакцин. 15 новых линий клеток меланомы защищены патентами РФ, 5 из которых вошли в 100 лучших изобретений РФ за 2009 г. На основе дендритных и меланомных клеток созданы 3 новые цельноклеточные геномодифицированные и нативные вакцины, предназначенные для лечения онкологических пациентов. Разработан иммунобиохимический мониторинг вакцинотерапии с использованием модифицированных вакцин. Результаты данной работы могут быть использованы как в области фундаментальных, так и прикладных исследований. Полученные данные способствуют углубленному пониманию биологии опухолевой клетки и ее механизмов взаимодействия с иммунной системой. Данные о фенотипе опухолевой клетки (разнородная экспрессия антигенов гистосовместимости, костимулирующих молекул) и информация на уровне генов и антигенов дополняют фундаментальную базу знаний, лежащих в основе конструирования новых вакцин и их оптимизации путем соответствующих модификаций.
Прикладное значение выполненной работы заключается в создании Коллекции полноценно охарактеризованных культур клеток, готовых к созданию на их основе цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Подтверждением прикладного характера исследований является разрешение МЗиСР РФ на проведение клинических исследований вакцин на основе дендритных и опухолевых клеток, трансфицированных генами tag-7 и ГМ-КСФ [№371-373 от 06.08.08; №282 от 218.06.10 и №286 от 21.06.10].
Основные положения, выносимые на защиту
создана Коллекция опухолевых клеточных линий меланомы с различной экспрессией антигенов;
созданы и охарактеризованы по основным доклиническим и клиническим показателям 4 новые цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («Аутологичная/tag-7», «Дендритная») и 2 аллогенные («Аллоген», «Мелавак»);
доклинические исследования по безопасности исследуемых вакцин показали их безвредность;
стратегия мониторинга клинического изучения цельноклеточных вакцин у больных меланомой направлена на контроль цитокиного профиля, НКТ-клеток и числа синтезирующих ИФН- мононуклеарных клеток периферической крови.
Апробация работы Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17–20 марта, 2002 г.; I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака», Москва, 18–20 июня, 2002 г.; European Society of gene therapy. 11th Annual Congress, Edinburg, UK, 14–17 November, 2003 г.; VIII Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 27–30 сентября, 2004 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 16-18 марта, 2005 г.; V Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний», Москва, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции, Москва, 21– 24 марта 2006 г.; 15 Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 22–26 мая, 2006 г.; 8th International Biological Therapy of Cancer, Dresden, 21–24 June, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Онкология сегодня Успехи и перспективы», Казань, 2006 г.; VI съезд онкологов и радиологов СНГ, Баку, 28 сентября–1 октября 2006 г.; Международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта, 2006 г.; 6th ISREC Conference on Cancer Research, Lausanne, Switzerland, 2006 г.; VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2007 г.; Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы онкологии», Элиста, 23–24 апреля, 2007 г.; 43d Annual Meeting, Chicago, June 1–5, 2007 г.; Европейской школе онкологии «Иммунология для онкологов», Москва, 31 марта– 01 апреля 2008 г.; 3-ем съезде токсикологов России, Москва, 2– 5 декабря, 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Опухоли кожи и мягких тканей», Санкт-Петербург, 2009 г.; Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2–4 июня 2009 г.; Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2009 г.; VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21– 22 апреля, 2009 г.; XIV Российском онкологическом конгрессе, Москва, 23–25 ноября, 2010 г.; Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы», Санкт-Петербург, 27–30 сентября, 2010 г.; Совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, отделения биотерапии НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 24 июня 2011 г.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных результатов, обсуждения, выводов, списка сокращений, списка литературы, включающего 40 отечественных и 326 зарубежных источников и приложения (Протоколы клинического изучения вакцин, разрешения на исследования). Материалы диссертации изложены на 260 страницах машинописного текста и иллюстрированы 74 таблицами и 41 рисунком.
