Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Общие сведения об ангиотензин-превращающем ферменте 7
1.1. Локализация и функции ангиотензин-превращающего фермента в организме 7
1.2. Структура гена ангиотензин-превращающего фермента 11
1.3. Первичная структура ангиотензин-превращающего фермента и
особенности углеводной компоненты фермента 12
1.4. Пространственная структура ангиотензин-превращающего фермента.. 16
1.4.1. Пространственная структура С-домена ангиотензин-превращающего фермента человека 17
1.4.2. Пространственные структуры комплексов С-домена ангиотензин-превращающего фермента с лизиноприлом, каптоприлом и эналаприлатом 21
1.4.3. Пространственные модели N-домена ангиотензин- превращающего фермента и комплекса N-домена с лизиноприлом . 25
1.4.4. Механизм функционирования активных центров ангиотензин- превращающего фермента 30
1.5. Каталитические свойства отдельных N- и С-доменов ангиотензин- превращающего фермента и доменов в составе соматического фермента 32
Глава 2 Активация ангиотензин-превращающего фермента хлорид-анионами . 36
2.1. Влияние хлорид-анионов на N- и С-домены ангиотензин- превращающего фермента 42
2.2. Аминокислоты, отвечающие за связывание хлорид-анионов в ангиотензин-превращающем ферменте 46
2.3. Хлорид-связывающие центры в С-домене и в гомологах ангиотензин- превращающего фермента 53
Экспериментальная часть
CLASS Глава 3 Материалы и методы исследования CLASS 56
3.1. Материалы 56
3.2. Методы исследования 58
3.2.1. Синтез аффинного сорбента 58
3.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента 59
3.2.3. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензин- превращающего фермента 60
3.2.4. Получение N-домена соматического ангиотензин-превращающего фермента 61
3.2.5. Определение концентрации и чистоты выделенных препаратов фермента 62
3.2.6. Обессоливание ангиотензин-превращающего фермента 62
3.2.7. Подготовка образцов к секвенированию 62
3.2.8. Кинетические измерения 63
3.2.9. Исследование структуры ангиотензин-превращающего фермента методами биоинформатики 65
Результаты и их обсуждение
Глава 4 Получение трех форм ангиотензин-превращающего фермента 68
4.1. Получение и характеристика соматического ангиотензин-превращающего фермента быка 68
4.2. Получение и характеристика тестикулярного ангиотензин-превращающего фермента быка 70
4.3. Получение N-домена ангиотензин-превращающего фермента быка 70
4.3.1. Каталитические характеристики N-домена ангиотензин-превращающего фермента 78
Глава 5 Влияние хлорид-анионов на кинетические характеристики ангиотензин-превращающего фермента 82
5.1. Влияние хлорид-анионов на кинетические параметры гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под действием С- и N-доменов ангиотензин- превращающего фермента 84
5.1.1. Определение влияния ионной силы раствора на активности С- и N-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка 90
5.1.2. Определение механизма действия хлорид-анионов в реакции гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под действием N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента 92
5.2. Влияние хлорид-анионов на кинетические параметры гидролиза Fa-Phe-Gly-Gly под действием С- и N-доменов ангиотензин- превращающего фермента 104
5.2.1. Определение механизма действия хлорид-анионов в реакции гидролиза Fa-Phe-Gly-Gly под действием N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента 107
5.3. Влияние хлорид-анионов на кинетические параметры гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под действием соматического ангиотензин- превращающего фермента и определение механизма действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых данной формой фермента 110
Глава 6 Построение моделей пространственных структур N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка 115
6.1. Сравнение аминокислотных последовательностей N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка и человека 115
6.2. Общие сведения о пространственных моделях N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка 119
6.2.1. Аминокислоты, отвечающие за связывание субстрата Cbz-Phe-His-Leu в N- и С-доменах ангиотензин- превращающего фермента быка 125
6.2.2. Пространственное расположение потенциальных центров связывания хлорид-анионов в моделях^- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка 131
6.2.3. Роль С12 в функционировании однодоменных форм ангиотензин- превращающего фермента быка 133
6.2.4. Оценка разницы в энергиях связывания хлорид-аниона С12 с N- и С-доменами ангиотензин-превращающего фермента 136
6.2.5. Роль С11 в функционировании однодоменных форм ангиотензин- превращающего фермента быка 142
Выводы 148
Список литературы 149
- Пространственная структура С-домена ангиотензин-превращающего фермента человека
- Хлорид-связывающие центры в С-домене и в гомологах ангиотензин- превращающего фермента
- Исследование структуры ангиотензин-превращающего фермента методами биоинформатики
- Каталитические характеристики N-домена ангиотензин-превращающего фермента
Введение к работе
Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, известный также как пептидил-дипептидаза А, ЕС 3.4.15.1), широко распространенный в организме человека и животных, является ключевым ферментом регуляции сосудистого тонуса. Огромный интерес к этому ферменту во всем мире связан с тем, что синтезированные ингибиторы АПФ оказались очень эффективными при терапии различных видов гипертонии, сердечно-сосудистой недостаточности и инфаркте миокарда. Ингибиторы АПФ стали лекарством номер 1 в кардиологии, и в настоящее время ежедневно более 200 млн. человек принимают их в качестве антигипертензивных препаратов. Кроме того, имеются сведения о положительном эффекте перорального введения ингибиторов АПФ при атеросклерозе и при инсулин-зависимом диабете.
С другой стороны, АПФ является привлекательным объектом исследования для биохимиков, поскольку сочетает в себе ряд уникальных свойств, таких как наличие двух гомологичных каталитически активных доменов с несколько различными свойствами в составе одной полипептидной цепи, существование в составе фермента специфического углевод-связывающего центра, активация фермента анионами.
В настоящее время остаются не выясненными вопросы о взаимодействии доменов в составе АПФ, о причинах существования отрицательной кооперативное активных центров фермента, о природе конформационных изменений в структуре молекулы при связывании лиганда, о механизме активации АПФ анионами, о механизме шеддинга АПФ с мембраны и т.д.
Особый интерес вызывает активация АПФ анионами. Активные центры, расположенные на разных доменах, обладают разным сродством к анионам. Кроме того, в зависимости от гидролизуемого субстрата, профили активации фермента анионами сильно различаются. В различных тканях организма концентрация хлорид-анионов различна, в связи, с чем в зависимости от локализации АПФ, может предпочтительно "работать" тот или иной домен фермента и может меняться круг гидролизуемых под действием АПФ субстратов. Это, в свою очередь, ставит вопрос о создании тканеспецифичных ингибиторов к отдельным доменам
АПФ. В 2003 году была расшифрована кристаллическая структура С-домена АПФ человека, продемонстрировавшая наличие двух центров связывания хлорид-анионов даже в однодоменной форме фермента. Все эти данные ставят вопрос о выявлении роли хлорид-анионов и описании механизма действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых АПФ. Однако, несмотря на несомненную актуальность исследования активации доменов АПФ данный вопрос остается практически неизученным.
Целью данной работы является комплексное исследование взаимодействия хлорид-анионов с однодоменными формами АПФ и двудоменным соматическим ферментом, что включает в себя изучение влияния хлорид-анионов на кинетику реакций, катализируемых различными формами АПФ, и структурное обоснование особенностей влияния хлорид-анионов на различные формы фермента. В качестве объекта исследования был выбран фермент быка.
Пространственная структура С-домена ангиотензин-превращающего фермента человека
Несмотря на то, что АПФ изучается уже давно, сведений о пространственной структуре соматического АПФ или его доменах не было в течение долгого времени. Сложность заключалась в том, что фермент не удавалось закристаллизовать из-за наличия большого числа олигосахаридов в составе фермента. Олигосахариды затрудняли кристаллизацию, т.к. создавали микрогетерогенность на поверхности белка, что препятствовало упорядоченной упаковке молекулы в кристаллическую решетку [77]. Лишь в 2003 году впервые были получены и опубликованы рентгеноструктурные данные по пространственной структуре одного из доменов АПФ (С-домена). Natesh с соавторами [78] удалось закристаллизовать укороченный вариант тестикулярного АПФ человека, tACEA36NJ (остатки с 37 по 625 тестикулярного фермента), обладающий такой же ферментативной активностью, как и нативный фермент [79]. tACEA36NJ представляет из себя тестикулярный АПФ, у которого отсутствуют: часть примембранного участка, трансмембранный участок, цитоплазматический домен и уникальная для этой формы фермента N-концевая область из 36 аминокислот, богатая О-гликанами. Фактически tACEA36NJ соответствует С-домену соматического АПФ. Кроме того, у tACEA36NJ в каждом сайте N-гликозилирования, вместо комплексных олигосахаридных цепей, сохраняется лишь высокоманнозный кор (Gln3Man7GlnNAc2), что лишает данный фермент гетерогенности, препятствующей кристаллизации [79]. То, что данный усеченный фермент являлся хорошим кандидатом для кристаллизации, было показано еще в 1997 году [57].
В настоящее время получены пространственные структуры tACEA36NJ человека и его комплексов с тремя ингибиторами (лизиноприлом, каптоприлом и эналаприлатом) [78, 80] (рис. 3). Структура tACEA36NJ (в дальнейшем - С-домен человека) имеет эллипсоидную форму, размеры которой 72х57х48А, с центральным каналом, простирающимся вглубь молекулы на 30А и разделяющим белок на два поддомена. Границы канала образованы спиралями а13, а14, а15, а17 и Р4 тяжем (рис. З, а). В верхней части молекулы фермента есть N-концевая крышка, образованная спиралями al, a2 и ссЗ, которая, по-видимому, ограничивает доступ в щель активного центра больших полипептидов. Вторичная структура С-домена человека в основном состоит из спиралей. Из 27 спиралей 20 представляют собой сс-спирали и 7 - это Зю-спирали. Единственная р-структура, включающая в себя 4% от всех аминокислот, состоит из шести относительно коротких тяжей, два из которых расположены вблизи активного центра. Предсказание вторичной структуры доменов АПФ быка и человека на основе их первичных структур [81], выполненное еще до получения кристаллов С-домена человека, показало, что домены АПФ представляют из себя белки, состоящие преимущественно из а-спиралей, что хорошо совпало с результатами, полученными вскоре для С-домена человека [78].
Ион цинка является необходимым для катализа компонентом АПФ. Как и ожидалось, этот ион, имеющий тетраэдрическое окружение, был обнаружен в активном центре С-домена [78] (рис. 3). Цинк-связывающая последовательность His-Glu-Xaa-Xaa-His, характерная для семейства глюцинкинов, находится в спирали а13. Остатки гистидина из этой последовательности являются двумя из четырех лигандами иона цинка [1, 82, 78] (рис. 3, б). Третьим цинк-координирующим лигандом является остаток Glu, входящий во вторую характеристическую последовательность Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Asp (рис. З, б). Этот остаток, расположенный на расстоянии 23 аминокислот от первой характеристической последовательности His-Glu-Xaa-Xaa-His, находится в спирали сс14 [78]. Четвертым лигандом иона цинка принято считать молекулу воды из растворителя, однако, в кристаллической структуре С-домена четвертым лигандом оказался ацетат-анион из кристаллизационной среды [78] (рис. 3, б). Помимо ацетат-аниона в структуре С-домена человека было обнаружено 504 молекулы воды [78]. При этом в кармане активного центра находится несколько молекул Н20. Все шесть центров гликозилирования расположены на поверхности молекулы фермента.
Хлорид-связывающие центры в С-домене и в гомологах ангиотензин- превращающего фермента
Ангиотензин-превращающий фермент-2 (АГТФ2) - гомолог АПФ, обнаруженный в организме человека [142, 143]. Хлорид-анионы влияют на активность АПФ2, причем так же, как и в случае АПФ, характер и величина влияния зависят от природы гидролизуемого субстрата [144, 145]. Однако, независимо от используемого субстрата, АПФ2 является менее чувствительным к присутствию хлорид-анионов нежели АПФ, т.е. по сравнению с АПФ, АПФ2 требуется большая концентрация хлорид-анионов для проявления максимальной активности. Кроме того, активность АПФ2 может вовсе ингибироваться хлорид-анионами, как это происходит при гидролизе ангиотензина II [144].
В кристаллической структуре свободного АПФ2, полученной с высоким разрешением, обнаружен только один хлорид-анион [89]. Данный хлорид, находящийся на расстоянии 2іА от иона цинка активного центра, по своему расположению похож на СП в С-домене АПФ человека. Основными остатками, координирующими данный хлорид-анион в АПФ2, являются Argl69, Thr477 и Lys481, т.е. среди аминокислот, составляющих данный центр связывания хлорид-анионов, при переходе от С-домена АПФ человека к АПФ2 наблюдается замена Argl065 на Lys481 (табл. 6). Можно было бы заключить, что консервативный для С-домена и АПФ2 остаток Arg762/169 (табл. 6) наиболее важен для связывания хлорид-анионов, однако мутант АПФ2, в котором Argl69 заменен на Gin, сохранял свою хлоридную зависимость [146], т.е. другие остатки в составе данного центра более важны для связывания хлорида [146].
В структуре АПФ2 не было обнаружено хлорид-аниона, соответствующего С12 С-домена АПФ человека, несмотря на то, что в АПФ2 сохраняются Arg514 и Туг207, соответствующие остаткам Argl098 и Туг800 С-домена АПФ, отвечающим за связывание хлорид-анионов в С12-связывающем центре (табл. 6). Причина отсутствия данного центра в АПФ2 заключается в замене других остатков, а именно Рго983 и Pro 1095, входящих в микроокружение С12 в С-АПФ, на Glu398 и Ser511 в АПФ2, что приводит к ликвидации данного центра у АПФ2 [89]. Интересно, что замена Arg514 в АПФ2 на Gin приводит к мутанту, который более чувствителен к хлорид-анионам, чем исходный фермент [146], но этому пока нет объяснения.
Не исключена возможность того, что в комплексе АПФ2 с ингибитором или субстратом может существовать второй хлорид-связывающий центр, не совпадающий с С12-связывающим центром С-домена АПФ [89]. Однако, низкое разрешение известной в настоящее время кристаллической структуры комплекса АПФ2 с ингибитором MLN-4760 не дает возможности различить молекулы воды и хлорид-анионы, поэтому из 13 молекул воды, обнаруженных в структуре комплекса АПФ2 с ингибитором, одна или более могут оказаться хлорид-анионами [89]. Но для ответа на этот вопрос требуется структура с лучшим разрешением.
Расшифрована кристаллическая структура еще одного гомолога АПФ -АпСЕ (фермент из Drosophila melanogaster) [97]. Гидролиз ангиотензина I и Hip-His-Leu под действием АпСЕ активировался хлорид-анионами [147, 148], хотя этот фермент, так же как АПФ2, менее чувствителен к хлорид-анионам, чем АПФ. В кристаллической структуре АпСЕ хлорид-анионы не были обнаружены вообще, что не согласуется с кинетическими данными. Сравнение области, где в структуре С-домена АПФ человека находится С12-связывающий центр, с соответствующей областью в структуре АпСЕ показывает отсутствие данного центра в молекуле АпСЕ. Замена Рго1095 в С-домене АПФ человека на Glu503 в АпСЕ (табл. 6) приводит к тому, что карбоксильная группа Glu занимает С12-связывающий центр [80]. Что касается другого СП-связывающего центра С-домена АПФ человека, то в АпСЕ сохраняется Arg, соответствующий Arg 1065 С-домена АПФ, a Arg762 и ТгрЮбІ С-домена АПФ заменены на Туг170 и Phe469 в АпСЕ (табл. 6). Замена Arg на Туг делает данный центр связывания в АпСЕ более похожим на С12-связывающий центр АПФ, а замена Тгр на Phe уменьшает сродство СГ к соответствующему центру в АпСЕ. Кроме того, в ближайшем окружении С11-связывающего центра при переходе от С-домена АПФ к АпСЕ наблюдаются замены остатков аланина и валина (А1а848 и Vail040 у АПФ) на остатки метионина (Met256 и Met488), что уменьшает размеры данного центра связывания хлоридов в АпСЕ [80]. Суммируя все вышесказанное можно заключить, что, если С11-связывающий центр в АпСЕ существует, то он будет иметь меньшее сродство к хлорид-анионам, чем соответствующий центр в С-домене АПФ [80]. Таким образом, сравнение хлорид-связывагащих центров С-домена АПФ человека и существующих и потенциальных центров связывания хлорид-анионов АПФ2 и АпСЕ, позволяет заключить, что оба центра связывания хлорид-анионов, обнаруженные в структуре С-домена АПФ человека, принимают участие в регулировании активности фермента, кроме того, не исключена возможность существования и других функционально важных центров связывания анионов.
Суммируя все вышесказанное можно заключить, что активация ангиотензин-превращающего фермента хлорид-анионами является одним из ключевых факторов, определяющих характер функционирования фермента. Но, несмотря на большой объем исследований, направленных на установление механизма действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых различными формами АПФ, до сих пор нет четкого представления об этом механизме. Наличие двух центров связывания хлорид-анионов даже в структуре однодоменного АПФ усложняет задачу определения механизма.
Исследование структуры ангиотензин-превращающего фермента методами биоинформатики
Выравнивание аминокислотных последовательностей С-домена АПФ человека [1] и N- и С-доменов АПФ быка [58] проводили с помощью программы Clustal-X [160] с использованием матрицы гомологии BLOSSUM30.
Структура С-домена АПФ человека (PDB: 108А) была использована для предсказания структур N- и С-доменов АПФ быка. Моделирование по гомологии, выполненное при помощи модуля Biopolymer программного комплекса Sybyl 6.9 [161], основывалось на описанном выше выравнивании. Методика построения пространственных моделей N- и С-доменов АПФ быка заключалась в следующем. Все аминокислотные остатки, не тождественные остаткам, находящимся в аналогичных положениях в шаблонном белке, были построены посредством замены боковых цепей. В случае наличия "вставок" в выравнивании, производился поиск по базе данных [162] наиболее подходящих для вставки петель основных цепей. При их выборе учитывались такие факторы, как взаимное расположение атомов основной цепи, наличие высокой гомологии со вставляемой последовательностью, отсутствие пространственных препятствий между петлей и остальной частью белка. Затем была исправлена геометрия тех аминокислотных остатков, боковые цепи которых накладывались друг на друга, и проведена полная оптимизация геометрии молекулы с использованием силового поля Tripos.
Для уточнения положения боковых цепей и петель в полученных моделях N-и С-доменов АПФ быка была проведена молекулярная динамика с помощью программы SANDER программного пакета AMBER 8 [163]. Для этого модели были помещены в куб с "виртуальной водой" (сплошная безграничная среда, диэлектрические и гидрофобные свойства которой соответствуют свойствам воды) и оптимизированы с использованием силового поля Cornell [164]. Затем в моделях проводилась молекулярная динамика с шагом 1 фс при постоянном давлении (1 атм.) в течение 15 пс. Процесс молекулярной динамики состоял из двух этапов: целью первого этапа было установление в системе термодинамического равновесия, для чего образцы медленно нагревали от 0К до заданной температуры 300К (10 пс), целью второго этапа было получение среднего значения энергии системы, достигшей термодинамического равновесия, при заданной температуре.
Корректность построенных моделей была оценена с помощью проверки стереохимических параметров моделей в программе PROCHECK [165].
Структуры комплексов N-и С-доменов АПФ быка с субстратом Cbz-Phe-His-Leu были смоделированы по той же методике, что и структуры свободных ферментов, с использованием структуры комплекса С-домена АПФ человека с лизиноприлом (PDB: 1086) в качестве шаблона. Геометрия лизиноприла в комплексе с С-доменом АПФ человека была взята за основу при определении геометрии Cbz-Phe-His-Leu в комплексах с доменами АПФ быка.
Изменение энергии связывания хлорид-аниона С12 с ферментом при замене Met в С-домене на Тф в N-домене было оценено с помощью программы SANDER программного пакета AMBER 8 [163]. В данном расчете был использован метод термодинамического интегрирования, позволяющий находить разницу в свободных энергиях начального и конечного состояний системы в соответствии с уравнением (3): і AAG = AG(Z = \)-AG(A = 0) = дУ/дХ/ Л ф/ідУ/дЛ 3 где Х=0 соответствует начальному состоянию системы, а Х=\ соответствует конечному состоянию системы. V-внутренняя энергия системы, со; - "вес" точки Xt в процессе перехода системы из начального состояния в конечное.
При оценке разницы в энергиях связывания хлорид-аниона С12 с доменами АПФ рассчитывалась разница в свободных энергиях при теоретической мутации Тф на Ala у N-домена и Met на Ala у С-домена. Все мутации проводили в два этапа. На первом этапе происходит постепенное уменьшение заряда до 0 у мутирующей части молекулы (на этом этапе рассчитывается вклад кулоновских взаимодействий). На втором этапе происходит пространственное преобразование разряженных атомов первоначальной аминокислоты (Тф для N-домена и Met для С-домена) в атомы конечной аминокислоты (Ala) (на этом этапе рассчитывался вклад Ван-дер-ваальсовых взаимодействий).
Моделирование "переключения " боковой цепи Lys490/10880 при связывании с ферментом субстрата. Поскольку применение молекулярной динамики для осуществления предполагаемого изменения конформации боковой цепи Lys490/10880 при связывании с ферментом субстрата могло потребовать слишком много времени, мы использовали процесс прямого моделирования данного конформационного изменения с помощью функции CONSTRAIN программного комплекса Sybyl 6.9 [161]. В качестве исходных были взяты модели комплексов N-и С-доменов АПФ с субстатом Cbz-Phe-His-Leu. Из этих моделей были удалены хлорид-анион (СП) и молекула субстрата. Для осуществления возможного конформационного перехода Lys490/10880, был введен дополнительный гармонический потенциал, имеющий минимум при расположении концевого атома азота боковой цепи Lys490/10880 и одного из атомов боковой цепи Тгр465/1063 на расстоянии 4А друг от друга, и имеющий силовую константу 20 ккал/моль-А. С этими условиями было проведено 200 шагов условной оптимизации геометрии. Далее силовая константа гармонического потенциала была изменена до 100 ккал/моль-А, и с этими условиями было проведено 100 шагов оптимизации геометрии. После этого потенциал снимали, и вели оптимизацию геометрии без ограничения.
Каталитические характеристики N-домена ангиотензин-превращающего фермента
Мы определили кинетические параметры гидролиза нескольких синтетических трипептидных субстратов под действием полноразмерного АПФ, у которого в результате термоденатурации был инактивирован С-домен, а также под действием N-домена, полученного в результате обработки трипсином термоденатурированного соматического фермента. Определенные нами кинетические параметры гидролиза выбранных субстратов представлены в табл. 7 вместе с соответствующими данными для соматического и тестикулярного АПФ быка, а также для N-домена, полученного ограниченным протеолизом соматического АПФ, частично денатурированного в водном растворе аммиака. Оказалось, что кинетические параметры гидролиза ряда субстратов под действием обеих полученных нами форм фермента отличались от кинетических параметров гидролиза этих субстратов под действием соматической и тестикулярной форм АПФ, но были близки к параметрам, полученным ранее для N-домена АПФ (табл.7).
В литературе есть данные о том, что N-домен, полученный в результате денатурации АПФ человека в водном растворе аммиака, по своей субстратной специфичности соответствует кишечной форме фермента, которая, в свою очередь, совпадает с субстратной специфичностью рекомбинантного соматического фермента, у которого за счет мутаций в активном центре неактивен С-домен [45]. На основании этих и наших данных (табл. 7) можно утверждать, что воздействие повышенной температуры (55, 1 час) не оказывает негативного влияния на конформацию активного центра, расположенного на N-домене АПФ.
Итак, частичная денатурация соматического АПФ под действием рН или температуры приводит к получению N-домена со стабильными кинетическими характеристиками.
Мы сравнили влияние хлорид-анионов на активность препаратов N-домена, полученных обоими методами (рис. 16). Оказалось, что на активность обоих препаратов N-домена СГ-анионы влияют практически одинаково.Таким образом, для получения каталитически активного N-домена АПФ с помощью протеолиза частично денатурированного соматического АПФ, возможно использование как денатурации в водном растворе аммиака, рН 10,8, так и термоденатурации при 55С, рН 6,5. При этом используемое в обеих методиках денатурирующее воздействие и дальнейший протеолиз не затрагивают каталитический центр и области связывания хлорид-анионов в N-домене. Вполне вероятно, что периферические области в структурах полученных нами N-доменов АПФ все-таки отличаются от соответствующих областей в N-домене в составе исходного соматического фермента, но эти отличия не важны для решения задач, поставленных в нашей работе.
Для исследования влияния хлорид-анионов на активность АПФ быка нами был выбран субстрат Cbz-Phe-His-Leu, являющийся С-концевым аналогом основного физиологического субстрата АПФ - ангиотензина I. Все эксперименты проводили при фиксированном значении рН 7,5, соответствующем физиологическому значению. Пилотные эксперименты, проведенные нами с соматическим ферментом, показали, что на форму зависимости ферментативной активности соматического АПФ от концентрации хлорид-анионов оказывает влияние концентрация субстрата (рис. 17). Так, при низких концентрациях субстрата активность фермента сначала увеличивалась с увеличением концентрации хлорид-анионов, а затем, достигнув максимального значения, переставала изменяться. При высоких концентрациях субстрата активность соматического АПФ сначала увеличивалась с ростом [КС1], а затем, пройдя через максимум, уменьшалась (рис. 17). Чем выше была концентрация субстрата, тем сильнее было ингибирование ферментативной активности АПФ в области высоких концентраций КС1, и тем меньше была концентрация хлорид-анионов, при которой фермент достигал максимальной активности (рис. 17). Проведенный нами анализ полученных кинетических данных по зависимости активности АПФ от концентрации КС1 показал, что на ферментативную активность соматического АПФ быка оказывает влияние связывание более чем одного хлорид-аниона. Кроме того, полученные закономерности не описываются влиянием двух активирующих хлорид-анионов и требуется включение в схему ингибирующего хлорид-аниона. Из литературных данных известно [108, 104], что оба домена активируются хлорид-анионами, поэтому возникает вопрос о природе ингибирующего действия хлорид-анионов. Мы предположили, что полученные зависимости можно объяснить наличием в одном или двух доменах соматического АПФ двух или более хлорид-анионов, влияющих на каталитические свойства фермента.
![Сравнительная оценка терапии ингибитором ангиотензин-превращающего фермента квинаприлом, антагонистом рецепторов ангиотензина II валсартаном и их комбинацией у пациентов с хронической сердечной недостаточностью [Электронный ресурс]](/i/i/4599/192104.png "Сравнительная оценка терапии ингибитором ангиотензин-превращающего фермента квинаприлом, антагонистом рецепторов ангиотензина II валсартаном и их комбинацией у пациентов с хронической сердечной недостаточностью [Электронный ресурс] Насонова Светлана Николаевна")