Введение к работе
Актуальность темы. Ангиотензин превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) — физиологически важная цинк-зависимая пептидаза, участвующая во многих процессах в организме млекопитающих. С нарушением функций этого фермента связаны такие серьезные заболевания, как атеросклероз сосудов, сахарный диабет, бесплодие, сердечная недостаточность и др. В связи с этим новое знание свойств и особенностей функционирования этого фермента может иметь терапевтическое будущее.
Несмотря на то, что изучение АПФ длится более полувека, до сих пор остается невыясненным вопрос о причинах столь сложной организации этого фермента: полноразмерный (соматический) АПФ представляет собой тандем из двух гомологичных С- и N-доменов (гомология составляет около 60%), свёрнутых из единой полипептидной цепи. Каждый из доменов содержит активный центр. Несмотря на то, что домены характеризуются разными физико-химическими свойствами (стабильностью, степенью гликозилирования и т.д.), они взаимодействуют с одним и тем же кругом субстратов и ингибиторов (но с разной специфичностью). До недавнего времени не было единого мнения о характере совместного функционирования активных центров соматического АПФ. Довольно долго считалось, что активные центры функционируют независимо, однако при этом в литературе существовали данные, не соответствующие этой схеме. Предпосылками данной работы явились исследования соматического АПФ быка, в которых было показано, что длина (структура) субстрата определяет кинетический характер совместного функционирования активных центров фермента. В предельных случаях, при гидролизе нона- и декапептидных субстратов активные центры АПФ быка функционируют как два полностью независимых фермента, а при гидролизе трипептидных субстратов наблюдается взаимозависимое функционирование активных центров - в каждый момент времени функционирует какой-либо один из двух.
Аминокислотная последовательность АПФ человека, более значимого с точки зрения здоровья человека, отличается от последовательности АПФ быка, а, следовательно, эти ферменты несколько отличаются и пространственной организацией молекулы, что влечет за собой отличия в субстратной специфичности, способности взаимодействовать с ингибиторами и, возможно, в механизме совместного действия активных центров в составе соматического АПФ. Исследование такого рода особенно важно в связи с тем, что природными субстратами АПФ являются пептиды самой разной структуры, среди которых есть как тетра-, пентапептиды (фактор гемопоэза N-Ac-Ser-Asp-Lys-Pro и энкефалины), так и молекулы с более протяженной структурой. В частности, с гидролизом нонапептида брадикинина и декапептида ангиотензина I связана основная функция АПФ — поддержание уровня кровяного давления млекопитающих. Кроме того, поскольку в
настоящее время лекарства на основе ингибиторов АПФ являются широко распространенным средством при лечении болезней сердца, представляется важным исследование эффективности подавления активности соматического АПФ ингибиторами различной структуры в реакциях гидролиза субстратов различной длины.
Целью работы явилось выявление общего механизма совместного функционирования активных центров АПФ при взаимодействии с лигандами (субстратами и ингибиторами) различной длины/структуры и попытка с помощью исследования однодоменной формы фермента объяснения возможных причин, вызывающих отрицательную кооперативность двух активных центров фермента
Научная новизна и практическая значимость. Получены новые данные по субстратной и ингибиторной специфичности однодоменных форм и полноразмерной формы АПФ человека в условиях, близких к физиологическим (рН 7,5 и концентрации СГ-ионов 150 мМ). Сравнение полученных данных с имеющимися в литературе данными по субстратной и ингибиторной специфичности активных центров АПФ быка продемонстрировало, что ферменты человека и быка проявляют видовую специфичность.
Показано, что зависимость формально-кинетического механизма
функционирования активных центров в составе соматического АПФ от длины лиганда (субстрата или ингибитора) является общим свойством для ферментов быка и человека. Выявлена строгая отрицательная кооперативность активных центров двудоменного АПФ человека при связывании «коротких» лигандов, что означает, что в каждый момент времени функционирует какой-либо один из двух активных центров. При взаимодействии фермента с «длинными» лигандами, по длине соответствующими девяти-, десятичленным пептидам активные центры АПФ функционируют независимо. Более того, ингибирование активности двудоменного АПФ при гидролизе «короткого» и «длинного» субстратов осуществляется по разным механизмам. Так, например, «короткий» ингибитор оказывается более эффективен в случае подавления реакции гидролиза «короткого» субстрата, чем при подавлении реакции гидролиза «длинного» субстрата. Эти данные позволяют заключить, что оценка эффективности новых ингибиторов - потенциальных лекарственных средств - зависит от субстрата, по которому определяется остаточная активность соматического АПФ. Не исключено, что при тестировании в лабораториях новых ингибиторов с использованием трипептидных субстратов получаемая картина не соответствует реальной ситуации ингибирования активности АПФ при гидролизе брадикинина и ангиотензина I.
Обнаружено влияние связывания лиганда с N-доменом АПФ на эффективность связывания с ним специфичных моноклональных антител. Путбм определения
локализации эпитопов связывания этих моноклональных антител и анализа структуры N-домена показано, что однодоменный фермент при связывании лиганда в его активном центре претерпевает конформационные перестройки, т.н. "hinge-bending movement". На основании этих данных, а также на основании кинетического механизма функционирования активных центров в составе двудоменного АПФ впервые сделано предположение о совместном функционировании активных центров в составе соматического АПФ.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на: International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications" (Moscow, 2002), Конференция молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В. Березина «Инженерная энзимология» (Москва 2003), International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals & Applications" (St. Petersburg, 2005), IV Meeting of International Society of Proteolysis (Quebec, 2005) и Moscow Inertnational Conference «Biotechnology and Medicine» (Moscow 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объём н структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Главы І-Ш), экспериментальной части (Глава IV), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (Главы V-VIII), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на/^/ страницах, содержит '-*/ таблицы и рисунков. Список литературы включает '"^ссылок.
![Сравнительная оценка терапии ингибитором ангиотензин-превращающего фермента квинаприлом, антагонистом рецепторов ангиотензина II валсартаном и их комбинацией у пациентов с хронической сердечной недостаточностью [Электронный ресурс]](/i/i/4599/192104.png "Сравнительная оценка терапии ингибитором ангиотензин-превращающего фермента квинаприлом, антагонистом рецепторов ангиотензина II валсартаном и их комбинацией у пациентов с хронической сердечной недостаточностью [Электронный ресурс] Насонова Светлана Николаевна")