Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время существует большое количество проблем, связанных с лечением заболеваний, вызываемых одними из наиболее опасных грам-положительных микроорганизмов - стрептококками и стафилококками.
Во многих странах мира регистрируются случаи тяжелых заболеваний, вызываемых стрептококками, таких как ангина, импетиго, рожа, скарлатина, ревматизм, нефрит, эндокардит, и их количество увеличивается с каждым годом. В Англии и Уэльсе в 1994 -1997 годах зарегистрировано 1913 случаев тяжелых инфекций, вызванных стрептококками группы А. При этом 508 заболевших (27%) погибли. В США ежегодно регистрируют 10-15 тысяч случаев инвазивных стрептококковых инфекций. За последние годы также отмечен рост заболеваемости ревматизмом, зарегистрированы даже вспышки этого заболевания: в Индии заболеваемость ревматизмом составляет 11 человек на 1000 человек населения. В России ежегодно болезни стрептококковой этиологии поражают 2-3 млн. человек, 10% случаев имеет летальный исход.
Стафилококковые инфекции (фурункулы, ячмени, пиодермии, ангины, пневмонии, маститы, флебиты, менингиты, энодкардиты и т. д.) входят в число самых распространенных и наиболее тяжелых внутрибольничных инфекций, в том числе обусловленных образованием биопленок стафилококков на различных поверхностях. Например, в США регистрируется более ста тысяч случаев инфицирования стафилококком в год, что обходится экономике этой страны в 4.5 - 5.7 млрд. долларов ежегодно. В Ирландии количество заболеваний, вызываемых стафилококками, в 1999 году составляло 39% от общего числа заболеваний, а в 2002 году - 45%. В России заболеваемость инфекциями, вызываемыми стафилококками, составляет 10 - 15 человек на 1000 человек населения. Среди пациентов, зараженных метициллин-устойчивыми штаммами, смертность составляет 31%.
Традиционные методы лечения стрептококковых и стафилококковых инфекций предполагают активное использование антибиотиков, однако широкое применение антибиотиков приводит к стремительному росту числа новых бактериальных штаммов, устойчивых к ним. Так, в настоящее время 29.7% штаммов Streptococcus pyogenes устойчивы к эритромицину. Почти 90% штаммов золотистого стафилококка резистентно к пенициллину и другим антибиотикам пенициллинового ряда.
Бактериофаги - вирусы бактерий, продуцирующие в процессе жизненного цикла ферменты, которые способны разрушать бактериальные клеточные стенки и могут рассматриваться в качестве серьезной альтернативы антибиотикам. В литературе эти ферменты получили название «лизины» или «лизоцимы».
В данной работе будут рассматриваться ферменты, осуществляющие разрушение (лизис) клеточной стенки за счет гидролиза химических связей в пептидогликане - основном компоненте клеточных стенок грам-положительных бактерий. Фермент PlyC способен эффективно лизировать клетки стрептококков групп А, С и Е, а фермент LysK - клетки Staphylococcus aureus, в том числе штаммы, резистентные к метициллину и ванкомицину.
Основной проблемой, ограничивающей использование в медицине рассматриваемых ферментов, является недостаток сведений о них как о биокатализаторах, их низкая стабильность при хранении и отсутствие данных об их кинетических характеристиках и механизмах инактивации.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение физико-химических свойств и разработка подходов к стабилизации бактериолитических ферментов PlyC и LysK для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инфекций, вызываемых стрептококком групп А, С и Е и золотистым стафилококком.
В соответствии с целью в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
Исследование кинетических характеристик и параметров инактивации ферментов LysK и PlyC.
Дискриминация механизмов инактивации ферментов LysK и PlyC.
3. Выбор стабилизирующих агентов из соединений разных классов и методов
стабилизации ферментов LysK и PlyC с учетом особенностей их использования в медицине и
ветеринарии:
-учет механизмов инактивации;
-простота и дешевизна методов;
-соответствие требованиям фармакологии;
-удобная форма использования (раствор, порошок).
4. Оценка эффективности функционирования ферментов LysK и PlyC и их
стабилизированных препаратов на культурах живых клеток.
Научная новизна.
1. Впервые изучено влияние рН, температуры и солевого состава среды на
каталитическую активность ферментов LysK, лизирующего клетки Staphylococcus aureus и
PlyC, лизирующего клетки Streptococcus pyogenes.
Впервые идентифицированы механизмы термоинактивации ферментов LysK и PlyC.
Для LysK показано возможное присутствие в молекуле фермента остатка гистидина, ответственного за катализ, и катиона кальция, который играет структурную роль.
4. Для ферментов LysK и PlyC впервые предложены простые и эффективные способы
стабилизации, при использовании которых они сохраняют 100% активности в течение 2-4
месяцев инкубации при температуре хранения (22С).
5. Показана воспроизводимость результатов функционирования фермента PlyC на
культурах «убитых» и «живых» бактериальных клеток Streptococcus pyogenes.
Практическая значимость работы. Стабильные препараты бактериолитических ферментов LysK и PlyC имеют перспективы для применения в качестве средств гигиены полости рта (лечение ангин, тонзиллитов), средств для внутреннего введения на ранних и поздних стадиях развития инфекций, средств для лечения заболеваний кожных покровов (рожа, фурункулы, нагноения).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International student's forum (Omaha, Nebraska, USA, 2008), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, Россия, 2008), XVIth International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland, 2008), Международный форум по нанотехнологиям (Москва, Россия, 2008), V Международный Московский биотехнологический конгресс «Биотехнология 2009: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2009), I Международная летняя научная школа «Нано 2009. Наноматериалы и нанотехнологии в биологии и медицине» (Москва, Россия, 2009), конференция «Biocatalysis 2009: Fundamentals and Applications» (Arkhangelsk, Russia, 2009), Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, Россия, 2009).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 7 тезисов докладов конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 162 страницы печатного текста, 56 рисунков, 15 таблиц и 160 ссылок.
Список использованных в работе сокращений. S. pyogenes - Streptococcus pyogenes, St. aureus - Staphylococcus aureus, pi - изоэлектрическая точка, SDS - додецилсульфат натрия, ті/2 - время полуинактивации фермента, КД - круговой дихроизм, ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, кин - кинетическая константа скорости инактивации, S - сведберг, BS - бис-сульфосукцинимидилсуберат натрия, А/Ао - остаточная активность фермента, НПАВ - неионогенное поверхностно-активное вещество, ПБ -полибрен (ионен на основе тетраметилгексаметилендиамина и триметилендибромида).
