Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА.1. Биологическая роль нептерина и его участие в клеточном иммунитете 10
1.1 Неоптерин, его биологические функции 10
1.1.1 Метаболизм неоптерина 12
1.1.2 Возможные источники неоптерина 15
1.1.3 Факторы, влияющие на продукцию неоптерина 16
1.1.4 Влияние птеринов на собственную продукцию 18
1.1.5 Известные биологические функции неоптерина и его восстановленных форм 19
1.2 Существующие методы анализа неоптерина. Обзор хроматогра-фического анализа ВЭЖХ неоптерина в биологических жидкостях 24
1.3 Роль а-ФНО и у-ИФ в продукции неоптерина 27
1.4 Раково-эмбриональный антиген как индикатор опухолевого процесса 30
1.5 Некоторые сдвиги комплементарного статуса онкологических больных 32
ГЛАВА II. Материалы и методы 36
2.1 Клиническая характеристика обследованных групп 36
2.2 ВЭЖХ анализ неоптерина в сыворотке с УФ и флюориметрической детекцией 41
2.3 Методы определения а-ФНО , у-ИФ и раково-эмбрионального антигена 42
2.4 Методы изучения комплементарного статуса 42
2.4.1 Определение активности комплемента в классическом варианте её инициации 42
2.4.2 Методы определения компонентов комплемента: С1-ингибитора, СЗа, С5а и фактора Н 44
2.5 Методика определения молекул средней массы в сыворотке крови... 44
2.6 Оборудование и аппаратура 45
2.7 Методы статистической обработки результатов 45
ГЛАВА III. Разработка и оптимизация ВЭЖХ метода определения неоптерина 46
ГЛАВА IV. Величины неоптерина и некоторых иммунологических параметров у раковых больных 62
4.1 Закономерности изменений уровня неоптерина и содержания цитокинов у пациентов со злокачественными новообразованиями 62
4.2. Закономерности изменения комплементарного статуса, содержания раково-эмбрионального антигена и молекул средней массы у пациентов со злокачественными опухолями 69
Заключение 77
Выводы 87
Список литературы 89
- Неоптерин, его биологические функции
- Существующие методы анализа неоптерина. Обзор хроматогра-фического анализа ВЭЖХ неоптерина в биологических жидкостях
- Клиническая характеристика обследованных групп
- Закономерности изменений уровня неоптерина и содержания цитокинов у пациентов со злокачественными новообразованиями
Введение к работе
В структуре причин смертности населения по России и в мире онкологическая патология занимает 3-е место после сердечно-сосудистых заболеваний и травм [7].
С начала 90-х годов XX века в России ежегодно регистрируют более 400 тысяч злокачественных новообразований. При этом наблюдается ежегодный рост абсолютного числа больных с впервые установленным диагнозом, что обусловлено не только истинным подъемом заболеваемости, связанным, в том числе и с ухудшением экологической обстановки, качества жизни, постарением населения, но и заметным улучшением выявляемости заболеваний. В структуре смертности от онкологических заболеваний около 30% занимают лица трудоспособного возраста. Ежегодно в стране более 120 тысяч человек признаются инвалидами по этой причине, что свидетельствует о чрезвычайно высокой значимости ранней диагностики, профилактики и лечения этих заболеваний [6].
В связи с этим поиск новых методов ранней и дифференциальной диагностики, критериев прогноза злокачественных опухолей, а также установление новых закономерностей, характерных для злокачественного роста, является весьма актуальным. В этом плане перспективными выглядят исследования, связанные с изучением неоптеринового статуса. В настоящее время неоптерин рассматривается как маркер активации клеточного иммунитета [21, 16, 19, 27, 138]. Это связано прежде всего с тем, что измерение биологически более инертного метаболита для дополнительной оценки состояния клеточного звена иммунитета представляет максимальный интерес. Особенно акцентируется тот факт, что изменение его концентраций в крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных у-интерфероном [27, 105]. Наряду с интерфероном-гамма (ИФ-у) фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) является мощным костимулятором синтеза неоптерина [16, 39, 91], а экзогенный
6 неоптерин стимулирует синтез ФНО-а макрофагами [39]. Это особенно важно, учитывая фундаментальную роль ФНО-а в иммунопатологии злокачественного перерождения [24, 8,22,20].
Из данных литературы известно, что уровень неоптерина повышается при многих онкологических заболеваниях (раке поджелудочной железы, легких, печени, яичников, молочной железы) [136, 59, 160, 121, 98, 128, 189]. Наиболее высокие концентрации отмечены у больных с опухолями кроветворной системы - с неходжкинскими лимфомами и множественными миеломами [21].
Однако мы не обнаружили работ, в которых бы рассматривались взаимоотношения между уровнем неоптерина и цитокинами, влияющими на его продукцию, и другими показателями - онкомаркерами, факторами неспецифической резистентности при злокачественных новообразованиях.
Кроме того, существующие методы определения неоптерина - это иммуноферментный, радиоиммунный анализы, а также высокоэффективная жидкостная хроматография, не нашли пока широкого применения в клинической практике вследствие либо своей дороговизны, либо сложности проведения анализа, а также необходимости специфического оборудования и других факторов [19, 21].
На основании вышеизложенного, нами сформулирована цель исследования: установить закономерности изменений уровня неоптерина и его взаимоотношения с цитокинами (ИФ-у, ФНО-а), системой комплемента, онкомаркером (РЭА) и показателем эндотоксикоза у пациентов со злокачественными новообразованиями.
Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
Разработать способ определения неоптерина в сыворотке крови.
Изучить концентрацию неоптерина у пациентов с раком желудка, толстого кишечника, молочной железы и почки до и после хирургического лечения.
Исследовать концентрацию цитокинов (ИФ-у, ФНО-а), влияющих на продукцию неоптерина, а также уровень раково-эмбрионального антигена, молекул средней массы, и выявить особенности изменений в комплементарном статусе при злокачественных опухолях.
Оценить характер корреляционных взаимоотношений между величинами неоптерина, с одной стороны, и значениями цитокинов, раково-эмбрионального антигена, молекул средней массы, параметрами системы комплемента - с другой.
Научная новизна
Впервые разработан высокочувствительный ВЭЖХ метод определения неоптерина в биологических жидкостях с использованием УФ-детектора.
"Приоритетным в работе является, раскрытие закономерностей изменений уровня неоптерина во взаимосвязи с некоторыми показателями иммунитета у пациентов со злокачественными образованиями. Установлено, что при онкопатологии желудочно-кишечного тракта наблюдается стимуляция синтеза ФНО-а, приводящая к повышению уровня ИФ-у, который усиливает продукцию неоптерина, что является свидетельством активации клеточного иммунитета. Показано, что оперативное лечение рака желудка снижает интенсивность синтеза неоптерина на фоне уменьшения продукции ИФ-у и ФНО-а. Хирургическое лечение рака толстого кишечника приводит к усилению ИФ-у-независимого пути синтеза неоптерина. При раке молочной железы рост уровня неоптерина обусловлен стимулирующим эффектом, прежде всего, фактора некроза опухолей-а, а после удаления злокачественного очага высокий уровень неоптерина поддерживается за счет активации его синтеза интерфероном-у. Обнаружено, что при раке почки содержание неоптерина не изменяется на фоне повышенной продукции ИФ-
Y-
Теоретическая и практическая значимость
В ходе исследования был проведен сравнительный анализ методов
экстракции неоптерина и показана высокая селективность твердофазного
8 способа, что позволяет определять неоптерин с помощью УФ-детектора.
Полученные результаты расширили представление о роли нарушений неоптеринового статуса при злокачественных опухолях, что может быть использовано для разработки способов прогноза и ранней диагностики метастазов при онкологических заболеваниях.
Установлено, что у пациентов при всех изученных локализациях злокачественного процесса происходит активация комплемента, главным образом, за счет альтернативного пути. Корреляционные взаимосвязи между продукцией неоптерина и показателями системы комплемента носят разнонаправленный характер, однако общими являются отрицательные связи между содержанием неоптерина, с одной стороны, и уровнем С5а и СЗа - с другой.
Подана заявка на изобретение «Способ определения неоптерина в крови» №2006106029, приоритет от 26.02.2006.
Материалы работы внедрены в учебный процесс на кафедрах биохимии, патологической физиологии.
Положения, выносимые на защиту:
Разработанный метод определения неоптерина является простым, нетрудоемким, чувствительным и воспроизводимым по сравнению с имеющимися аналогичными методами.
Продукция неоптерина и характер его взаимоотношений с уровнем цитокинов (ИФ-у и ФНО-а), определяется локализацией злокачественного процесса. Хирургическое лечение онкологических больных оказывает различное влияние на вышеуказанные показатели
Изменения комплементарного статуса у пациентов со злокачественными новообразованиями свидетельствуют о преимущественной активации альтернативного пути.
Апробация работы
Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на V Всероссийской университетской научно-
9 практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2006), на X международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва - Клязьма, 2006), на совместном заседании кафедр биохимии, нормальной физиологии, патологической физиологии, общей химии Читинской государственной медицинской академии с участием сотрудников НИИ экологии при ГОУ ВПО ЧГМА (Чита, 2007).
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 23 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 32 отечественных и 166 зарубежных источников.
Неоптерин, его биологические функции
История изучения птеридины началась в 1889 г., когда K.G. Hopkins впервые выделил пигмент из крыльев бабочки [21]. Работы с этими веществами продолжались, и в 1936 г. С. Schopf дал им название «птеридины», от греческого pteron - крыло [21].
По своей структуре птеридины представляют собой конденсированные гетероциклические соединения, каждое из которых состоящие из двух частей - пиримидиновои и пиразиновой. Встречающиеся в природе птеридины делятся на 2 класса: «конъюгированные» (фолиевая кислота и ее производные), в которых птеридиновый гетероцикл соединен с р-аминобензоилглутаминовой кислотой, и «неконъюгированные» -птеридины, имеющие различных заместителей в 6-м или 7-м положениях. Последние, в свою очередь, можно разбить на две группы, отличающиеся друг от друга по замещениям в пиримидиновои части птеридиновои структуры - это 2-амино-4-оксо-соединения («птерины») и 2,4-диоксопроизводные («люмазины»).
Биологические функции «конъюгированных» птеридинов известны и достаточно подробно изучены [21]. Энзимы, содержащие в качестве коферментов производные тетрагидрофолата, осуществляют перенос одноуглеродных остатков, участвуя в синтезе пуриновых, пиримидиновых нуклеотидов, метионина; они также играют важную роль в преобразованиях серина, глицина и гистидина. Фолатные производные участвуют в фотобиологических процессах. Известно, что 5,10-метенилтетрагидрофолат устойчив к фотолизу в присутствии кислорода при высоком молярном коэффициенте поглощения в области 320-380 нм. По мнению Ю.Л. Земковрй и соавт. они послужили теми селективными признаками, по которым данное соединение было выбрано природой на роль фотосенсора ближнего спектра
УФ света в белках-фоторецепторах [18]. - - «Неконъюгированные» птеридины также представляют интерес с точки зрения их участия в различных фотосенсорных процессах. О чувствительности птеринов к свету известно достаточно давно [82]. Они обнаружены в сетчатке глаза различных животных [154] и, кроме того, могут являться хромофорами, поглощающими ближний спектр ультрафиолетового излучения [154].
В клетках животных «неконъюгированные» птеридины могут функционировать в качестве коферментов.
В настоящее время достаточно хорошо исследовано участие молибденоптерина в качестве простетической группы некоторых редокс ферментов, которые широко распространены в животном и растительном мире. Они воздействуют на некоторые реакции метаболизма азота, серы и углерода. По типу катализируемых реакций их можно разделить на 2 категории: одни из них осуществляют транспорт кислородного атома, сопряженный с переносом электронов (нитратредуктаза, диметилсульфоксидредуктаза, сульфитоксидаза), а вторые стимулируют окислительное гидроксилирование альдегидов и ароматических гетероциклических соединений (ксантиндегидрогеназаза, альдегидоксидо-редуктаза) [144, 113, 102]. Наиболее подробно изучен биоптерин, 5,6,7,8-тетрагидроформа (Нг биоптерин) которого служит коэнзимом ряда гидроксилаз ароматических аминокислот: фенилаланин-4-гидроксилазы - основного катализатора метаболизма фенилаланина; тирозин-3- и триптофан-5-гидроксилаз -ферментов, лимитирующих скорость биосинтеза нейромедиаторов дофамина и серотонина [79]. Кроме того, Щ-биоптерин в составе глицерил-эфирмонооксигеназы принимает участие в окислительном расщеплении эфиров липидов [180]. В последнее время установлено также, что он входит в состав NO-синтаз, являясь звеном в превращении аргинина в цитруллин и оксидазота[113]. Несмотря на то, что энзимов, содержащих в качестве коферментов производные неоптерина, пока не обнаружено, тетрагидроформа данного птерина способна замещать нативный простетическую группу в Щ-биоптерин-зависимых энзимах без значительного изменения их каталитических свойств [80, 179, 151, 109, 182].
Метаболизм неоптерина
Неоптерин синтезируется из гуанозинтрифосфата. С помощью фермента ГТФ циклогидролаза-1 (ГТФ ЦГ-1) катализирует генез 7,8-дигидронеоптеринтрифосфата из ГТФ. Отщепление фосфорных остатков клеточными фосфатазами приводит к образованию 7,8-дигидронеоптерина, при неферментативном окислении которого и возникает неоптерин (рис.2). [138, 147, 174].
Физиологические концентрации данного соединения и его восстановленных форм в организме невысоки. В сыворотке взрослых здоровых людей его количество в среднем составляет 5,2 нмоль/л [190].
Регистрируется небольшие колебания его величин, связанные с возрастом, физиологическим состоянием, расовыми различиями, отношением к курению [136, 139, 77]. За поддержание конститутивного уровня неоптерина в организме ответственна печень. Значения этого вещества в желчи в 100-200 раз превышают обнаруживаемые цифры в сыворотке крови. 14 Экскретируемый с желчью в тонкий отдел кишечника . неоптерин реабсорбируется в его толстом фрагменте. Только 1% его обнаруживается в каловых массах [63]. У T.Fukushima есть основания полагать, что часть данного птерина катаболнзируется. симбиотической микрофлорой толстого отдела кишечника [84]. Его выведение из организма осуществляются мочевыделителыюи системой. Период его полужизни составляет приблизительно 90 минут, а концентрации исследуемого гетероцикла в моче в 200-500 раз выше, чем в сыворотке крови [134]. Отношение восстановленной формы неоптерина к окисленной в сыворотке/плазме венозной крови равно 1:Г. Подобнаяпропорция характерна и для других биологических жидкостей [83, 116, 183, 49]. Однако в артериальной крови наблюдается более высокое (2:1) отношение 7,8-дигидроформы к ароматическому варианту неоптерина [63, 187, 72].
При патологических состояниях, связанных с активацией иммунной системы, концентрации неоптерина и 7,8-дигидронеоптерина в организме может значительно увеличиваться. Так, в работе J. Margreiter, et al.. приводятся значения в крови 100-250 нмоль/л [125], a H.Iwagaki et al. у пациентов с постоперационными инфекционными осложнениями регистрируют уровень неоптерина в плазме - 1,6 мкмоль/л [129].
Первоначально исследователи полагали, что ответственными за увеличение концентрации неоптерина в биологических жидкостях являются Т-клетки [162]. Однако позже было доказано, что главным его источником следует считать моноциты/макрофаги. Основным действующим началом, обеспечивающим стимуляцию продукции неоптерина данными иммунокомпетентными клетками, является ИФ-у [138, 96, 105]. а-ИФ и р-ИФ также индуцируют его синтез, но их действие значительно менее выражено [169,67].
Существующие методы анализа неоптерина. Обзор хроматогра-фического анализа ВЭЖХ неоптерина в биологических жидкостях
В клинической практике используют измерение уровня неоптерина в различных биологических жидкостях: чаще исследуются сыворотка крови и моча, реже его концентрацию определяют в синовиальной, спинномозговой и амниотической жидкостях [21, 176, 29]
Первый метод, который был разработан для количественного выявления неоптерина - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). С помощью флуоресцентной метки чувствительность метода ВЭЖХ удалось повысить так, что стало возможно детектировать в моче до 1 пмоль неоптерина или его производных [180].
В настоящее время разработаны и внедрены в клинико-лабораторную практику способ радиоиммунологического анализа, позволяющий провести измерение уровня неоптерина за 50 минут, но при этом радиоиммуноанализы для неоптерина дороги и поэтому рутинное применение делает их весьма проблематичным, а также иммуноферментный метод, с помощью которого его можно определить концентрацию неоптерина примерно за 2 часа [27].
Эти два способа достаточно просты в исполнении, хорошо воспроизводимы и не требуют больших затрат времени и высокой квалификации специалиста для своего проведения. Возможность применение готовых коммерческих наборов делает их основными в клинико-лабораторной практике.
В последнее время в мировой практике доминируют несколько способов детекции данного птерина с применением ВЭЖХ. Авторы одного из них W.E.Slazyk and F.W.Splerto (1990) [176] предлагают: к 2 мл плазмы добавляют 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 0,25 мл раствора йода, тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем центрифугируют образцы 30 мин при 4С и 3100 g и супернатант в объеме 1,75 мл наносят на колонку с катионообменным сорбентом. Колонку промывают 5 мл деионизировашюй дистиллированной воды и элюируют неоптерин 2 мл 1 М NH4OH. Элюат нейтрализуют добавлением 30 мкл ледяной уксусной кислоты и 50 мкл получившейся смеси вводят в инжектор. ВЭЖХ-анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Excalibur 250 х 4,6 мм с сорбентом октадецилсиланом (octadecylsilane - ODS) размером частиц 5 мкм со скоростью 1 мл/мин, подвижная фаза метанол-вода в соотношении 15:85, фильтры возбуждения 360-370 им, фильтры эмиссии 418-700 нм. Применяется предколонка 70 х 4,6 мм с 5-микронным сорбентом Spherisorb ODS. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.
Однако метод имеет ряд недостатков. Способ сложен по причине того, что для осуществления его требуется твердофазная экстракция неоптерина на картриджах. Помимо этого необходимо дополнительно определять уровень креатинина для пересчета конечной концентрации неоптерина. Точность уменьшается способа из-за того, что применяемая ТХУ обладает собственной флюоресценцией и её пик накладывается на пик неоптерина.
Следующий вариант предложен C.Carru et al. (2004) [29]. Он заключается в том, что к 100 мкл плазмы добавляют 10 мкл 5% ТХУ (рН смеси равен 3), перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 g, затем к 50 мкл супернатанта приливают 200 мкл бидистиллированной воды и 30 мкл из полученной смеси вводят в инжектор. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Waters 250 х 4,6 мм с сорбентом Spherisorb Qg размером частиц 5 мкм со скоростью 1,5 мл/мин, подвижная фаза вода - ацетонитрил в соотношении 99:1 v/v, изократический режим, длина волны возбуждения 353 нм, эмиссии 438 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.
Но данный метод детекции также не лишен недостатков. Способ сложен по причине того,, что для осуществления его тоже требуется твердофазная экстракция неоптерина на картриджах. Точность снижается вследствии тех же причин, т.е. применяемая ТХУ обладая собственной флюоресценцией, деформирует пик неоптерина.
Способ предложенный J.J.Rippin (1992) [166], отличает отсутствие использования ТХУ. К 100 мкл плазмы добавляют 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Экстракцию неоптерина проводят на колонке SCX Bond-Elut (propylbenzenesulfonic acid silica sorbent), промытой 1 мл 0,18 M НС1. После нанесения пробы колонку промывают 1 мл метанола и неоптерин элюируют 1 мл смеси NH4OH (308 г/л) в ацетонитриле (1:5), элюат упаривают на воздухе. Сухой остаток растворяют в 100 мкл мобильной фазы, тщательно перемешивают и 20 мкл вводят в петлю. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке 250 х 4,5 мм с сорбентом ODS2 размером частиц 5 мкм со скоростью 1,5 мл/мин, подвижная фаза - 50 мл метанола в 1 л 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,2; изократический режим, длина волны возбуждения 360 нм, эмиссии 440 нм. Применяют предколонку с сорбентом ODS2. Регистрируют пик и величины неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.
Однако же данный метод за счет необходимости экстрагирования неоптерина на колонке SCX Bond-EIut удлиняет время исследования. Метод недостаточно чувствителен, так как при растворении сухого остатка в мобильной фазе с рН 6,2 (в слабокислой среде) снижается гидрофильность неоптерина, который частично выпадает в осадок, что снижает точность определения. Кроме этого, при использовании подвижной фазы с рН 6,2 вызывается эффект «карамелизации» верхнего слоя сорбента; последнее явление сказывается на точности результатов и неблагоприятно действует на колонку, уменьшая срок её службы.
Клиническая характеристика обследованных групп
Программа исследований включала ряд этапов, на каждом из которых в соответствии с поставленными задачами обследована необходимая репрезентативная выборка лиц.
Характеристика контрольной группы
В контрольную группу вошли 20 человек обоего пола (11 мужчин и 9 женщин), которые по результатам клинического, лабораторного, обследований отнесены к группе здоровых лиц. Возрастная амплитуда колебалась в пределах от 19 до 54 лет, при этом средний возраст составлял 34,3 года.
Характеристика клинических групп Клиническая часть работы выполнялась на базе Областного онкологического диспансера г. Читы в период с 2004 по 2006 гг. Нами обследовано 78 пациентов, страдающих онкологической патологией, из них 31 больной раком желудка (РЖ), 16 -толстого кишечника (РТК), 20 - молочной железы (РМЖ) и 11 - раком почки (РП) до и после оперативного лечения. Для каждого больного заполнялась специальная разработанная карта, куда вносились жалобы, анамнестические, объективные клинические данные с оценкой наличия осложнений; включались результаты инструментальных и лабораторных исследований (табл. 5). Для установления диагноза и характеристики нозологических форм рака мы пользовались международной классификацией по системе TNM и гистологической классификацией. Как видно из таблицы 2, в группе больных раком желудка преобладали мужчины (58,1%). Средний возраст пациентов- 60,6 года. Среди них больные с поражением антрального отдела органа составили 38,6 %, а у 61,4% местом повреждения было тело желудка, причем 66,5% опухолей локализовались в нижней трети.
Распределение пациентов по стадиям злокачественного процесса приведено в таблице 3 согласно международной классификации по системе TNM. Как видно из таблицы, у 46,7% злокачественное новообразование выявлено на 2, а у 53,3% - на стадии За.
Макроскопическая картина характеризовалась преобладанием язвенно-инфильтративной формы. Она обнаружена у 26 пациентов (83,9%). Полиповидная форма рака выявлена у 3 пациентов (9,7%); по одному случаю с блюдцеобразной и грибовидной формами (3,2%) соответственно. Гистологический тип опухоли у всех обследованных данной группы -аденокарцинома с различной степенью дифференцировки: в 79% случаев -умеренно дифференцированный, 13% - низко дифференцированный, 8% -высоко дифференцированный.
В данной группе, регистрировалось больные с поражение различных отделов ободочной кишки (9 наблюдений - 56,3%). Из них у 4-х патологический процесс локализовался в ее восходящем отделе, у 2-х в области печеночного угла, а в 3-х случаях местом повреждения была сигмовидная кишка.
Разные участки прямой кишки оказались одинаково чувствительны к возникновению опухоли (в 3-х случаях она в среднеампулярном, в 2-х случаях в ректосигмоидном, в 2-х случаях в верхнеампулярном отделах) Распределение пациентов по стадиям злокачественного процесса приведено в таблице 5. У всех больных злокачественная опухоль обнаружена на стадии 2а (68,8%) и 26 (31,2%). Изучение макропрепаратов позволило сделать следующий вывод: чаще всего встречалась язвенно-инфильтративная форма (62,5%). Реже обнаруживался рак других вариаций: полиповидная форма выявлена у 3 пациентов (18,8%); грибовидная у 2 (12,5%); циркулярная только у 1 больного (6,2%). Гистологически для опухолей у всех больных характерны -аденокарциномы с различной степенью дифференцировки: Наибольший процент (77%) случаев приходился на умеренно дифференцированный рак, меньше всего (6,2%) на низко дифференцированный, в 16,8% обнаруживались высоко дифференцированные аденокарциномы.
В группе больных раком молочной железы (п=20) средний возраст составлял 55,4. У 11 из них опухолевый процесс выявлен на стадии 2а, у 9 на стадии 26. Гистологически у всех пациенток диагностирован инфильтрирующий протоковый рак.
В группу больных раком почки (п=11) вошли 9 мужчин (81,2%) и 2 женщины (18,2%). Средний возраст составил 63,7 лет. У 7 из них выявлена 1 стадия поражения, у 4 пациентов 2 стадия. Гистологическое исследование выявило у всех пораженных почечно-клеточный рак почки.
Диагноз обследованным больным был выставлен на основании клинико-анамнестических данных, подтвержденных лабораторно-инструментальными методами исследования. Всем пациентам забор крови проводился дважды: в момент поступления в стационар для проведения хирургического лечения, и перед выпиской из стационара.
У всех обследуемых выявлялись уровни неоптерина, ФЫО-а и ИФ-, раково-эмбрионального антигена, молекул средней массы, содержание отдельных компонентов комплемента, а также определялась активность системы комплемента в классическом варианте активацииИсследования на здоровых и больных выполнены малоинвазивными методами с информированного согласия и соответствуют этическим принципам, предъявляемым Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000 ред.)).
Закономерности изменений уровня неоптерина и содержания цитокинов у пациентов со злокачественными новообразованиями
Для ранней диагностики таких тяжелых заболеваний, как злокачественные новообразования, используются и лабораторные, и инструментальные методы. С помощью разработанного нами метода хроматографического анализа изучена концентрация неоптерина у больных с впервые диагностированными опухолевыми процессами в различных органах до и после проведения хирургического лечения.
Предварительное исследование значений данного вещества у здоровых лиц разного возраста и пола не обнаружило достоверных отличий, обусловленных этими факторами, что также подтверждается работами G.Reibnegger, et al., N. Radunovic, et al (1999), H Schennach, et al (2002) [136, 139,77].
Анализ результатов у больных с разными стадиями, морфологическими формами раков и степени дифференцировки опухолей, внутри одной нозологической формы значимых различий в концентрации неоптерина не выявил. Это позволило сравнить данные величины, не учитывая влияние вышеперечисленных факторов.
Наличие злокачественного процесса приводило к повышению продукции неоптерина у всех обследуемых пациентов, за исключением лиц, страдающих раком почки (табл. 6). Так, его значения возрастали на 70,9% (р 0,001), 101,6% (р 0,001) и 62,5% (р 0,001) по сравнению с контролем при раке желудка, толстого кишечника и молочной железы соответственно. Следовательно, уровень данного метаболита при указанных локализациях достоверно превышал таковой при раке почки. Как видно из таблицы 6, наибольшее содержание птерина было характерным для пациентов с РТК, цифры которого были на 18,0% (р 0,01) и 24,1% (р 0,001) больше, чем у больных РЖ и РМЖ соответственно. Подобное явление, по всей вероятности, обусловлено усилением процессов реабсорбции неоптерина в толстом кишечнике и, главным образом, возросшей продукцией ИФ-у (см. ниже).
Хирургическое лечение вызвало неоднозначный эффект. После операции на желудке содержание неоптерина значимо уменьшилось на 28,5%, (р 0,001), но не достигало уровня здоровых лиц. Оперативное вмешательство на толстом кишечнике провоцировало дальнейший рост цифр изучаемого соединения, которые составляли 130,5% (р 0,001) от таковых до лечения. Необходимо отметить, что маммэктомия не влияла на содержание неоптерина в сыворотке крови, а оперативное лечение больных раком почки приводило к снижению его величин почти на 40% (р 0,001), причем они были также статистически значимо ниже таковых у здоровых лиц.
Было бы некорректно рассматривать изменения концентрации неоптерина при любых физиологических и патологических процессах без изучения факторов, влияющих на его продукцию. Среди них главным индуктором его синтеза является интерферон-у, который активирует ключевой фермент в цепочке превращения ГТФ в неоптерин [174]. В меньшей степени регулирует его секрецию ФНО-а и другие цитокины, причем первый вызывает опосредованную супериндукцию интерферон-зависимого синтеза неоптерина [21]. Результаты по содержанию ИФ-у у обследуемых больных лиц представлены в таблице 7.
Как видно из представленных данных, увеличение концентрации ИФ-у относительно контрольной группы зарегистрировано во всех исследуемых группах онкологических больных на момент поступления в стационар. Наиболее значимый подъем величин данного лимфокина обнаружен в группах с РЖ и РТК. Их значения возрастали на 135,9% (р 0,05) и на 146,8% (р 0,05) по сравнению с контролем соответственно. У больных раком молочной железы и почки цифры ИФ-у были также выше таковых у здоровых лиц, но они достоверно были меньше, чем у пациентов с РЖ и РТК. При злокачественном поражении молочной железы содержание ИФ-у составляло 70,7% (р 0,05) и 67,7% (р 0,05) от его значений при РЖ и РТК соответственно, а при РП - 81,0% (р 0,05) и 77,5% (р 0,05) соответственно.
После проведенного хирургического лечения уровень данного цитокина у пациентов с РЖ и РТК резко уменьшался почти в 2 раза (р 0,001 и р 0,001) по сравнению с исходными значениями и не отличался от величин контрольной группы. Незначительное, но достоверное падение этого показателя наблюдалось у лиц с раком почки, а удаление злокачественного очага в молочной железе никаким образом не сказывалось на продукции ИФ-у. Необходимо подчеркнуть, что у пациентов этих двух групп содержание данного лимфокина значительно превышало контрольные цифры (табл. 7).
Несколько похожая направленность сдвигов была зарегистрирована нами при изучении содержания ФНО-а. Примечание: - достоверные различия по сравнению с контролем; - достоверные различия между показателем до и после лечения; достоверность различий между группами больных указана в тексте Повышение его концентрации в 2,1 (р 0,01), 2,2 (р 0,05) и 1,5 (р 0,05) раза по сравнению с контролем зарегистрировано при раке желудка, толстого кишечника и рака молочной железы соответственно. При локализации опухолевого процесса в почке отмечалась лишь тенденция к росту этого цитокина, при этом его цифры были статистически значимо меньше на 34,0% (р 0,01) и 37,1% (р 0,01), чем у пациентов с РЖ и РТК соответственно. Аналогичная закономерность была характерна и для больных РМЖ - уровень ФНО-а составлял лишь 70,9% (р 0,001) и 67,6% (р 0,001) от такового при раке желудка и колоректальном раке соответственно.
Хирургическое лечение у пациентов с раком толстого кишечника вызвало снижение цифр ФНО-а на 66,1% (р 0,05) и достоверно не отличалось от величин контроля. Подобный эффект наблюдался и при лечении рака желудка. У этих пациентов его уровень снизился на 55,4% (р 0,01). В группе больных раком почки наблюдалась обратная картина. Оперативное лечение вызвало повышение продукции ФНО-а на 46% (р 0,05) по сравнению с величинами до лечения и статистически значимо превышало контрольные цифры на 108% (р 0,01). Концентрации изучаемого цитокина у больных, прооперированных по поводу РМЖ, оставались в тех же самых пределах, что и до лечения (табл. 8).
Особый интерес представляют корреляционные взаимоотношения между величинами неоптерина с одной стороны, и содержанием ИФ-у и ФНО-а - с другой.
У здоровых лиц уровень неоптерина положительно коррелировал лишь с продукцией ИФ-у (г = 0,39; р 0,05), что вполне закономерно, учитывая то, что последний является основным стимулятором его синтеза. При наличии злокачественного процесса в желудочно-кишечном тракте независимо от его локализации, у больных до операции корреляционные зависимости характеризуются относительной однотипностью.
