Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о сдвиговой регуляции функции тромбоцитов (обзор литературы) 14
1.1. Теоретические основы сдвиговой регуляции функции тромбоцитов 14
1.2. Регуляторное значение сдвиговых сил 19
1.3. Механизмы адгезии тромбоцитов при различных скоростях сдвига 22
1.3.1. Адгезия тромбоцитов при высокой скорости сдвига 22
1.3.2. Адгезия тромбоцитов при низкой скорости сдвига 42
1.4. Аппаратура, применяемая для исследования сдвиговой регуляции функции тромбоцитов in vitro 45
Глава 2. Материал и методы исследования 51
2.1. Материал для исследования 51
2.2. Моделирование декомпенсированного негазового ацидоза и алкалоза в обогащенной тромбоцитами плазме 52
2.3. Облучение биоматериала 52
2.4. Методы исследования 53
2.4.1. Исследование адгезии и агрегации тромбоцитов в цельной крови при различных скоростях сдвига 53
2.4.2. Исследование агрегации тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме 56
2.4.3. Изучение фибриногенсвязывающей способности тромбоцитов и экспрессии Р-селектина 57
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 57
Глава 3. Влияние НИЛИ на функции тромбоцитов в движущейся крови 61
3.1. Влияние НИЛИ на адгезию и агрегацию тромбоцитов в условиях низкой и высокой скорости сдвига 61
3.2. Влияние НИЛИ на эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов 70
3.3. Исследование специфичности и временной динамики влияния различных видов НИЛИ на функции тромбоцитов 83
3.4. Периодические изменения адгезии и агрегации тромбоцитов 90
3.4.1. Характеристика явления и условия возникновения периодических изменений адгезии и агрегации тромбоцитов 90
3.4.2. Исследование возможности модификации периодических изменений адгезии и агрегации тромбоцитов в цельной крови 94
3.4.3. Периодические изменения агрегации кровяных пластинок в обогащенной тромбоцитами плазме 101
3.4.4. Периодические изменения фибриногенсвязывающей способности и экспрессии Р-селектина на мембране тромбоцитов 106
Глава 4. Влияние нили красной области спектра на агрегацию тромбоцитов, индуцированную различными агонистами 109
4.1. Влияние НИЛИ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов 109
4.2. Влияние НИЛИ на адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов 121
4.3. Влияние НИЛИ на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов 131
Глава 5. Агрегация кровяных пластинок при различных значениях рН 154
5.1. Агрегация тромбоцитов в условиях ацидоза 156
5.1.1. АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов в условиях ацидоза 156
5.1.2. Адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов в условиях ацидоза 161
5.1.3. Коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов в условиях ацидоза 166
5.2. Влияние алкалоза на агрегацию тромбоцитов 169
5.2.1. АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов в условиях алкалоза 169
5.2.2. Адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов в условиях алкалоза 174
5.2.3. Коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов в условиях алкалоза 178
Глава 6. Влияние нили на величину рН Обогащенной тромбоцитами плазмы и агрегацию тромбоцитов в условиях ацидоза и алкалоза 183
6.1. Влияние НИЛИ на агрегацию тромбоцитов в условиях ацидоза... 184
6.1.1. Влияние НИЛИ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях ацидоза 184
6.1.2. Влияние НИЛИ на адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях ацидоза 194
6.1.3. Влияние НИЛИ на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях ацидоза 203
6.2. Влияние НИЛИ на агрегацию тромбоцитов в условиях алкалоза.. 208
6.2.1. Влияние НИЛИ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях алкалоза 208
6.2.2. Влияние НИЛИ на адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях алкалоза 217
6.2.3. Влияние НИЛИ на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях алкалоза 225
Заключение 232
Выводы 271
Практические рекомендации 274
Литература 275
- Теоретические основы сдвиговой регуляции функции тромбоцитов
- Исследование адгезии и агрегации тромбоцитов в цельной крови при различных скоростях сдвига
- Влияние НИЛИ на адгезию и агрегацию тромбоцитов в условиях низкой и высокой скорости сдвига
- Влияние НИЛИ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов
Введение к работе
Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в настоящее время находит широкое применение в различных областях практического здравоохранения как в России, так и за рубежом. Многолетний опыт использования НИЛИ убедительно свидетельствует о его высокой терапевтической эффективности в лечении целого ряда заболеваний и патологических процессов [Корочкин И.М. и др., 1988; Бабушкина Г.В., Картелишев А.В., 1998; Амиров Н.Б., Ковалёва Т.В., 2001, 2002; Абдрахманова А.И., 2002; Белов В.В., Лозовая Л.П., Аксёнов В.В., 2005; КемаловР.Ф., 2006; Ohshiro Т, Calderhead R.G., 1988; Ad N., Oron U., 2001; Yaakobi T. et al, 2001; Lampl Y., 2007]. На сегодняшний день сам факт позитивного воздействия НИЛИ не вызывает сомнений, однако вопрос о молекулярно-клеточных событиях, лежащих в его основе, по-прежнему остаётся предметом дискуссии теоретиков и клиницистов.
Одним из наиболее удобных объектов для исследования закономерностей, лежащих в основе лазерного биоэффекта, являются тромбоциты. Это связано с простотой изоляции кровяных пластинок, а также с существованием большого числа методов, позволяющих детально изучить их функциональное состояние. С другой стороны, исследование влияния НИЛИ на тромбоциты имеет и большое прикладное значение, поскольку нарушения тромбоцитарного звена системы гемостаза играют заметную роль в патогенезе многих форм патологии, в том числе атеросклероза, ишемической болезни сердца, инсульта, сахарного диабета, антифосфолипидного синдрома и др. [Feinberg W.M., Brack D.C., 1991; Castelli W.P., 1996; Zeller J.A., Tschoepe D., Kessler C, 1999; Libby P., 2000; SobolA.B., Watala C, 2000; de Groot P.G., Derksen R.H., 2005; Vega-Ostertag M.E., Pierangeli S.S., 2007].
Имеющиеся в литературе сведения о характере и механизмах воздействия НИЛИ на кровяные пластинки носят фрагментарный характер и во многом противоречивы. Существуют значительные трудности в сопоставлении результатов, полученных разными авторами, что связано, с одной стороны, с особенностями использованных биообъектов, с другой — с применением различных источников лазерного излучения, доз и режимов фотовоздействия [Беспалова Т.А., 1997; Брилль А.Г., 1998; Спасов А.А., Недогода В.В., Куаме Конан, 1998а, 19986; Arora R.R., Mueller H.S., Sinha А.К., 1993; Olban М. et al., 1998; Brill A.G. et al., 2000]. В связи с этим возникает необходимость исследования влияния различных видов НИЛИ на функции тромбоцитов в стандартных условиях эксперимента, что сделает сравнительный анализ полученных результатов более корректным.
При движении форменных элементов в потоке крови они испытывают воздействие напряжения сдвига, которое является важным фактором в регуляции функции тромбоцитов [Ikeda Y. et al., 1991; Kroll M.H. et al., 1996; Ruggeri Z.M., 1997; Savage В., Sixma J.J., Ruggeri Z.M., 2002; Sadler J.E., 2005; Denis C.V., Wagner D.D., 2007]. Вместе с тем особенности фотореактивности кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях практически не исследованы.
НИЛИ хорошо зарекомендовало себя при лечении многих заболеваний и патологических процессов, в патогенезе которых существенная роль принадлежит нарушениям кислотно-щелочного баланса [Мусиенко Ю.И., Нечипуренко Н.И., Камышников B.C., 2003; Мусиенко Ю.И., 2005; Ререкин И.А, 2007; Al-Watban F.A., Zhang X.Y., 2004; Byrnes K.R. et al, 2004; Bayat M. et al, 2005; Hawkins D., Houreld N., Abrahamse H., 2005]. Однако модификация функции кровяных пластинок в условиях ацидоза и алкалоза до сих пор не являлась предметом глубокого изучения.
Цель исследования
Изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функции тромбоцитов при различных скоростях сдвига, а также при негазовых формах нарушений кислотно-щелочного баланса.
Задачи исследования
Изучить влияние НИЛИ с различной длиной волны на адгезию и агрегацию тромбоцитов при низкой (200 с-1) и высокой (1 800 с-1) скоростях сдвига.
Проанализировать влияние НИЛИ на характер и эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов.
Исследовать специфичность и временную динамику реакции тромбоцитов на фотовоздействие при различных скоростных параметрах движения крови.
Изучить влияние НИЛИ на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном.
Исследовать агрегацию тромбоцитов при негазовых формах нарушения * кислотно-щелочного баланса.
Изучить влияние НИЛИ на агрегационную функцию тромбоцитов в условиях нарушения кислотно-щелочного баланса.
Научная новизна
Впервые выявлены особенности реакции кровяных пластинок, находящихся в различных гидродинамических условиях, на воздействие НИЛИ красной, инфракрасной и синей областей спектра. Показана зависимость характера отклика тромбоцитов от дозы и режима лазерного облучения. Выявлена определённая временная динамика реализации фотоэффекта. Установлено влияние НИЛИ на эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов. Изучены возможности лазерной
модификации агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном.
Впервые исследованы функциональные особенности кровяных пластинок в условиях ацидоза и алкалоза и установлена зависимость фотореактивности тромбоцитов от величины средового рН. Доказана возможность коррекции агрегационной функции тромбоцитов, нарушенной в условиях ацидоза и алкалоза, под влиянием НИЛИ.
Обнаружено новое биологическое явление — периодические изменения адгезивных и агрегационных свойств кровяных пластинок в цельной крови и обогащенной тромбоцитами плазме in vitro.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научной деятельности СГМУ. Номер государственной регистрации — 02.03042330329.
Практическая значимость
Установленные в работе закономерности влияния НИЛИ различных спектральных диапазонов на функции тромбоцитов могут служить теоретическим обоснованием выбора того или иного вида лазерного излучения с целью оптимизации лазерной терапии.
Новые сведения о лазерной модификации сдвиговой регуляции функции тромбоцитов, являются основанием для разработки новых подходов к лазеротерапии, учитывающих различную фотореактивность кровяных пластинок, находящихся в различных отделах сосудистого русла.
Обнаруженные особенности фотореактивности тромбоцитов в условиях ацидоза или алкалоза, а также возможности лазерной коррекции функции тромбоцитов, изменённой при нарушениях кислотно-щелочного баланса, могут быть учтены при оптимизации существующих методов лазеротерапии и способов лазерной коррекции нарушений тромбоцитарного звена системы гемостаза.
Полученные данные о наличии периодических изменений адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов могут служить ориентиром для разработки тестов, основанных на многократных последовательных измерениях параметров функции тромбоцитов в клинике, с целью выявления десинхроноза, который может явиться предиктором различных форм патологии и иметь как диагностическое, так и прогностическое значение.
Основные положения, выносимые на защиту
Предварительное облучение цельной крови человека in vitro светом красного, инфракрасного и синего лазеров оказывает модифицирующее влияние на функцию тромбоцитов, зависящее от длины волны, дозы облучения и скоростных параметров движения крови.
Под влиянием НИЛИ изменяется эффективность сдвиговой регуляции функции тромбоцитов.
Характер и временная динамика отклика тромбоцитов на воздействие сдвигового сигнала в значительной мере определяются длиной волны излучения.
НИЛИ красной области спектра оказывает модулирующее влияние на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином и коллагеном.
При декомпенсированных негазовых формах нарушений кислотно-щелочного баланса происходит угнетение агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, адреналином и коллагеном.
НИЛИ оказывает корригирующий эффект в отношении АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации кровяных пластинок, нарушенной в условиях ацидоза и алкалоза.
Существует автоколебательный процесс, модифицирующий функцию тромбоцитов в цельной крови в условиях in vitro.
Внедрение
Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава». По материалам диссертации внедрены четыре рационализаторских предложения.
Апробация диссертации
Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях кафедры патологической физиологии (2006-2007 гг.), на совместном заседании кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии Саратовского государственного медицинского университета (2007 г.). Фрагменты работы представлялись на 66, 67 и 68-й научно-практических конференциях студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета «Молодые учёные — здравоохранению региона» (Саратов, 2005, 2006, 2007), на III осенней научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского государственного медицинского университета «Молодёжь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2005), на 65-й научно-практической конференции молодых учёных и студентов Волгоградского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), на XXIII, XXIV и XXVII Международных научно-практических конференциях «Применение лазеров в медицине и биологии» (Николаев, 2005; Ялта, 2005; Харьков, 2007), на 19-м Международном Конгрессе по тромбозу (19th International Congress on Thrombosis, Tel-Aviv, Israel, 2006), на VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007), на XXI Конгрессе Международного общества по тромбозу и гемостазу (XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland, 2007).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе три в
'* зарубежной печати.
Теоретические основы сдвиговой регуляции функции тромбоцитов
Как известно, находясь в состоянии относительного покоя, тромбоциты циркулируют в сосудистом русле, практически не контактируя с интактным эндотелием, соседними кровяными пластинками или другими форменными элементами крови. Необходимым условием начала адгезии, выражающейся в образовании соединений между мембраной тромбоцитов и определёнными участками субэндотелиального матрикса, служит столкновение кровяных пластинок с сосудистой стенкой. Главную роль в доставке тромбоцитов к месту их связывания играют сдвиговые силы, возникающие при движении крови.
Упрощённо течение крови по сосудам можно представить в виде множества параллельных концентрических слоев равной толщины, движущихся с различной скоростью. Слой крови, прилегающий к стенке сосуда, остаётся практически неподвижным, скорость его равна нулю. По мере удаления от стенки сосуда скорость течения слоев крови постепенно возрастает, достигая максимума в центре. Если обозначить разность скоростей между двумя соседними слоями через dV, а расстояние между ними через dr, то отношение dV/dr будет называться градиентом скорости или, что то же самое, скоростью сдвига (у):
Иными словами, скорость сдвига показывает, на сколько быстро изменяется скорость от слоя к слою в поперечном сечении сосуда. Измеряется данный параметр в обратных секундах (с-1). Скорость сдвига, равная 1 с , свидетельствует о том, что различие в скорости движения слоев жидкости, удалённых друг от друга на расстояние 1 см, составляет 1 см/с (т.е. скорость меняется на 1 см/с на каждый сантиметр). Разница скоростей движения прилежащих слоев крови максимальна у стенки сосуда и убывает по мере приближения к центральной оси, где слои движутся с минимальным различием в скорости, образуя практически единый поток с максимальной средней скоростью. Следовательно, скорость сдвига приобретает наибольшее значение вблизи стенки сосуда (пристеночная скорость сдвига), а наименьшее — в центральной его части [Каро К. и др., 1981; Бегун П.И., Шукейло Ю.А., 2000].
Величина пристеночной скорости сдвига зависит от объёмной скорости кровотока и диаметра сосуда. Упрощённо эта зависимость может быть выражена следующим соотношением: где Q — объёмная скорость кровотока (мл/с), D — диаметр сосуда (см) [Wootton D.M., Ku D.N., 1999; Pries A.R., Reglin В., Secomb T.W., 2005]. Из формулы (2) следует, что уменьшение диаметра сосуда в два раза приводит к восьмикратному повышению скорости сдвига. Следовательно, низкие значения скорости сдвига возникают в сосудах с медленным кровотоком, например в посткапиллярных венулах, в которых скорость сдвига составляет от 25 до 500 с-1 [Frojmovic М., Nash G., Diamond S.L., 2002], а высокие — в мелких сосудах с быстрым кровотоком (мелкие артерии и артериолы), в которых скорость сдвига колеблется в пределах от 500 до 5 000 с [Tangelder G.J. et al., 1988], составляя в среднем 1 700 с-1 [Goldsmith H.L., Turitto V.T., 1986]. При патологическом сужении просвета сосуда, например при атеросклеротическом стенозе коронарных артерий, скорость сдвига нередко превышает 10 000 с-1 [Back С.Н., Radbill J.R., Crawford D.W., 1977], а в ряде случаев может достигать 40 000 с-1 и более [Roux S.P. et al., 1991; Strony J. et al., 1993; J.M. Siegel et al., 1994; Mailhac A. et al., 1994; Hanson S.R., Sakariassen K.S., 1998].
Очевидно, что тот слой жидкости, который течёт с большей скоростью, подгоняет соседний слой, текущий с меньшей скоростью, и наоборот — медленный слой притормаживает более быстрый. В результате между прилегающими слоями крови возникает сила внутреннего трения, величина которой прямо зависит от вязкости крови. Сила, которая заставляет слои перемещаться вдоль сосудистой стенки, преодолевая возникающую между ними силу трения, носит название напряжения сдвига (т) и измеряется в Н/м2 или в дин/см . Взаимосвязь скорости и напряжения сдвига упрощённо можно представить следующим соотношением:
У-1 , (3) где т — вязкость крови, Па-с. Из формулы (3) видно, что скорость сдвига прямо пропорциональна напряжению сдвига и обратно пропорциональна вязкости [Фолков Б., Нил Э., 1976; Парашин В.Б, Иткин Г.П., 2005]. Для крови, вязкость которой составляет около 0,004 Па-с, напряжение сдвига в 1 дин/см" приближённо соответствует скорости сдвига в 25 с [Frojmovic М.М., 1998; Savage В., Ruggeri Z.M., 2007].
Несмотря на кажущуюся простоту вычислений, рассчитать точные значения скорости и напряжения сдвига зачастую не представляется возможным, и, прежде всего, это связано с тем, что вязкость крови, являющейся неньютоновской жидкостью, зависит не только от температуры, но и от множества других параметров, например от гематокрита, размера и деформируемости форменных элементов, концентрации растворённых веществ, содержания белка в плазме и др. [Кузник Б.И., 2004; Chmiel Н., Anadere I., Walitza Е., 1990; Thurston G.B., 1994; Dutta A., Tarbell J.M., 1996; Yeow Y.L. et al., 2002]. Проблема ещё больше усложняется тем, что вязкость крови не является постоянной в различных отделах сосудистой системы и меняется в зависимости от скоростных параметров движения крови. В частности, установлено, что по мере увеличения скорости сдвига происходит снижение вязкости крови [Zwaginga J.J. et al., 2006].
Исследование адгезии и агрегации тромбоцитов в цельной крови при различных скоростях сдвига
Для исследования агрегации тромбоцитов в ОТП применялись методы G.V.R. Born (1962) и З.А. Габбасова (1989). Оба методических подхода реализованы в двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "BIOLA" LA 230 (НПФ «БИОЛА», Россия), который и был использован в наших экспериментах.
Калибровку прибора для каждого нового образца ОТП осуществляли отдельно. В опытах по изучению влияния НИЛИ на процесс агрегации кровяных пластинок для обеспечения точности сравнительного анализа (и исключения влияния изменения рН во время стояния приготовленной плазмы) регистрацию ответа тромбоцитарной системы на добавление агониста осуществляли синхронно в контрольных (необлучённых) и облучённых образцах ОТП.
В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ (5,0 и 0,73 мкМ), адреналин (5,5 и 2,5 мкМ), ристоцетин (1,5 мг/мл), коллаген (5,0, 1,25 и 0,625 мкг/мл) и арахидоновую кислоту (1,5 мМ). Все реактивы произведены фирмой "DiaMed AG" (Швейцария). Объём ОТП составлял 250 мкл, объём агониста — 25 мкл при каждом определении. Агрегометрию проводили в условиях термостатирования (37 С) и непрерывного перемешивания образцов ОТП магнитной мешалкой со скоростью 800 об/мин. Запись агрегатограммы осуществляли в течение 15 мин. Во время записи кюветы были закрыты колпачками во избежание изменения рН.
По кривой светопропускания определялись следующие параметры агрегации кровяных пластинок: максимальная степень агрегации (по максимальной амплитуде агрегатограммы, в %), максимальная скорость агрегации (по наибольшему наклону кривой светопропускания, в %/мин) и другие показатели в зависимости от формы агрегатограммы при использовании различных агонистов. По кривой среднего размера агрегатов определяли максимальный размер образующихся тромбоцитарных микроагрегатов (по максимальной амплитуде кривой среднего размера агрегатов, в отн. ед.) и максимальную скорость увеличения размера тромбоцитарных микроагрегатов (по наибольшему наклону кривой среднего размера агрегатов, в отн. ед./мин). Изучение фибриногенсвязывающей способности тромбоцитов и экспрессии Р-селектина Исследование связывания фибриногена и экспрессии Р-селектина на мембране тромбоцитов проводили методом проточной цитометрии. Донорскую кровь в объёме 5 мкл помещали в кюветы, содержащие 30 мкл буфера Тироде-HEPES (рН 7,35) и 10 мкл FITC-конъюгированных моноклональных антител против фибриногена ("Dako", Дания) или 10 мкл FITC-конъюгированных моноклональных антител против CD62P ("Becton Dickinson", США). После трёхминутной инкубации при 22 С процесс останавливали 20-кратным разбавлением содержимого кюветы буфером Тироде-EDTA (5 мМ) с рН 6,5. Приготовленные таким образом образцы исследовали с помощью цитометра EPICS XL Coulter Flow Cytometer ("Coulter", США) с аргоновым лазером (488 нм). Оценивали два параметра: процент флюоресцирующих клеток и средний уровень флюоресценции (выраженный в условных единицах). Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета прикладных программ STATISTIC A (StatSoft Inc., USA; версия 6). Анализ вида распределения и описание количественных признаков. Для выбора адекватного способа представления полученных экспериментальных данных проводили проверку нормальности распределения количественных признаков (показателей) в выборках и применяли для этого критерий Шапиро-Уилка. Для описания количественных признаков с нормальным распределением в выборочной совокупности использовали выборочное среднее М, выборочное стандартное отклонение s и стандартную ошибку выборочной оценки среднего т. В тексте результаты представляли в виде «M±s». Если распределение в выборке отличалось от нормального, о центральной тенденции судили по медианному значению Me показателя и 95 % доверительному интервалу (ДИ) для медианы, а для оценки рассеяния показателя в выборке рассчитывали межквартильный интервал (МКИ), т.е. диапазон значений показателя от 25-го до 75-го процентилей [Джонсон Н., Лион Ф., 1980]. В ряде случаев, в группах, распределение которых изначально немного отличалось от нормального, в предположении о том, что эти группы всё же имеют нормальное распределение и отклонение от него обусловлено наличием в вариационном ряду необычного по величине значения, с помощью критерия Диксона проводили проверку гипотезы о наличии выбросов в группе [Dixon W.J., 1951]. Оценка статистической значимости различий. Выбор критерия оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами осуществляли с учётом характера распределения признака. При необходимости сравнения двух и более независимых групп с нормальным распределением прежде всего проводили проверку гипотезы о равенстве дисперсий, используя для этого критерий Левена. Если дисперсии были равны, то для оценки статистической значимости различий двух сравниваемых групп применяли критерий Стьюдента. При неравенстве дисперсий использовали критерий Стьюдента в аппроксимации Саттертвайта , являющийся, согласно данным литературы, наиболее адекватным подходом в этой ситуации [Satterthwaite F.W., 1946; Плавинский С.Л., 2005]. При сравнении трёх и более независимых групп с нормальным распределением
Аппроксимация Саттертвайта предполагает изменение количества степеней свободы для критерия Стьюдента соответственно степени различий между дисперсиями. признака и равными дисперсиями, во избежание эффекта множественных сравнений, проводили однофакторный дисперсионный анализ и, при наличии межгрупповых различий, для попарного сравнения групп между собой или с одной контрольной группой использовали критерий Ньюмена-Кейлса.
Влияние НИЛИ на адгезию и агрегацию тромбоцитов в условиях низкой и высокой скорости сдвига
Так, при облучении крови светом красного лазера в дозах 3,8 и 9,7 Дж увеличение скорости сдвига с 200 до 1 800 с-1 приводило к увеличению среднего размера адгезированных частиц в 1,70 раза (Р = 0,002) и 1,69 раза (Р = 0,007) соответственно, т.е. отмечалось снижение ИСРразм на 7 % по сравнению с контролем. При увеличении дозы фотовоздействия до 20,1 Дж при переходе от низкой скорости сдвига к высокой показатель агрегации тромбоцитов возрастал только в 1,47 раза (Р = 0,008), а ИСРразм был меньше контрольного значения уже на 19%. А при использовании максимальной дозы красного лазерного облучения (43,4 Дж) средний размер адгезированных частиц при высокой скорости сдвига практически не отличался от его значения при низкой скорости сдвига (Р = 0,127). При этом ИСРразм снижался на 36 % относительно контрольного значения.
Таким образом, излучение красного лазера приводит к существенным изменениям эффективности сдвиговой регуляции функций тромбоцитов только в максимальной использованной дозе. При этом влияние сдвигового фактора заметно отражается на состоянии показателя, характеризующего площадь адгезии, вызывая его уменьшение, и практически не сказывается на показателе размера, отражающего агрегационную способность тромбоцитов. Увеличение скорости кровотока сопровождается уменьшением адгезивной способности тромбоцитов и в то же время не приводит к стимуляции агрегатообразования, что наблюдается в необлучённых образцах крови.
Инфракрасный лазер. Как следует из таблицы 7, заметные различия в величине площади покрытия ячейки адгезированными объектами при высокой и низкой скоростях сдвига отмечались только при малой дозе инфракрасного лазерного облучения (7,2 Дж). Так, площадь покрытия ячейки при высокой скорости сдвига была в 1,40 раза больше по сравнению с её значением при низкой скорости сдвига (Р = 0,011). При этом ИСРпл превышал контрольное значение на 49 %. Увеличение дозы предварительного инфракрасного лазерного облучения крови до 18,4, 38,1 и 82,3 Дж не отражалось на эффективности сдвиговой регуляции данного параметра, т.е. статистически значимых различий по показателю площади при высокой и низкой скоростях сдвига в облучённых пробах, равно как и в контрольных образцах, выявлено не было (Р = 0,050, Р = 0,468 и Р = 0,587 соответственно) (рис. 8Б).
В малой и средних дозах (7,2, 18,4 и 38,1 Дж) инфракрасный свет не вызывал существенных изменений эффективности сдвиговой регуляции агрегационной функции тромбоцитов: различия среднего размера агрегатов при низкой и высокой скоростях сдвига, как и в контрольных пробах, оставались статистически значимыми. Так, при облучении крови в дозе 7,2 Дж средний размер агрегатов при повышении скорости сдвига с 200 до 1 800 с-1 возрастал в 1,86 раза (Р 0,001), ИСРразм превышал контрольное значение на 2%. При облучении крови в дозе 18,4 Дж средний размер адгезированных частиц при высокой скорости сдвига был в 2,22 раза больше, чем при низкой (Р 0,001), ИСРразм возрастал на 22% относительно контроля. При облучении крови в дозе 38,1 Дж средний размер тромбоцитарных агрегатов при увеличении скорости сдвига увеличивался в 2,03 раза (Р - 0,002), ИСРразм превышал контрольное значение на 12%. При использовании максимальной дозы инфракрасного лазерного облучения (82,3 Дж) средний размер адгезированных частиц при низкой скорости сдвига практически не отличался от его значения при высокой (Р = 0,051), а ИСРразм снижался относительно контроля на 20 %. Иными словами, при использовании инфракрасного лазерного излучения в малых и средних дозах сохраняется или даже несколько увеличивается стимуляторный характер влияния сдвигового сигнала на агрегацию тромбоцитов. Однако при использовании максимальной дозы инфракрасного лазерного воздействия (82,3 Дж) характер ответа тромбоцитов существенно изменяется: отмечается исчезновение зависимости среднего размера агрегатов от скорости движения крови в ячейке, т.е. возникает своеобразная ареактивность кровяных пластинок к действию сдвигового сигнала.
Таким образом, инфракрасное лазерное излучение в малой дозе повышает эффективность сдвиговой регуляции адгезивной функции тромбоцитов, а в высокой дозе оказывает угнетающее влияние на чувствительность тромбоцитов к сдвиговому сигналу, регулирующему их агрегационную способность.
Синий лазер. Как видно из таблицы 8, заметные различия в величине площади покрытия ячейки адгезированными объектами при высокой и низкой скоростях сдвига отмечались только при малой дозе синего лазерного облучения (5,8 Дж). Так, площадь покрытия ячейки при скорости сдвига 1 800 с" была в 1,71 раза больше по сравнению с её значением при скорости сдвига 200 с-1 (Р = 0,018). При этом ИСРпл превышал контрольное значение на 82 %. Однако при увеличении дозы предварительного облучения крови светом синего лазера до 14,8, 30,7 и 66,3 Дж эффективность влияния сдвигового сигнала на данный параметр не претерпевала существенных изменений по сравнению с контролем, т.е. статистически значимых различий по показателю площади при высокой и низкой скоростях сдвига в облучённых пробах, равно как и в контрольных образцах, выявлено не было (Р = 0,149, Р = 0,253 и Р = 0,166 соответственно) (рис. 8В).
Эффективность сдвиговой регуляции агрегационной способности мало изменялась при облучении крови синим лазером: при всех использованных дозах фотовоздействия различия среднего размера агрегатов при низкой и высокой скорости сдвига, равно как и в контрольных пробах, оставались статистически значимыми.
Влияние НИЛИ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов
На начальном этапе наших исследований были проведены серии экспериментов по изучению влияния НИЛИ на АДФ-индуцированную агрегацию кровяных пластинок, в которых данный агонист использовался в конечной концентрации 5,0 мкМ. Согласно данным литературы эта доза агониста в цитратной ОТП вызывает отчётливую агрегацию и рекомендуется как рабочая доза для оценки агрегационной способности тромбоцитов.
Проведённые исследования показали, что агрегатограмма, иллюстрирующая динамику изменения светопропускания ОТП, при добавлении АДФ в конечной концентрации 5,0 мкМ представляет собой двухволновую кривую. Первая волна (подъём) возникает сразу после введения агониста и отражает быстрый прирост светопропускания до некоторого промежуточного уровня, связанный с непосредственным действием индуктора агрегации на кровяные пластинки. Отличительной особенностью этого начального сегмента агрегатограммы является большой угол наклона кривой, свидетельствующий о том, что максимальная скорость агрегации тромбоцитов развивается уже в течение первых секунд после добавления АДФ. В ряде случаев приросту светопропускания предшествовало начальное кратковременное увеличение оптической плотности, связанное с изменением формы кровяных пластинок, а также с образованием микроагрегатов. Далее следует вторая волна, т.е. подъём агрегатограммы до максимума амплитуды, обусловленный действием различных биологически активных веществ, поступающих из кровяных пластинок в плазму во время реакции освобождения. Угол наклона кривой в этой части агрегатограммы меньше, по сравнению с таковым в начальном отрезке, что говорит о постепенном снижении скорости процесса агрегации тромбоцитов.
Учитывая приведённые выше особенности агрегатограмм, оценку АДФ-индуцированной агрегации кровяных пластинок осуществляли по следующим показателям: амплитуда первой волны (в %), максимальная скорость первой волны (в %/мин), время от момента добавления агониста до начала второй волны (в секундах), максимальная степень агрегации (в %), максимальная скорость второй волны (в %/мин) (рис. 18). Кроме того, определяли максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов (в отн. ед.) и максимальную скорость увеличения размера микроагрегатов (в отн. ед./мин).
Учитывая нормальный характер распределения значений всех изученных параметров АДФ-индуцированной агрегации как в контроле, так и при облучении, по каждому показателю был произведён расчёт выборочного среднего М и выборочного стандартного отклонения s, а также стандартной ошибки выборочного среднего т. Параметры распределения представлены в таблице 18.
При изучении влияния НИЛИ на агрегационную способность тромбоцитов для обеспечения точности сравнительного анализа регистрацию агрегатограмм в контрольных и облучённых образцах ОТП осуществляли синхронно. В результате по каждому показателю был получен ряд парных значений (контроль - лазер), которые составили две связанные группы, т.е. каждому значению показателя из одной группы соответствовало определённое значение из другой. Учитывая нормальный характер распределения разностей пар, для установления статистической значимости изменения показателей применяли парный критерий Стьюдента1.
Из таблиц 18 и 19 следует, что при использовании АДФ в конечной концентрации 5,0 мкМ предварительное лазерное облучение образцов ОТП существенно не влияет на величину показателей агрегации тромбоцитов, оцениваемой по изменению светопропускания.
В то же время изменения показателей, характеризующих образование микроагрегатов, явились статистически значимыми. В частности, отмечалось уменьшение максимального размера микроагрегатов кровяных пластинок: в контроле среднее значение этого параметра составило 11,9 ±3,2 отн. ед., а после фотовоздействия — 8,5 ± 3,0 отн. ед., т.е. на 29 % меньше (рис. 19А). В среднем максимальный размер тромбоцитарных микроагрегатов уменьшался на 3,4 ± 0,6 отн. ед. (Р 0,001).
Похожие диссертации на Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на адгезию и агрегацию тромбоцитов при различных скоростных параметрах движения крови и при изменении рН
