Введение к работе
Актуальность темы. Изучение действия ксенобиотиков на иммунный гомеостаз и возможностей коррекции его нарушений при помощи иммуномодуляторов является одной из наиболее актуальных проблем патофизиологии, иммунологии и токсикологии. Это определяется наличием и использованием в Вооруженных Силах Российской Федерации токсичных химических веществ (военный аспект проблемы), загрязнением окружающей среды экотоксикантами (экологический аспект проблемы), увеличением химически опасных аварий (техногенный аспект), а также ростом отравлений токсичными химическими веществами, формирующих вторичные постинтоксикационные иммунодефицитные состояния (иммуноток-сикологический аспект проблемы), и, наконец, и это один из основных аспектов проблемы, необходимостью уничтожения десятков тонн боевых отравляющих веществ в сооответствии с Конвенцией о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении [Александров В.Н., Емельянов В.И., 1990; Бадюгин И.С. и соавт., 1991; Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982, 1993; Конвенция..., 1993; Хаитов P.M. и соавт., 1995; Калинина Н.И., 2000а; Забродский П.Ф., 1998, 2002; Vos J. G. et al., 1983; Loose L.D., 1985; Miller K. ,1985; Luster M.J. et al., 1987; Sullivan J.B., 1989].
При этом первостепенную важность приобретает вопрос об иммунотоксичности арсенитов - люизита и продуктов его переработки. Это связано с тем, что на арсеналах Министерства обороны Российской Федерации находятся на хранении большие количества мышьяксодержащих веществ: люизита, адамсита, дифеннлхлорарсина и их смесей. Запасы люизита на момент начала его уничтожения согласно Конвенции составляли порядка 7,5 тысяч тонн в местах его хранения в Саратовской и Кировской областях и Удмуртии. На территории Саратовской области находится могильник, содержащий около 3 тысяч тонн адамсита и дифенилхлорарсина. В процессе уничтожения люизита и других мышьяксодержащих отравляющих веществ будет образовываться значительное количество реакционных масс, в состав которых будет входить арсенит натрия. Продукты утилизации боевых отравляющих веществ планируется хранить на территории объектов по уничтожению химического оружия [Алимов Н.И. и соавт., 2000а; 20006; 2000в; Калинина Н.И., 20006; Щербаков А.А. и соавт., 2002].
Современные проекты специализированных объектов по уничтожению химического оружия обеспечивают безопасные условия хранения химического
4 оружия и уничтожения отравляющих веществ, в частности люизита, в штатных режимах их функционирования. Однако при определенных обстоятельствах этот режим их работы может быть нарушен вследствие возникновения природных и стихийных бедствий, техногенных катастроф, а также при террористических актах на объектах по хранению и уничтожению химического оружия. Данные ситуации приведут к загрязнению окружающей среды мышьяксодержащими соединениями, массовому поражению обслуживающего персонала объектов по уничтожению химического оружия и населения близлежащих населенных пунктов [Алимов Н.И. и соавт., 2000а, 2000в].
Влияние боевых отравляющих веществ кожно-нарывного действия, в частности, люизита и продуктов его утилизации на иммунный гомеостаз изучено недостаточно [Горшенин А.В. и соавт., 1998; Рембовский В.Р. и соавт., 2000]. Мышьяксодержащие соединения - люизит и вещества, образующиеся в ходе технологических процессов его переработки (арсенит натрия, треххлористый мышьяк), могут снижать неспецифическую резистентность организма (НРО) и показатели системы иммунитета у персонала объектов по хранению и уничтожению химического оружия, а также у населения, проживающего вблизи данных объектов. Причем, иммунотоксический эффект мышьяксодержащие соединения могут оказывать при воздействии достаточно низких доз ввиду высокой чувствительности иммунной системы к ксенобиотикам [Забродский П.Ф., 2002; Descotes G., 1986, 1987; Luster М. J. et al., 1987].
В настоящее время имеются многочисленные доказательства, полученные в экспериментах in vivo и in vitro, а также в процессе мониторинга за состоянием здоровья, неспецифической резистентностью организма и системой иммунитета лиц, подвергающихся острому и хроническому действию ксенобиотиков, что нарушение иммунного гомеостаза (повреждение популяций и субпопуляций иммуноцитов) токсичными химическими веществами приводит к инфекционным осложнениям и заболеваниям [Забродский П.Ф., 1993, 1998, 2002; Descotes G., 1986, 1987; Luster М. J. et al., 1987; Sullivan J. B, 1989]. Можно полагать, что такой же эффект вызывают люизит и продукты, получаемые при его утилизации.
Данные литературы о влиянии арсенита натрия - одного из наиболее
токсичных продуктов, образующегося в ходе утилизации люизита, на неспецифическую резистентность организма и систему иммунитета практически отсутствуют [П.Ф. Забродский, 2002; Давыдова В.И., 1989;
5 Descotes G., 1986].
He вызывает сомнения тот факт, что нарушения иммунного гомеостаза при остром отравлении мышьяксодержащими соединениями, в частности арсенитами, нуждаются в дальнейшем изучении.
Вопрос о фармакологической коррекции дисфункций системы иммунитета под влиянием люизита и продуктов его деструкции в постинтоксикационном периоде не изучен [Забродский П.Ф., 1998, 2002]. На сегодня необходим выбор наиболее приемлемых иммуностимуляторов из большого арсенала препаратов этой группы, имеющихся в настоящее время. Это позволит проводить научно обоснованную профилактику и лечение возникающих при интоксикациях мышьяксодержащими соединениями, как и при действии многочисленных ксенобиотиков, различных инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний [Шубик В.М., 1976; Хаитов Р. М. и соавг., 1995; Забродский П. Ф., 1986; 1998; Georgiev V. S., Yamaguuchi Н., 1993].
Таким образом, учитывая необходимость уничтожения люизита на объектах по уничтожению боевых отравляющих веществ, существующую возможность поражения работающих- на них лиц и населения близлежащих населенных пунктов в случае аварий, недостаточно изученные особенности токсического действия арсенитов на систему иммунитета, следует заключить, что проблема исследования нарушений неспецифической резистентности и иммунного статуса под влиянием люизита и основного продукта его утилизации - арсенита натрия с целью обоснования способов их коррекции актуальна и важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.
Цель исследования: изучить характер и механизмы нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты в условиях острой интоксикации арсенитами и разработать патогенетически обоснованные принципы медикаментозной коррекции сдвигов иммунного гомеостаза.
Задачи исследования:
1. Провести комплексную оценку состояния неспецифической резистентности организма и специфических иммунных механизмов защиты у крыс при экспериментальной инфекции после острой интоксикации арсенитами
(люизитом и арсенитом натрия) по величине летальности животных, среднелетальной дозы P. vulgaris и среднеэффективному времени жизни животных.
2. Установить закономерности влияния острого отравления люизитом и
арсенитом натрия на состояние неспецифической резистентности организма в
условиях экспериментальной инфекции по величине летальности крыс,
среднелетальной дозы Е. coli и среднеэффективному времени жизни животных.
3. Изучить характер и механизмы воздействия арсенитов на
неспецифическую резистентность организма (показатели бактерицидной
активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима и
фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов).
4. Выявить характер нарушений специфических иммунных механизмов
защиты в эксперименте на животных на фоне воздействия возрастающих доз
мышьяксодержащих соединений по ряду интегральных показателей оценки
функционального состояния центральных и периферических органов иммунной
системы.
5. Изучить особенности влияния возрастающих доз арсенитов на
Т-зависимый гуморальный иммунный ответ в различные фазы антителогенеза
(содержание антителообразующих клеток в селезенке ) и на кооперацию Т- и
В-лимфоцитов.
-
Оценить состояние Т-независймого гуморального иммунного ответа в различные фазы антителообразования по показателям содержания антителообразующих клеток в селезенке в условиях острой интоксикации арсенитами.
-
Выявить характер нарушений клеточного звена иммунного ответа при острой интоксикации, моделируемой возрастающими дозами арсенитов, по комплексу показателей (реакции торможения миграции лейкоцитов, формированию гиперчувствительности замедленного типа, антителозависимой клеточной цитотоксичности, активности естественных клеток-киллеров).
-
Установить патогенетическую роль ацетилхолинэстеразной активности Т-лимфоцитов, содержания эстеразопозитивных клеток в селезенке и перекисного окисления липидов в нарушениях специфических иммунных механизмов защиты под влиянием арсенитов.
-
Разработать патогенетически обоснованную эффективную коррекцию расстройств иммунного гомеостаза при остром отравлении арсенитами с использованием антидота арсенитов и иммуномодуляторов.
7 Научная новизна работы заключается в том, что в ней впервые с позиций реализации Программы по уничтожению химического оружия в результате проведенного эксперимента на животных выявлено, что при остром отравлении арсенитами - люизитом и арсенитом натрия - нарушаются неспецифическая резистентность организма и показатели иммунного статуса.
Нами экспериментально показано, что острая интоксикация арсенитами вызывает дозозависимое увеличение летальности животных от экспериментального перитонита, а также уменьшение среднелетальной дозы микробных тел Е. coli (без предварительной иммунизации) и P.vulgaris (после предварительной иммунизации), среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о снижении неспецифической и иммунологической резистентности организма. Под влиянием арсенитов в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД5о происходит дозозависимое снижение бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточного содержания лизоцима, фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов до б - 9 сут.
Впервые установлено, что под влиянием острой интоксикации люизитом и арсенитом натрия происходит дозозависимое уменьшение числа лимфоцитов в тимусе и селезенке в течение 2-4 сут с последующим восстановлением этих показателей к 8 суткам. После острого действия арсенитов в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 через 2 сут происходит дозозависимое уменьшение числа лимфоцитов и в других органах системы иммунитета и циркулирующей крови. Острое действие арсенитов через 8 сут приводит к дозозависимому уменьшению числа колиниеобразующих единиц в селезенке.
Нами установлено, что после острой интоксикации арсенитами происходит дозозависимое более выраженное снижение Т-зависимого антителообразования (по сравнению с Т-независимым) преимущественно в продуктивный период антителопродукции через 5 и 8 сут после иммунизации, что свидетельствует о снижении функции ТЫ- и Т1і2-лимфоцитов и В-клеток (синтеза IgM и IgG). Под влиянием люизита и арсенита натрия in vitro существенно нарушается кооперация Т- и В-лимфоцитов. Арсениты in vitro в прямой зависимости от концентрации (10 5, 10 и 103 М) снижают кооперацию лимфоцитов, поражая преимущественно Т-клетки.
Экспериментально зарегистрировано, что острое отравление арсенитами приводит к дозозависимому снижению функции Т-клеток и активности естественных клеток-киллеров до 9 сут; реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующей первичный клеточный иммунный ответ и функцию ТЫ-лимфоцитов; антителозависимой клеточной цитотоксичности.
8 Арсениты in vitro в прямой зависимости от концентрации (10 6, 105 и 10 4М) уменьшают активность естественных клеток-киллеров. При этом эффект люизита статистически достоверно превышает действие арсенита натрия (р<0,05).
Нами экспериментально показано, что механизмами иммунотоксичности арсенитов являются снижение активности ацетилхолинэстеразы Т-лимфоцитов тимуса и селезенки, а-нафтил-АБ-ацетатэстеразопозитивных и а-нафтил-бутиратэстеразопозитивных спленоцитов, а также инициация перекисного окисления липидов, что доказано высокими коэффициентами корреляции между показателями перекисного окисления липидов и основными параметрами системы иммунитета.
В экспериментах определено, что при остром отравлении арсенитами -люизитом и арсенитом натрия (1,0 ЛД50) - их антидот унитиол и иммуностимулятор имунофан при изолированном применении повышают основные показатели антиинфекционной неспецифической резистентности организма, гуморального и клеточного звена иммунитета. Комбинированное использование унитиола и имунофана полностью восстанавливает основные показатели неспецифической резистентности организма, Т-, В- звена иммунитета, антителозависимую клеточную цитотоксичность и активность естественных клеток-киллеров.
Практическая значимость работы состоит в том, что нами доказано: в
результате острой интоксикации арсенитами развивается
постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, проявляющееся в дозозависимом снижении показателей неспецифической резистентности организма, специфических иммунологических механизмов защиты, параметров системы гуморального и клеточного иммунитета. Возникающий под влиянием арсенитов иммунодефицит требует применения средств коррекции нарушений неспецифической резистентности организма и иммунного гомеостаза. После острого отравления арсенитами для восстановления неспецифической резистентности организма, основных показателей гуморального и клеточного иммунного ответа целесообразно применять унитиол в комбинации с иммуностимулятором имунофаном.
Положения, выносимые на защиту
1. Острая интоксикация арсенитами - люизитом и арсенитом натрия - в условиях эксперимента на животных в дозах 0,2; 0,5; 1,0 ЛД50 вызьшает прямо связанную с дозой супрессию показателей неспецифической резистентности организма, специфических иммунологических механизмов защиты, основных
гуморальных и клеточных иммунных реакций.
2. При остром отравлении люизитом и арсенитом натрия происходит
дозозависимая супрессия антитело-образования преимущественно к
Т-зависимому антигену, которая более выражена в продуктивной фазе
антителогенеза. Арсениты вызывают редукцию синтеза IgG.
-
Механизмы снижения специфической иммунной защиты под влиянием арсенитов обусловлены снижением содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета, нарушением кооперации Т- и В-лимфоцитов, приводящим к редукции антителообразования вследствие преимущественного поражения Т-лимфоцитов; ингибированием арсенитами ацетилхолинэстеразы Т-клеток тимуса и селезенки, а также а-нафтил-АБ-ацетатэстеразы и а-нафтил-бутиратэстеразы спленоцитов, инициацией мышьяксодержащими соединениями перекисного окисления липидов.
-
Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты после острой интоксикации арсенитами достигается применением антидота мышьяксодержащих соединений унитиола и иммуностимулятора имунофана, которые при комбинированном использовании полностью восстанавливают основные показатели неспецифической резистентности организма, Т-, В- звена системы иммунитета, антителозависимую клеточную цитотоксичность и активность естественных клеток-киллеров.
Апробация работы, публикации. Результаты исследований были доложены на заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (май 2001 г., март 2002 г., февраль 2003 г., апрель 2004 г.), па Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты», СПб, май, 2004 г., юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы корабельной токсикологии, радиологии, обитаемости кораблей и медицинского обеспечения личного состава ВМФ» (СПб, 2004 г.), научно-практических конференциях Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты (2001, 2002, 2003, 2004 гг.), совместном заседании кафедры нормальной физиологии Саратовского государственного медицинского университета, кафедры технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты и кафедры^ токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института (апрель 2004).
10 По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в учебный процесс на кафедре технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты и на кафедре токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института. Материалы исследований широко используются при проведении лекций, практических и лабораторных занятий у курсантов и слушателей курсов повышения квалификации, первичной специализации и усовершенствования врачей. По материалам диссертации издано учебное пособие «Основы токсикологии».
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста (включая таблицы и список литературы), состоит из обзора литературы (глава 1); материалов и методов исследований (глава 2); собственных экспериментальных исследований (главы 3-8); заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 31 таблицей. Список литературы включает 268 наименований, из которых отечественных -188 и зарубежных - 80.
