Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Эпидемиология, коморбидность тревоги и депрессии 14
1.2. Экспериментальное моделирование состояния тревоги и , депрессии у животных: воздействие в раннем постнатальном периоде 17
1.3. Патофизиологические механизмы развития депрессивных и тревожных состояний 23
1.3.1. Депрессия 23
1.3.2. Тревожность 32
1.3.3. Взаимодействие нейротрансмиттерных систем, лежащих в основе патогенеза тревоги и депрессии 36
1.3.4. Роль нейропептидов в патогенезе тревоги и депрессии. Взаимодействие нейропептидов и нейромедиаторов 38
1.4. Фармакологический подход к терапии тревожно-депрессивных расстройств 42
1.5. Пролинспецифические ферменты, участие пептидаз в регуляции физиологических и патологических процессов в организме 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 50
ГЛАВА 3. Динамика поведемеских нарушений у крыс опытных групп 65
3.1. Оценка поведенческих характеристик у крыс опытных групп в сравнении с контролем 65
3.1.1. Определение уровня тревожности в ПКЛ 65
3.1.2. Оценкатревожно-фобического уровня у подопытных крыс с помощью комплексного многопараметрового метода 79
3.1.3. Определение тревожности у крыс по латентности выхода животных из центра «открытого поля» 80
3.1.4. Оценка ориентировочно-исследовательской деятельности крыс в тесте «открытого поля» (с визуальной оценкой поведения) 82
3.1.5. Оценка ориентировочно-исследовательской деятельности крыс в автоматизированном тесте «открытого поля» 85
3.1.6. Оценка депрессивного компонента в поведении крыс в тесте принудительного плавания 87
3.1.7. Оценка суточного потребления жидкости и потребления/предпочтения раствора сахарозы у крыс 95
3.1.8. Определение порога болевой чувствительности у крыс в тесте «Горячая пластина» 100
3.1.9. Оценка зоосоциального взаимодействия у крыс опытных и контрольных групп 102
3.1.10. Оценка сенсомоторной реактивности (эмоциональности) у подопытных крыс в акустическом стартл-рефлексе 104
3.2. Оценка различий в поведении у самцов и самок контрольных групп крыс 106
ГЛАВА 4. Изменение активности пролинспецифических пептидаз в структурах мозга крыс 109
4.1. Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга крыс опытных групп в сравнении с контролем 109
4.2. Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга у самцов и самок контрольных групп 114
ГЛАВА 5. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс 115
5.1. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс опытных групп в сравнении с контролем 115
5.2. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга у самцов и самок контрольных групп 128
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 130
Заключение 154
Выводы 156
Список литературы 158
- Экспериментальное моделирование состояния тревоги и , депрессии у животных: воздействие в раннем постнатальном периоде
- Определение тревожности у крыс по латентности выхода животных из центра «открытого поля»
- Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга крыс опытных групп в сравнении с контролем
- Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс опытных групп в сравнении с контролем
Введение к работе
Актуальность исследования. Депрессия и тревожность, встречаются как самостоятельные нозологические формы, так и совместно (Бурчинский С.Г., 2005; Мосолов С.Н., 2005; Marks I.E., 2001). Более чем у 50% больных депрессией определяются симптомы тревожного расстройства (Haddad P.M., 1995; Ravindran A.V. et al., 1997; Fava M. et al., 2000; Roy-Byrne P.P. et al., 2000). Среди больных с диагнозом тревожного расстройства почти половина удовлетворяет также критериям большой или малой депрессии (Priest R.G., Baldwin D., 1994). Для тревожно-депрессивных расстройств характерны более тяжелые клинические проявления и психосоциальные нарушения, наличие коморбидного состояния ухудшает прогноз заболевания. Большие затраты на лечение смешанного типа тревожно-депресивных нарушений при низкой терапевтической эффективности, длительная нетрудоспособность больных, а также высокий процент попыток суицида при осложненных формах заболевания приводят к резкому снижению качества жизни таких больных и подчеркивают социально-экономическую значимость этой проблемы, занимающей одно из первых мест в рейтинге интегративной оценки социального бремени различных заболеваний в мире через индекс DALY (Desjarlais R. et al., 1995). Клинико-эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что изучение патогенетических механизмов тревожно-депрессивных нарушений, а также поиск новых подходов к их патогенетической терапии представляют собой важную медико-биологическую проблему.
По общепринятым представлениям тревожно-депрессивные расстройства связывают с недостаточностью моноаминергических систем мозга и нарушением взаимодействия нейротрансмиттерных и центральных нейрорегуляторных систем (van Praag Н.М. et al., 1990; Anand A., Charney D.S., 2000; Ressler K.J., Nemeroff СВ., 2000; Nemeroff СВ., 2002; Phillips M.L. et al., 2003; Maletic V., Robinson M. et al., 2007). В настоящее время
8
большую роль в генезе аффективных расстройств отводят участию
пептидергических систем мозга, в частности, нейропептидам (Bingaman
E.W., 1996; van Megen H.J. et al, 1996; Kramer M.S. et al, 1998; Koob G.F.,
1999; Anand A., Charney D.S., 2000; Ressler K.J., Nemeroff СВ., 2000; Gray
T.S., Karl T. et al., 2003). Уровень регуляторных пептидов в организме
определяется эффективностью их процессинга с участием, в том числе
протеолитических ферментов - пептидаз (Mentlein R. et al., 1993, 1999;
Buhling F. et al., 1995; Scharpe S. et al., 2001; Polgar L., 2002). Известно, что
многие нейропептиды, опосредующие эффекты тревоги и депрессии,
являются субстратами пролинспецифических пептидаз -
дипептидилпептидазы-IV (ДП-IV) и пролилэндопептидазы (ПЭП) (Mentlein R. et al., 1993, 1999; Kanai К. et al, 1999; Scharpe S. et al, 2001).
В клинике показано, что изменение активности ПЭП и ДП-IV в сыворотке и плазме крови у больных с аффективными расстройствами связано с состоянием депрессии и тревоги, однако данные о направленности изменения активности этих ферментов противоречивы (Maes М. et al., 1991-2004). В экспериментах на грызунах с недостаточностью ДП-IV, вызванной мутацией гена фермента, выявлено снижение стресс-реактивности (Karl Т. et al., 2003) и уменьшение депрессивно-подобного поведения в стресс-ситуациях (El Yacoubi М. et al., 2006). В недавних исследованиях показано, что развитие экспериментального МФТП-индуцированного состояния у крыс сопровождается повышением активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга (Крупина Н.А. и др., 2006). Приведенные данные позволяют предположить, что дизрегуляция в системе пролинспецифических пептидаз является одним из механизмов развития тревожно-депрессивных расстройств.
В этой связи особый интерес представляют данные об антидепрессантной активности ряда синтетических ингибиторов ПЭП, полученные на экспериментальной модели депрессии в тесте принудительного плавания Порсолта (Золотов Н.Н. и др., 1992а, 19926) и на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного
9 синдрома (Хлебникова Н.Н. и др., 2009). Запатентовано средство для лечения стресса и тревожности, а также депрессивных нарушений, на основе комбинации ингибитора ДП-IV и его субстрата нейропептида Y (Фон Херстен Шт. и др., 2001).
Изложенные факты указывают на актуальность исследования роли пептидаз в патогенезе тревожно-депрессивных нарушений и поиска современных подходов к созданию новых анксиолитиков и антидепрессантов на основе ингибиторов пролинспецифических пептидаз.
Целью исследования явилось изучение эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, вызванных необратимым синтетическим ингибитором дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидином в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, а также определение активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV, уровня моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс.
Задачи исследования:
Изучить изменения поведения крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных, подвергнутых субхроническому введению ингибитора ДП-IV метионил-2(8)-цианопирролидина (Met-Prd-N) в раннем постнатальном периоде, в тестах на определение уровня тревожности (приподнятый крестообразный лабиринт, тест «открытого поля», специализированная шкала для оценки тревожно-фобического состояния у крыс).
Изучить изменения поведения крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных, после субхронического введения ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде, в тестах на наличие депрессивно-подобного состояния (тест принудительного плавания, оценка суточного потребления жидкости и потребления/предпочтения раствора сахарозы).
Изучить изменения двигательной активности в тестах «открытого поля», сенсомоторной реактивности в акустическом стартл-
10 рефлексе и болевой чувствительности в тесте «Горячая пластина» у крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных после введения ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.
Исследовать эффекты однократного введения диазепама на уровень тревожности у крыс с эмоционально-поведенческими нарушениями, вызванными ингибитором ДП-IV Met-Prd-N в условиях его введения в раннем постнатальном периоде.
Исследовать эффекты субхронического введения ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина (Z-Met-Prd-N) на проявления депрессивно-подобного поведения у крыс с эмоционально-поведенческими нарушениями, вызванными ингибитором ДП-IV Met-Prd-N в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, в сравнении с эффектами трициклического антидепрессанта имипрамина.
Изучить изменение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV флуорометрическим методом во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе в динамике развития эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.
Изучить уровень моноаминов и их метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе в динамике развития эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.
Научная новизна. Впервые получены данные о том, что модуляция активности фермента дипептидилпептидазы IV путем введения в раннем
постнатальном периоде его синтетического ингибитора метионил-2(8)-цианопирролидина вызывает у крыс обоего пола длительные нарушения поведения, проявляющиеся в развитии тревоги и депрессии. Показано, что динамика развития тревожно-депрессивного состояния у самцов и самок различна. Фармакологический анализ тревожно-депрессивного состояния у крыс, подвергнутых субхроническому введению ингибитора ДП-IV в постнатальном периоде, в совокупности с характером эмоционально-поведенческих нарушений позволяет рассматривать такие изменения поведения в качестве новой модели тревожно-депрессивных состояний у крыс. На данной модели обнаружены антидепрессивные свойства нового синтетического ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина.
Установлено, что развитие экспериментального тревожно-депрессивного состояния, вызванного введением ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде, сопровождается повышением активности пролинспецифических пептидаз - ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих развитие эмоционально-поведенческих расстройств, -фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе. На всех этапах развития тревожно-депрессивного состояния у крыс в этих структурах выявлены изменения в состоянии серотонинергической, норадренергической и дофаминергической систем мозга, различные у самцов и самок. У самцов в динамике обследования наблюдается снижение функциональной активности нигростриатной и мезолимбической дофаминергических систем и повышение активности норадренергической системы в гипоталамусе на поздних сроках. У самок в динамике обследования наблюдается снижение функциональной активности мезолимбической и нигростриатной дофаминергических систем и повышение активности серотонинергической системы в гиппокампе и коре мозга.
12 Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о патофизиологических механизмах развития аффективных расстройств по типу тревоги и депрессии, подчеркивая важную роль дизрегуляции активности пролинспецифических пептидаз. Результаты исследования открывают новые подходы к разработке комплексной патогенетической терапии тревожно-депрессивных состояний на основе использования ингибиторов пролилэндопептидазы и являются основой для поиска новых препаратов - ингибиторов ПЭП, обладающих антидепрессантной активностью.
Новая модель тревожно-депрессивного состояния у крыс, вызванная ингибитором ДП-IV метионил-2(8)-цианопирролидином в условиях его введения в ранний постнатальный период, может быть использована для дальнейшего изучения патофизиологических механизмов тревоги и депрессии и скрининга новых фармакологических соединений с антидепрессантными и анксиолитическими свойствами. Положения, выносимые на защиту:
Ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин в условиях его субхронического постнатального введения крысам вызывает эмоционально-поведенческие расстройства типа тревожно-депрессивного состояния в подростковом возрасте и у взрослых животных.
Тревожно-депрессивное состояние у крыс сопровождается повышением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV, а также изменением функционального состояния серотонинергической, норадренергической и дофаминергической систем в структурах мозга.
Ингибитор пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин подавляет признаки депрессивно-подобного поведения у крыс, подвергнутых постнатальному введению ингибитора дипептидилпептидазы IV.
13 Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов (Санкт-Петербург, 2007), на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на XIV Всемирном конгрессе по психиатрии (Чешская республика, Прага, 2008).
Экспериментальное моделирование состояния тревоги и , депрессии у животных: воздействие в раннем постнатальном периоде
Экспериментальное моделирование патологий у животных является одним из важных инструментов изучения нейробиологических механизмов, лежащих в основе развития разных психоневрологических расстройств, и открывает новые возможности разработки патогенетической терапии этих нарушений. Одним из главных вопросов на пути создания новых моделей патологии ЦНС является вопрос об адекватности модели ее клиническому прообразу (Willner Р., 1995; McArthur R., Borsini F., 2006). По мнению большинства исследователей, модель патологии нервной системы, как и любая другая модель, не может полностью отражать нозологическую форму заболевания (Segal D.S., Geyer M.A., 1985; Phillips M.L. et al., 2003); обычно их рассматривают как модели специфических синдромов или даже симптомов, характерных для разных типов психических нарушений.
Структурно-функциональные системы мозга, ответственные за эмоциональное реагирование и подкрепление, формируются во второй половине беременности и в раннем постнатальном периоде, совпадающих со временем синаптогенеза основных нейромедиаторных систем, обеспечивающих эмоциональность (дофамин-, серотонин-, норадренергических систем) (Шабанов П.Д. и др., 2006). Вмешательство в раннем онтогенезе в развитие тех или иных центральных систем может влиять на развитие мозга и вызывать у взрослых животных изменения эмоционально-мотивационного поведения (Heim С. et al., 2004; Card J.P. et al., 2005; Cassano P. et al., 2006). Исследования с использованием нейротоксина 6-гидроксидофамина, вводимого в пре- или постнатальный период крысам, позволили выделить «критические» периоды в созревании подкрепляющих систем мозга - для крыс этим периодом оказался интервал между третьим триместром беременности и 17 постнатальным днем (Шабанов П.Д. и др., 2002а, 20026). Аверсивные воздействия в этот период, очевидно, приводят к наиболее тяжелым нарушениям поведения у животных.
В настоящее время получило широкое распространение представление о психических расстройствах (в том числе, тревоги и депрессии) как о расстройствах развития ЦНС (neurodevelopmental disorders [Hansen H.H. et al., 1997; Heim Ch. et al, 2004; Mathew SJ. et al., 2008]). В контексте этих представлений для экспериментального моделирования эмоционально-поведенческих расстройств путем вмешательства в процессы становления функций нервной системы используют различные подходы - вмешательство с использованием фармакологических препаратов (Gray J.D. et al., 2007), психоэмоциональное воздействие, изменение экспрессии генов и др.
Примером фармакологического подхода служит модель депрессии у животных, вызываемая с помощью вещества, обладающего свойствами антидепрессанта, кломипрамина, вводимого в «критический» период - с 8-21 постнатальные дни (Vogel G. et al., 1990; Hansen H.H. et al., 1997; Andersen S.L. et al., 2002; Feng P. et al., 2003). Введение вещества крысятам по указанной схеме приводит к возникновению депрессивноподобных симптомов у взрослых крыс (продепрессивный парадоксальный эффект). Если адекватность модели подтверждена сходством характера наблюдаемых у животных поведенческих расстройств с клинической симптоматикой заболевания и ее адекватность доказана фармакологическими методами, то такая модель становится эффективным инструментом в изучении патогенеза моделируемых эмоционально-поведенческих расстройств. В приведенном примере на хорошо разработанной модели депрессивно-подобного поведения у крыс, вызванного постнатальным введением кломипрамина, получены новые данные о молекулярных механизмах развития депрессивных состояний (Cassano P. et al., 2006). Фармакологический подход относится к числу наиболее часто используемых подходов в экспериментальном моделировании патологии ЦНС. С его помощью созданы модели депрессии и тревоги у животных, вызываемые путем постнатального введения 5,7-дигидрокситриптамина (Kostowski W. et al., 2003), кортикостерона (Gregus А. et al, 2005), алкоголя (Allen G.C. et al., 2005), галанина (Lu X. et al., 2008), парахлорфенилаланина (Vataeva L.A. et al., 2007), фактор некроза опухоли a (Зубарева O.E., Клименко В.М., 2008) и др.
Последствия психоэмоционального воздействия на развитие особей могут быть различны: от формирования стойких эмоционально-поведенческих нарушений до стресс-протективных эффектов. Известно, что забота о потомстве лежит в основе неонатального развития, формирования поведенческих и физиологических реакций у младенцев. Снижение/отсутствие материнской заботы в ранний неонатальный период может приводить к различным нейропсихиатрическим нарушениям, таким как тревожные расстройства в раннем подростковом периоде, расстройству личности и депрессивно-подобным состояниям (Lee H.J. et al., 2001). Примером психоэмоционального воздействия на животных в ранний постнатальный период может служить формирование повышенной чувствительности нервной системы к стрессирующим воздействиям в условиях полной изоляции детенышей от самки, что повышает риск развития стресс-индуцированной депрессии (van den Hove D.L. et al., 2006), а также ряда других нарушений поведения и когнитивных функций у половозрелых особей (Erabi К. et al., 2007).
Однако, важную роль играет длительность изоляционного воздействия: отнятие крысят от матери в ранний постнатальный период на небольшой интервал времени с последующим возвратом в клетку в отличие от длительной изоляции провоцирует у самки большую заботу о потомстве, что формирует у половозрелых животных большую устойчивость к стресс-воздействиям, снижая вероятность развития у них депрессивно-подобных нарушений (Fenoglio К.А. et al., 2005).
Этиологическим фактором развития эмоционально-поведенческих расстройств, вплоть до патологической тревожности и депрессии, может служить не только постнатальный стресс, но и стресс, перенесенный матерью во время беременности (Talge N.M. et al., 2007). В эксперименте показано, что психологический стресс у самки крыс линии Sprague-Dawley в последнем триместре беременности, вызванный наблюдением за другой крысой, которую подвергали электрошоковой стимуляции, приводит к повышению у потомства эмоциональности в тесте открытого поля, появлению признаков депрессивно-подобного поведения в тесте принудительного плавания, увеличению активности ГГА-оси (Abe Н. et al., 2007).
Определение тревожности у крыс по латентности выхода животных из центра «открытого поля»
Оценка ориентировочно-исследовательской деятельности крыс в тесте «открытого поля» (с визуальной оценкой поведения). В возрасте 1 мес. при сравнении показателей самцов опытной и контрольной групп не выявлено статистически значимых различий в ориентировочно-исследовательской деятельности (II серия: двигательная активность -контроль - 39,5±5,9 кв.; опыт - 26,7±3,8 кв.; F(3,55)=2,61, р=0,063, NS; исследовательская активность - контроль - 3,4±0,7 ст.; опыт - 1,6±0,5 ст.; F(3,55)=2,19,p=0,105,NS).
В возрасте 2 мес. не выявлено статистически значимых различий в ориентировочно-исследовательской деятельности (двигательная активность -I серия: контроль - 54,6±6,2 кв., опыт - 35,8±6,9 кв., F(3,31)=4,51, р=0,032, по тесту Н-К р=0,085, NS; II серия: контроль - 28,4±6,6 кв., опыт - 27,9±5,0 кв., F(3,25)=10,55, р=0,000, по тесту Н-К р=0,942, NS; исследовательская активность - I серия: контроль - 7,2±1,8 ст., опыт - 3,8±1,0 ст., F(3,31)=3,92, р=0,023, по тесту Н-К р=0,237, NS; II серия: контроль - 4,3±2,1 ст., опыт -2,7±0,9 ст., F(3,25)=0,85, р=0,483, NS). В возрасте 3 мес. также не выявлено статистически значимых различий в ориентировочно-исследовательской деятельности (двигательная активность -1 серия: контроль - 45,9±4,8 кв., опыт - 31,0±3,1 кв., F(3,31)=4,54, р=0,015, по тесту Н-К р=0,110, NS ; II серия: контроль - 23,1±5,6 кв., опыт - 32,1±3,4 кв., F(3,25)=3,08, р=0, 045, по тесту Н-К р=0,21, NS; исследовательская активность - I серия: контроль — 4,2±1,0 ст., опыт - 3,8±1,1 ст., F(3,31)=0,90, р=0,455, NS ; II серия: контроль - 3,4±0,9 ст., опыт - 2,1±0,4 ст., F(3,25)=2,ll, p=0,127,NS). В возрасте 4 и 7 мес. статистически значимых различий не выявлено (4 мес., I серия - двигательная активность: контроль - 32,4±5,7 кв., опыт -22,4±3,3 кв., F(3,29)= 1,91, р=0,159, NS; - исследовательская активность: контроль - 2,9±1,0 ст., опыт - 2,1±0,4 ст., F(3,29)=3,12, р=0,044, по тесту Н-К р=0,514, NS; 7 мес, двигательная активность - I серия: контроль - 13,5±3,9 кв., опыт - 19,8±3,9 кв., F(3,29)=3,59, р=0,033, по тесту Н-К р=0,274, NS; исследовательская активность - контроль — 1,0±0,4 ст., опыт — 0,9±0,3 ст., F(3,29)=6,13, р=0,002, по тесту Н-К р=0,935, NS). В возрасте 1 мес. во II серии у подопытных самок не выявлено статистически значимых отличий от показателей ориентировочно-исследовательской деятельности в контроле (двигательная активность — контроль - 35,6±3,2 кв., опыт - 42,1±4,1 кв., данные дисперсионного анализа (F,p) для этого параметра приведены при сравнении результатов подопытных и контрольных самцов той же серии и возраста; исследовательская активность - контроль - 3,7±0,7 ст., опыт - 3,5±0,8 ст.). В возрасте 2 мес. у подопытных самок в I серии отмечено снижение исследовательской активности (I серия: контроль - 10,1±1,8 ст., опыт — 4,7±0,8 ст., по тесту Н-К р=0,037; II серия: контроль - 5,6±2,0 ст., опыт -5,5±1,1 ст., NS); статистически значимых различий в двигательной активности не выявлено (I серия: контроль - 72,3±8,6 кв., опыт - 56,6±7,1 кв., по тесту Н-К р=0,158, NS ; II серия: контроль - 60,9±3,4 кв., опыт - 46,5±3,2 кв., по тесту Н-К р=0,052, NS). В 3 мес. у подопытных самок в одной из серий выявлено увеличение двигательной активности (II серия: контроль - 28,6±5,1 кв., опыт - 45,8±7,4 кв., по LSD-тесту р=0,03; I серия: контроль - 46,6±8,1 кв., опыт - 63,0±10,7 кв., по LSD-тесту р=0,16, NS); статистически значимых различий в исследовательской активности не отмечено (I серия: контроль - 6,1±0,9 ст., опыт- 4,4±0,8 ст.; II серия: контроль - 4,1±1,1 ст., опыт - 5,7±1,7 ст.). В 4 мес. в I серии статистически значимых различий не выявлено (двигательная активность - контроль - 39,1±6,7 кв., опыт - 27,5±7,3 кв.; исследовательская активность - контроль - 3,9±0,7 ст., опыт - 5,5±1,5 ст., по тесту Н-К p=0,178,NS). В 7 мес. в I серии у подопытных самок отмечено увеличение исследовательской активности (контроль - 1,б±0,5 ст., опыт - 4,5±1,4 ст., по тесту Н-К р=0,003; статистически значимых различий в двигательной активности не выявлено - контроль — 34,0±2,4 кв., опыт - 24,0±7,0 кв., по тесту Н-К р=0,162, NS). Сравнение показателей ориентировочно-исследовательской деятельности у самцов и самок контрольной группы В возрасте 1 мес. II серия не выявлено статистически значимых различий в двигательной и исследовательской активности (данные средних значений и дисперсионного анализа для сравнения самцов и самок представлены в соответствующих разделах выше). В возрасте 2 мес. у самок во II серии отмечено превышение двигательной активности (II серия: по тесту Н-К р=0,000; I серия: по тесту Н-К р=0,238, NS); статистически значимых различий в исследовательской активности не отмечено (I серия: по тесту Н-К р=0,167, NS). В 3 мес. статистически значимых различий между самцами и самками по обоим показателям не отмечено (двигательная активность — I серия: по тесту Н-К р=0,940, NS; II серия: по тесту Н-К р=0,470, NS; исследовательская активность - см. данные дисперсионного анализа выше). В 4 мес. статистически значимых различий не выявлено (I серия: исследовательская активность, по тесту Н-К р=0,414, NS, двигательная активность - см. данные дисперсионного анализа выше). В 7 мес. у самок по сравнению с самцами отмечено превышение двигательной активности (I серия: по тесту Н-К р=0,020); статистически значимых различий в исследовательской активности не отмечено, по тесту Н-Kp=0,539,NS).
Оценка ориентировочно-исследовательской деятельности крыс в автоматизированном тесте «открытого поля». В возрасте 1 мес. у самцов опытной группы по сравнению с контролем только в одной из серий отмечено увеличение горизонтальной активности (III серия: контроль -722,0±52,2 см, опыт - 885,1±58,1 см, F(l,50)=4,36, р=0,040, по тесту Н-К р=0,041; I серия: контроль - 745,7±52,1 см, опыт - 704,0±55,4 см, F(3,31)=l,07, р=0,382, NS ; II серия: контроль - 610,8±104,0 см, опыт -559,4±93,2 см, F(3,55)=l,23, р=0,315, NS); статистически значимых различий в вертикальной активности не отмечено (I серия: контроль - 20,6±2,5 ст., опыт - 20,4±2,8 ст. , F(3,31)=1,53, р=0,236, NS; II серия: контроль - 8,2±2,1 ст., опыт - 8,7±2,0 ст., F(3,55)=1,97, р=0,130, NS; III серия: контроль -13,0±1,6 ст., опыт- 13,8±1,4 ст., F(l,50)=0,12, р=0,738, NS).
В возрасте 2 мес. у подопытных самцов в I серии отмечено снижение горизонтальной активности (I серия: контроль - 666,4±46,0 см, опыт -457,1±26,2 см, F(3,31)=7,65, р=0,000, по тесту Н-К р=0,014; II серия: контроль - 425,6±89,1 см, опыт - 446,8±28,7 см, F(3,26)=3,12, р=0,043, по Н-К р=0,868, NS; III серия: контроль - 468,3±28,1 см, опыт - 425,7±26,2 см, F(l,50)=1,26, р=0,270, NS); снижение исследовательской активности (I серия: контроль -22,3±1,2 ст., опыт- 17,9±1,6 ст., F(3,31)=5,23, р=0,005, по LSD-тесту р=0,030; II серия: контроль - 12,9±3,1 ст., опыт - 14,6±1,4 ст., F(3,26)=l,47, р=0,257, NS; III серия: контроль - 16,5±1,40 ст., опыт - 14,7±1,0 ст., F(l,50)=1,11, р=0,307, NS).
Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга крыс опытных групп в сравнении с контролем
Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что синтетический ингибитор ДП-IV неконкурентного типа метионил-2(8)-цианопирролидин в условиях его внутрибрюшинного введения в раннем постнатальном периоде вызывает у крыс стойкие нарушения поведения по типу усиления тревоги и депрессии.
Об усилении тревожности у подопытных крыс свидетельствует изменение поведения животных в тесте ПКЛ, увеличение латентного периода выхода из центра «открытого поля», а также увеличение балла тревожности при оценке тревожно-фобического уровня у крыс с помощью специализированного комплексного метода, основанного на использовании ранжированной шкалы поведенческих ответов животных в батарее этологически адекватных тестов. О наличии депрессивного компонента в поведении крыс свидетельствует развитие состояния «поведенческого отчаяния» и нарушение ритмологической структуры плавательного поведения в тесте принудительного плавания, а также появление у животных признаков транзиторной агедонии и снижения питьевой мотивации - одной из основных жизненно важных мотиваций.
Для оценки повышения уровня тревожности в ПКЛ в настоящем исследовании мы применили некоторые показатели, которые обычно не рассматриваются в данном тесте - число свешиваний с центральной площадки ПКЛ и из ЗР (с открытых торцов рукава), число оценок риска (по выглядыванию из открытых торцов ЗР), а также показатель времени пребывания в центре лабиринта, интерпретация которого не однозначна. В исследованиях других авторов факторным анализом ранее выявлено, что такие показатели как заходы и время в ОР, предпочтение ОР относятся к одному и тому же фактору, связанному с тревожностью, - чем они больше, тем менее тревожно животное, при этом, показатели, характеризующие одно и то же состояние, как правило, положительно коррелируют (Cruz А.Р. et al., 1994). В наших исследованиях отмечена положительная взаимосвязь между показателями из данной группы, с одной стороны, и числом свешиваний из ЗР, Ц и временем в Ц, с другой стороны. На этом основании указанные показатели, с определенной степенью условности, можно рассматривать как показатели, увеличение которых характерно для менее тревожных крыс. Однако нельзя исключить возможный вклад таких показателей как свешивания из ЗР и Ц в характеристику двигательной активности животных, а показателя времени в центре ПКЛ - в характеристику когнитивной деятельности, например, скорости принятия решения в условиях конфликта мотиваций (исследования и страха) (Rodgers R.J., Johnson N.J., 1995). Интерпретация показателя числа оценок риска менее ясная. Корреляции с активностью крыс в ЗР позволяют относить его к группе показателей, отражающих уровень двигательной активности крыс, однако, нами не было выявлено его взаимосвязи с двигательной активностью в ОР. Тем не менее, этот показатель высок у крыс, охарактеризованных как тревожные по другим тестам. Во всех трех сериях были выявлены признаки повышения тревожности у самцов в возрасте 1 мес. в ПКЛ. Признаки тревожности у самцов были обнаружены также в возрасте 1 мес. (II и III серии) и 2 мес. (II серия) по увеличению латентного периода выхода из центра «открытого поля», в возрасте 2 и 7 мес. (I серия) - по увеличению балла тревожности по шкале тревожно-фобических состояний у крыс. У самок результаты оценок уровня тревожности были менее стабильны. В ПКЛ признаки тревожности у них были выявлены в I и II сериях, причем, в I серии — в возрасте 1 и 3 мес, а во II серии - в возрасте 2 мес. По другим тестам признаков тревожности в приведенные сроки обследования выявить не удалось. Хронологический анализ изменения уровня тревожности и двигательной активности крыс позволяет заключить, что повышение показателей тревожности, основанных на невыполнении животными тех или иных действий, не может быть отражением изменения двигательной активности. В возрасте 1 мес, при выраженной тревожности в тесте ПКЛ, у самцов не было обнаружено снижения двигательной активности в тестах «открытого поля» (см. ниже, табл. 19). В возрасте 2 мес. в I серии снижение двигательной активности у самцов крыс было выявлено только в автоматизированном тесте оценки ориентировочно-исследовательской деятельности, при этом признаков тревожности по двум из трех тестов на тревожность (ПКЛ и латентность выхода из центра «открытого поля») не было обнаружено. У самок признаки тревожности в ПКЛ в возрасте 1 и 3 мес. (I серия) и в возрасте 2 мес. (II серия) не сопровождались снижением ориентировочно-исследовательской деятельности в тестах «открытого поля». Проведенное сопоставление изменений уровня тревожности в ПКЛ и ориентировочно-исследовательской деятельности в тестах «открытого поля» не подтверждает предположения о том, что показатели свешивания из ЗР и Ц ПКЛ отражают уровень двигательной активности животных. До введения диазепама, помимо различий по общепринятым показателям тревожности в ПКЛ, у подопытных самцов отмечали уменьшение числа свешиваний из центра лабиринта и из ЗР по сравнению с контролем. Анксиолитик диазепам нивелировал различия в группах по всем показателям. Кроме того, при внутригрупповом сравнении диазепам уменьшал число оценок риска у подопытных крыс и увеличивал число свешиваний из ЗР у контрольных животных. На основании этих данных можно считать применение таких показателей как число свешиваний с центральной площадки лабиринта и из ЗР, число оценок риска (по выглядыванию из открытых торцов ЗР) адекватными для оценки состояния тревожности у крыс в ПКЛ. Уменьшение числа заходов в ОР у крыс контрольной группы после введения диазепама при неизменности времени пребывания в ОР и отсутствии изменений в предпочтении ОР, по-видимому, могут отражать изменение характера исследовательской активности на фоне действия диазепама.
Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс опытных групп в сравнении с контролем
В настоящем исследовании показано, что необратимый синтетический ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин, в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, вызывал стойкие эмоционально-поведенческие расстройства у крыс, проявлявшиеся в усилении тревожности и депрессивно-подобного поведения. Динамика эмоционально-мотивационных нарушений у самцов и самок была различна, что, по-видимому, обусловлено влиянием половых гормонов. Изменения в поведении сопровождались повышением активности протеолитических ферментов ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих эмоциональное поведение, а ингибитор ПЭП купировал проявление депрессивного поведения. Взаимосвязь в изменении активности пептидаз и поведенческих проявлений свидетельствует о вовлеченности ПЭП и ДП-IV в генез тревожно-депрессивных нарушений.
Изменения уровня моноаминов и функциональной активности основных моноаминергических систем мозга прослеживались, начиная с подросткового периода, вплоть до зрелого возраста. В раннем подростковом периоде у самцов изменения активности пептидаз и ДА-ергической системы наблюдались в разных структурах мозга, тогда как изменения состояния других моноаминергических систем не были выявлены. В этот же период у самок изменения активности обеих пептидаз в гиппокампе сопровождались увеличением оборота 5-ОТ, а повышение активности ДП-IV в прилежащем ядре выявлялось одновременно с недостаточностью ДА-системы. У молодых половозрелых крыс на фоне отсутствия статистически значимых изменений в активности пептидаз у самцов сохранялась недостаточность ДА-системы в стриатуме, а у самок при сохранении недостаточности ДА-системы в прилежащем ядре было выявлено снижение активности этой системы также в гиппокампе и гипоталамусе. У зрелых крыс-самцов повышение активности ДП-IV в прилежащем ядре сопровождалось снижением метаболизма ДА (также как и у самок в подростковый период), повышение ДП-IV в гипоталамусе выявлялось одновременно с повышением уровня НА, однако увеличение активности пептидаз во фронтальной коре и гиппокампе не сопровождались изменениями состояния изученных моноаминергических систем. В том же возрасте у самок сохранялся повышенный оборот 5-ОТ при отсутствии, в отличие от подросткового возраста, изменений в активности обеих пептидаз, увеличение уровня 5-ОТ во фронтальной коре не сопровождалось изменениями в активности пептидаз. По нашему мнению, представляется важным тот факт, что в позднем возрасте наличие эмоционально-поведенческих расстройств у самцов и самок происходит на фоне одновременного увеличения активности обоих ферментов и выраженной недостаточности ДА-системы в стриатуме. В научной литературе существуют редкие свидетельства того, что изменения концентрации катехоламинов в ЦНС могут оказывать регулирующее влияние на активность дипептидилпептидаз в мозге крыс (Imai К. et al., 1984). В наших исследованиях не получено прямого хронологического подтверждения изменений в активности пептидаз и состояния моноаминергических систем мозга, однако наши данные не позволяют исключить такого взаимодействия. В пользу возможной взаимосвязи между этими системами свидетельствует факт увеличения активности пептидаз и снижения активности ДА-системы в стриатуме у крыс в зрелом возрасте. В целом, можно предположить, что дизрегуляция в системе пролинспецифических пептидаз, в системе моноаминов и их взаимодействия вносит вклад в генез эмоционально-поведенческих расстройств типа тревожно-депрессивных состояний.
На основании полученных данных о повышении активности пептидаз в структурах мозга крыс с усилением признаков тревоги и депрессии в поведении и эффективности ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил метионил-2(8)-цианопирролидина в предотвращении развития депрессивного состояния у животных можно полагать, что поиск новых фармакологических средств, обладающих свойствами антидепрессантов и анкиолитиков, среди ингибиторов пролинспецифических пептидаз может быть перспективным. 1. Синтетический ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин при введении в дозе 1,0 мг/кг в раннем постнатальном периоде (5-18 дни) вызывал появление признаков тревожности и депрессивно-подобного поведения у крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных. 2. Развитие тревожно-депрессивного состояния у крыс обоего пола, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-IV, сопровождалось повышением активности пролинспецифических пептидаз пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга - во фронтальной коре, стриатуме, прилежащем ядре, гиппокампе и гипоталамусе. 3. Развитие тревожно-депрессивного состояния у крыс обоего пола, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-IV, сопровождалось изменением состояния моноаминергических систем мозга - дофаминергической, серотонинергической и норадренергической систем - во фронтальной коре, стриатуме, прилежащем ядре, гиппокампе и гипоталамусе. 4. Бензодиазепиновый транквилизатор диазепам при остром внутрибрюшинном введении в дозе 0,5 мг/кг уменьшал проявление признаков тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте у самцов крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV в раннем постнатальном периоде. 5. Трициклический антидепрессант имипрамин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 10,0 мг/кг подавлял проявление признаков депрессивности в тесте принудительного плавания у самцов крыс, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-IV. 6. Синтетический ингибитор пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 2,0 мг/кг подавлял проявление признаков депрессивности в тесте принудительного плавания у самцов крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV в раннем постнатальном периоде. Результаты свидетельствуют о наличии антидепрессантых свойств у ингибитора ПЭП. 7. Результаты исследования позволяют рассматривать длительные эмоционально-поведенческие нарушения у крыс, вызванные ингибитором ДП-IV в условиях его постнатального введения, как новую экспериментальную модель тревожно-депрессивного состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что дизрегуляционное повышение активности пролинспецифических пептидаз в ЦНС может быть патогенетическим механизмом развития тревоги и депрессии, а ингибиторы пролилэндопептидазы могут быть эффективны в комплексной патогенетической терапии тревожно-депрессивных расстройств.
