Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные этиопатогенетические аспекты невынашивания беременности 12
1.2. Роль рецепторов к эстрогенам и прогестерону в эндометрии, изменения его стероидрецепторного аппарата при привычном невынашивании беременности и механизмы формирования репродуктивных нарушений 17
1.3. Морфофункциональные изменения в эндометрии на протяжении менструального цикла и особенности эндометрия при привычном невынашивании беременности 23
1.4. Роль гуморального и клеточного иммунитета в патогенезе привычного невынашивания беременности 28
1.5. Современные принципы применения прогестагенов и комбинированных эстроген-гестагенных препаратов в акушерско-гинекологической практике 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Материал исследования 45
2.2. Специальные методы исследования
2.2.1. Определение содержания эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови 47
2.2.2. Определение концентрации интерлейкинов-13, 4, 6, ИНФ-у в сыворотке крови пациенток исследуемых групп 48
2.2.3. Иммуногистохимический метод исследования стероидных рецепторов эндометрия 49
2.2.4. Патоморфологическое исследование эндометрия 51
2.2.5. Статистические методы обработки полученных результатов Резюме 52
Глава 3. Собственные результаты 53
3.1. Клиническая характеристика обследуемых групп 53
3.2. Концентрация цитокинов в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности
3.2.1. Концентрации цитокинов в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности до предгравидарной подготовки 67
3.2.2. Концентрации цитокинов в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности в динамике предгравидарной подготовки 75
Резюме 86
Глава 4. Иммуногистохимический анализ и патоморфологическая характеристика эндометрия у женщин с привычным невынашиванием беременности на фоне предгравидарной подготовки 89
Резюме 102
Глава 5. Обсуждение результатов 104
Выводы 115
Практические рекомендации 117
Список литературы 118
- Современные этиопатогенетические аспекты невынашивания беременности
- Морфофункциональные изменения в эндометрии на протяжении менструального цикла и особенности эндометрия при привычном невынашивании беременности
- Определение содержания эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови
- Концентрация цитокинов в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности
Введение к работе
Актуальность темы
В условиях современного индустриального общества, характеризующегося процессами старения популяции, снижения рождаемости, одной из важнейших медико-социальных проблем, настоятельно требующей своего решения, является повышение качества репродуктивного здоровья женщин. В программных документах, определяющих актуальные направления развития современной медицинской науки, указывается, что приоритетными в области патологической физиологии, иммунологии, акушерства и гинекологии являются исследования, направленные на снижение материнской, перинатальной и детской смертности, повышение эффективности лечения невынашивания беременности, профилактики бесплодия, аутоиммунной патологии при беременности и др, в основе которых часто лежат инфекционно-воспалительные заболевания внутренних половых органов женщин.
Частота привычного невынашивания беременности (ПНБ) стабильно высока и, по данным ВОЗ, составляет 2—4 % исходов всех беременностей, причем большинство потерь - в раннем эмбриональном периоде. Каждая потеря беременности отрицательным образом сказывается на состоянии репродуктивной системы как за счет последствий самого прерывания беременности, так и проведения инвазивных процедур, усугубляя те патологические процессы, которые приводят к невынашиванию (Си-дельникова В.М., 2006). Несмотря на многочисленные исследования в этой области и достижения современной науки, некоторые вопросы, касающиеся патогенеза ПНБ, остаются мало изученными, что определяет возможность их дальнейшего изучения (Демидова Е.М. и соавт., 1991; Побединский Н.М. и соавт., 2000; Mertens HJ. et al., 2000).
В последние годы все больше подтверждений находит представление о важности взаимодействия фетальных и материнских тканей в сохранении беременности (Милованов А.П., 1999; Болтковская Н.М., 2001). Имплантация
эмбриона является естественной кульминацией менструального цикла, но успех нидации требует определенной готовности к этому как эмбриона, так и эндометрия. Ключевым гормоном, индуцирующим экспрессию многочисленных генов стромы и эпителия желез в течение секреторной фазы цикла и беременности - является прогестерон. Этот гормон играет черезвычайно важную роль в поддержании беременности, вызывает децидуальные превращения эндометрия, способствует росту и развитию миомитрия, его васкуля-ризации, поддерживает миометрий в состоянии покоя путем нейтрализации действия окситоцина (Сидельникова В.М., 2006).
Известно, что привычное невынашивание является полиэтиологическим осложнением течения беременности, ведущими факторами в возникновении и реализации которой являются нарушения иммуно-эндокринной регуляции, которые, зачастую, реализуются в рамках прогестероновой недостаточности и дисбаланса биологически активных медиаторов иммунных и межклеточных взаимоотношений - цитокинов (Шехтман М.М., Варламова Т.М., Бурдули Г.М., 2001; Сухих Г.Т. Ванько Л.В., 2003; Сидельникова В.М., 2006; Carp Н, Torchinsky A, Fein A, Toder V., 2001).
В настоящее время установлено, что при физиологической беременности, начиная с ранних сроков, в крови преобладают цитокины Th2 типа, которые, блокируя реакции клеточного иммунитета, способствуют развитию и инвазии трофобласта (Das С, Kumar V.S., Gupta S., Kumar S., 2002; Soriano D., Hugol D., Quang N.T., Darai E., 2003). Ведущая роль в этих процессах отводится ИЛ-4, способному влиять на поляризацию Т-хелперов в направлении развития Т-хелпер-2 опосредованного иммунного ответа, переключение синтеза иммуноглобулинов на IgGl и IgE классы (Balkwill F, 2001).
При низком содержании прогестерона реализация иммунных реакций в организме матери на трофобласт смещается в сторону преобладания продукции цитокинов (ИЛ-10, ylFN) определяющих развитие иммунного ответа по Т-хелпер-1 опосредованному пути. Эти цитокины обладают не только прямым эмбриотоксическим эффектом, но так же ограничивают инвазию тро-
фобласта и способствуют выкидышу первого триместра (Makhseed М., Ragh-upathy R., Azizieh F. et al., 2001).
Среди множества причин ПНБ следует выделить одну из наиболее частых - эндокринные нарушения в организме матери, ведущим патогенетическим механизмом которых является абсолютная или относительная недостаточность лютеиновой фазы (НЛФ). Она выявляется при обследовании у 85 % пациенток, страдающих ПНБ (Сидельникова В.М., 2006). В ходе многочисленных исследований было установлено, что для полноценной секреторной трансформации и подготовке эндометрия к нидации оплодотворенной яйцеклетки, необходима достаточная секреция эстрогенов и, в большей степени, прогестерона (Айламазяна Э.К., 2002). Однако даже при достаточной продукции прогестерона может сохраниться морфологическая отсталость и неполноценность одного из важнейших звеньев репродуктивной системы — эндометрия матки. Весьма важным свойством ткани эндометрия является его способность к ответу на наличие стероидных гормонов в крови, что достигается взаимодействием данных гормонов со специальными белками стро-мальных и железистых клеток эндометрия - стероидными рецепторами (Демидова Е.М. и соавт., 1991; Побединский Н.М. и соавт., 2000; Mertens HJ. et al., 2000). Адекватное реагирование в ответ на меняющийся уровень стероидных гормонов ткани эндометрия выражается в его циклическом превращении на протяжении менструального цикла (Mote Р.А., Balleine R.L., McGowan Е.М., 1999; Conneely O.M., Mulac-Jericevic В., DeMayo F., 2002). Рецепторная система эндометрия в период «имплантационного окна» играет исключительную роль, так как начальные взаимодействия эндометрия с бластоцистой обеспечиваются сигнальными механизмами между их рецепторами. В дальнейшем, стероидные рецепторы принимают участие в осуществлении контроля трофобластической инвазии (Sarani S.A., 1999; Mertens HJ. et al., 2001). Измененная экспрессия стероидных рецепторов эндометрия не обеспечивает адекватной секреторной трансформации железистой ткани эндометрия, что определяет возникновение нарушений во взаимодействии между бластоци-
стой и эндометрием, дискоординацию во время трофобластической инвазии, и прерывание беременности.
В отношении ПНБ, как причины репродуктивной патологии, эндомет-риальные рецепторы к эстрогенам и прогестерону, а также соотношение рецепторов и провоспалительных цитокинов изучены недостаточно. Имеются отдельные, разрозненные сообщения, что, безусловно, требует уточнения и дополнительного изучения. Комплексная диагностика и патогенетическое лечение могут обеспечить максимальный результат для нахождения путей восстановления утраченной репродуктивной функции у женщин с привычным невынашиванием беременности.
Таким образом, у пациенток с привычным невынашиванием беременности, независимо от первопричины, формируется НЛФ, которая требует поиска эффективной тактики подготовки к ведению беременности для формирования полноценных взаимоотношений в системе-мать-плод. Учитывая стимулирующее влияние стероидных гормонов на синтез рецепторов в эндометрии, коррекцию НЛФ возможно проводить назначением пациенткам с ПНБ циклической гормональной терапии, либо, препаратов-натуральных аналогов прогестерона.
Цель исследования
Изучить особенности содержания цитокинов и рецепторов к половым гормонам в эндометрии у пациенток с привычным невынашиванием беременности для выбора оптимальной тактики предгравидарной подготовки.
Задачи исследования
Провести клинико-лабораторное обследование пациенток с привычным невынашиванием беременности.
Определить содержание и баланс интерлейкинов: 1(3, 6, 4 и интерфе-рона-у в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности до лечения.
Оценить количество рецепторов к эстрогенам и прогестерону в эндометрии и исследовать его морфофункциональное состояние у пациенток с привычным невынашиванием беременности до лечения.
Оценить содержание и баланс интерлейкинов: ір, 6, 4 и интерферона^ в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности на фоне проведения предлагаемых схем предгравидарной подготовки.
Исследовать содержание рецепторов к эстрогенам и прогестерону в эндометрии и его морфофункциональное состояние у пациенток с привычным невынашиванием беременности на фоне проведения предлагаемых схем предгравидарной подготовки.
Научная новизна исследования
У пациенток с привычным невынашиванием беременности по сравнению с практически здоровыми женщинами репродуктивного возраста в сыворотке крови повышены концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИНФ-у и значения коэффициентов ИЛ-ір/ИЛ-4 и ИНФ-у/ИЛ-4 на фоне физиологических величин ИЛ-4. У женщин с привычным невынашиванием беременности установлено снижение в эндометрии содержания рецепторов к эстрогенам и прогестерону в секреторную фазу менструального цикла по сравнению с практически здоровыми женщинами репродуктивного возраста.
Впервые показано, что у женщин с привычным невынашиванием беременности включение в предгравидарную подготовку дидрогестерона (дюфа-стона) приводит к достоверному снижению концентраций в сыворотке крови провоспалительного цитокина ИЛ-ір и индуктора Th-1 опосредованного иммунного ответа ИНФ-у на фоне уменьшения значения коэффициентов ИЛ-ір/ИЛ-4 ИНФ-у/ИЛ-4 по сравнению группой пациенток, получавших метаболическую терапию.
Использование у женщин с привычным невынашиванием беременности в предгравидарной подготовке циклической гормональной терапии (фе-мостон 1/10 + дюфастон) приводит к увеличению количества рецепторов к
эстрогенам и прогестерону в эндометрии и к полноценной структурно-функциональной реакции эндометрия по сравнению с группой пациенток, получавших метаболическую терапию.
Практическая и теоретическая значимость исследования
Оценка степени и характера изменений со стороны стероидрецепторно-го аппарата в комплексе с патоморфологическим анализом эндометрия у женщин с привычным невынашиванием беременности позволяют судить о выраженности репродуктивной дисфункции.
Показано, что включение в предгравидарную подготовку натурального аналога прогестерона представляется патогенетически обоснованным не только с позиций нормализации содержания прогестерона, но и с целью снижения активности синтеза цитокинов, обладающих провоспалительным потенциалом, способных нарушать процессы развития беременности.
Показано, что циклическая гормональная терапия за счет обеспечения адекватного поступления половых стероидных гормонов повышает чувствительность к ним клеток желез и стромы эндометрия.
Показано, что применение циклической гормональной терапии приводит к увеличению количества рецепторов к эстрогенам и прогестерону и нормализации функционального состояния эндометрия по сравнению с группой пациенток получавших только метаболическую терапию.
Использование в предгравидарной подготовке дидрогестерона и циклической гормональной терапии способствует повышению частоты наступления (вынашивания) беременности по сравнению с группой пациенток, получавших метаболическую терапию.
Положения, выносимые на защиту
1. У женщин с привычным невынашиванием беременности выявлено повышение концентрации и изменения баланса провоспалительных цитокинов, что создает неблагоприятный фон для инициации и развития беременности.
У женщин с привычным невынашиванием беременности в секреторную фазу менструального цикла снижено содержание рецепторов к эстрогенам и прогестерону в эндометрии.
Использование в предгравидарной подготовке женщин с привычным невынашиванием беременности дидрогестерона и циклической гормональной терапии способствует созданию благоприятных условий для инициации и развития беременности, повышению количества доношенных беременностей по сравнению с пациентками, получавшими метаболическую терапию.
Современные этиопатогенетические аспекты невынашивания беременности
Привычное невынашивание беременности (ПНБ) — мультифакторное, генетически детерминированное заболевание, является одной из наиболее сложных медико-социальных проблем современной гинекологии (Фролова О.Г. и др. 1996; Сидельникова В.М., 1999; Кулаков В.И. и др., 2001). Проблема ПНБ остается одной из наиболее актуальных в акушерстве и гинекологии, так как влечет за собой не только снижение рождаемости, но и оказывает отрицательное влияние на репродуктивное здоровье женщины. Самопроизвольно в РФ прерывается каждая пятая желанная беременность, что приводит не только к медицинским, но и демографическим потерям - в стране не рождается 180 000 желанных детей. Практически невынашивание беременности — это универсальный интегрированный ответ женского организма на любое неблагополучие в состоянии здоровья беременной, плода, окружающей среды и многих других факторов (Радзинский В.Е., 2004).
Самопроизвольный аборт является одним из наиболее часто встречающихся осложнений беременности (Винницкий О.И., 1988). По меньшей мере, до 15 % подтвержденных беременностей оканчивается самопроизвольным выкидышем, из них 75-80 % в сроке до 12 недель. Это, вероятно, инструмент естественного отбора, препятствующий развитию генетически аномальных плодов. Вместе с тем в группе женщин, потерявших первую беременность, существует категория больных (2-4 %), в организме которых присутствуют эндогенные факторы, приводящие к прерываниям беременности, т. е. к симптомо-комплексу привычной потери беременности. Так, установлено, что риск потери беременности после первого выкидыша составляет 13-17 %. Однако она доходит до 55 % у женщин, уже имевших 3 последовательных выкидыша (Vlaanderen W., Treffers Р.Е., 1987; Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М., 2003).
Диагноз привычного невынашивания беременности обычно ставится после трех и более спонтанных выкидышей в сроках ранее 20 недель беременности. Однако сегодня, большинство специалистов, занимающихся проблемой невынашивания, приходят к выводу, что достаточно двух последовательных выкидышей, чтобы отнести супружескую пару к категории привычной потери плода с последующим обязательным обследованием и комплексом мер по подготовке к беременности (Кулаков В.И., Сидельникова В.М., 1996).
По данным литературы можно выделить несколько ведущих этиопа-тогенетических факторов формирования привычного невынашивания беременности (Анастасьева В.Г., 1991; Серов В.Н. и др., 1993; Савельева Г.М., 1997; Сидельникова В.М., 1999; Керчелаева СБ. и др., 2000; Шехтман М.М. и др., 2001; Сухих Г.Т. Ванько Л.В., 2003; Aplin J., 1996; Carp Н. et al., 2001). I. Иммунологические факторы (до 50 %): 1. Гуморальные механизмы (антифосфолипидные антитела, анти спермальные антитела, дефицит блокирующих антител) 2. Клеточные механизмы (ТЫ клеточный иммунный ответ на антиге ны непродуктивного процесса (эмбрио/трофобласт - токсические факторы/ цитокины), Th2 дефицит цитокинов, факторов роста и онкогенов, дефицит супрессорных факторов и клеток, экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости) П. Эндокринные факторы (17 %): недостаточность лютеиновой фазы цикла, синдром поликистозных яичников, заболевания щитовидной железы, сахарный диабет, гиперандрогенные состояния, расстройства секреции про-лактина III. Инфекционные факторы (15 %): бактериальные, вирусные, грибковые IV. Генетические факторы (15 %) V. Анатомические причины (12 %): пороки развития, синехии, анома лии шейки матки, аденомиоз, ИЦН, гипоплазия матки VI. Другие факторы (6 %): соматические заболевания, факторы внешней среды, лекарственные препараты
Несмотря на многочисленные исследования в 25-27 % случаев генез невынашивания беременности остается неуточненным (Сидельникова В.М:, 2002). Ее частота стабильно высока, и по данным ВОЗ, составляет 15-20% исходов всех беременностей, причем большинство потерь — в раннем эмбриональном периоде.
В этиологической структуре привычного невынашивания беременности роль эндокринных факторов весьма актуальна. Однако в настоящее время все больше исследователей приходят к выводу о тесной взаимосвязи и взаиморегуляции между эндокринной и иммунной системами, реализующейся.в эндометрии на этапах имплантации (Серов В.Н., Сидельникова В, М., Агад-жанова А.А., 2006). Прогестерон способствует полноценной секреторной трансформации эндометрия, необходимой для внедрения бластоцисты. Кроме того, во время беременности гестагены обеспечивают рост и развитие миометрия, его васкуляризацию и релаксацию путем нивелирования влияния окситоцина и снижения действия простогландинов. При обследовании пациенток с привычным невынашиванием вне беременности у 85 % из них находят недостаточность лютеиновой фазы. (Сидельникова В.М., 2002).
Морфофункциональные изменения в эндометрии на протяжении менструального цикла и особенности эндометрия при привычном невынашивании беременности
Эндометрий — сложная многокомпонентная система, клеточные элементы которой находятся в тесной взаимосвязи, что обеспечивается главным образом взаимодействием с половыми гормонами (Побединский Н. М., Бал-туцкая О.И., Емельяненко А.И, 2000). Решающую роль в имплантации играет рецептивность, т. е. количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам. Рецепторы половых гормонов определяют чувствительность эндометрия и децидуальной ткани к этим гормонам и опосредуют их действие на клетку. В свою очередь, уровень этих рецепторов подчинен сложному гормональному контролю и может меняться в различных физиологических и патологических ситуациях (Асрибекова М.К. и др., 1985; Гончарова В.Н. и др., 1989; Janne et al., 1978, Kreitmann, Bayard, 1979).
Семейство стероидных рецепторов представляет собой класс белков, функционирующих на ядерном уровне и являющихся, по существу, белками, регулирующими транскрипцию. В отсутствии лигандов стероидные рецепторы находятся в комплексе с белками теплового шока hsp90 (Press M.F., Udove J.A., Greene G.L.,1988; Mertens HJ. et al., 2001). Активация рецепторов при связывании с гормоном приводит к диссоциации комплекса рецептор-белок теплового шока и димеризации рецептора. Димер обладает способностью связываться с соответствующими, строго специфичными для стероидов последовательностями ядерной ДНК, что обеспечивает селективность в отношении каждого из них и влияние на транскрипцию генов-мишеней (Побе-динский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И., 2000).
Ядерные и цитозольные рецепторы стероидных гормонов по современным представлениям идентичны. Большая часть гормон-рецепторных комплексов в ядре диссоциирует и инактивируется. В цитоплазму возвращаются свободный стероид и инактивированный под действием ядерных фосфатаз рецептор. Гормон, как правило, каким-либо изменениям не подвергается. В настоящее время обнаружены а- и (3-типы эстрогеновых рецепторов. Первичная структура этих белков очень похожа, что позволяет предположить для них наличие общего механизма действия. Наивысший уровень экспрессии [3-рецептора обнаруживается в эпителиальных клетках эндометрия в преовуляторном периоде, а также в клетках стромы и эндоте-лиоцитах в позднюю секреторную фазу. Экспрессия а-рецепторов максимальна в течение периовуляторного периода. Показано, что экспрессия 0-рецепторов выражена значительно в меньшей степени, за исключением поздней секреторной фазы менструального цикла. Указывается на связь [3-рецепторов эстрогенов с активным ангиогенезом в этот период (Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 1995).
Рецептор прогестерона состоит из двух субъединиц — А и В в соотношении 1:1. Предполагается, что влияние прогестерона на эндометрий в секреторную фазу цикла и в ранние сроки беременности осуществляется, главным образом, посредством его воздействия на подтип А-рецепторов, расположенных в клетках стромы эндометрия. Установлено, что уровень А и В-изоформ по-разному регулируется в эндометрии в течение репродуктивного цикла. Прогестерон значительно увеличивает содержание А-изоформы, основной в децидуальных стромальных клетках. Эта же изоформа является более сильным активатором гена транспортного белка-1 (ИФРСБ-1) инсулино-подобных факторов роста-1 и -2 (ИФР-1 и -2) в эндометриальных стромальных клетках, чем В-изоформа рецептора прогестерона (Татарчук т.Ф., (Польский Я.П., 2003).
Распространенность рецепторов прогестерона охватывает миометрий, эндометрий, гранулезные клетки преовуляторного фолликула, желтое тело, влагалище, молочную железу, гипофиз, эндотелий сосудов, вентомедиаль-ную область гипоталамуса. Прогестерон обладает высоким сродством к своему рецептору, однако комплекс, который при этом образуется, диссоциирует и инактивируется достаточно быстро. Все метаболиты прогестерона имеют меньшее сродство к рецептору, чем он сам. Отмечено незначительное сродство эстрадиола, кортизола и тестостерона к рецепторам прогестерона. В течение нормального менструального цикла содержание в эндометрии рецепторов к эстрогенам и прогестерону претерпевает закономерные колебания, синхронные с изменением концентрации эстрадиола и прогестерона в общем и маточном кровотоке. Изменение концентрации рецептора прогестерона и рецептора эстрадиола в эндометрии в течение цикла связаны прежде всего с регуляторным влиянием самих половых гормонов (Donald P., McDonnell, 2000; Michell P. Warren et al, 2000).
Эстрадиол усиливает синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но подавляет его. Подавляет он и синтез рецепторов эстрадиола.
Определение содержания эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови
Интерлейкин (ИЛ)-ір человека представляет собой белок с молекулярной массой около 17 kD, обладающий широким спектром биологических активностей, включая влияние на метаболические, физиологические, гемопо-этические и иммунологические реакции организма и относится к группе ци-токинов. Нормальный уровень ИЛ-ір в сыворотке крови здоровых людей, как правило, не превышает 50 пкг/мл. Интерлейкин (ИЛ)-4 человека представляет собой белок с молекулярной массой около 20 kD, обладающий широким спектром биологических активностей. ИЛ-4 является одним из важнейших медиаторов, обеспечивающих проявление хелперных функций Т-лимфоцитов на В-клеточное звено иммунитета. Нормальный уровень ИЛ-4 в сыворотке крови здоровых людей, как правило, не превышает нескольких десятков пкг/мл.
Интерлейкин-6 является провоспалительным цитокином с молекулярной массой 26000 ДА. IL-6 продуцируется лимфоидными и нелимфоидными клетками, нормальными и трансформированными клетками, включая Т-клетки, моноциты, фибробласты, гепатоциты. Он обладает множеством биологических активностей, таких как: индукция белков острой фазы воспаления гепатоцитами, стимуляция дифференцировки и секреции антител В-клетками. Определение интерлейкина-6 имеет важное значение для исследования механизмов воспалительного процесса и иммунного ответа.
ИНФ-у - важнейший эндогенный иммуномодулятор, способный активировать Т-хелперный ответ первого типа, NK-клетки, клеточную цитоток-сичность. Его высокие уровни, по данным литературы, зачастую связывают с развитием различных осложнений течения беременности.
У всех пациенток из локтевой вены был проведен забор крови в количестве 10 мл в сухую центрифужную пробирку (центрифугировали при 1500 об/мин 7-10 минут на центрифуге ОПН-3). Слой образовавшейся сыворотки использовали для постановки реакций. Исследования выполнялись на тест-системах для иммуноферментного анализа производства ООО «Цитокин» по инструкции производителя. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на вертикальном фотометре Multiskan МСС 340 в при длине волны 450 нм. Для определения концентрации интерлейкинов и интерферона -у в анализируемых образцах строился калибровочный график по «средним» оптической плотности каждого стандартного раствора.
Иммуногистохимический метод использовался для определения в паренхиме (железах) и строме эндометрия рецепторов к прогестерону и эстрогенам. Ріммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биотинового метода («Dako», Дания, LSAB-2 Sistems, НШ .Окрашивание полученных срезов производилось при помощи пероксидазно-антипероксидазного метода. Данные срезы, толщиной 3 мкм, наклеенные на поли-Ь-лизиновые стекла, после депарафинизации и дегидратизации этанолом подвергали микроволновой обработке в фосфатном буфере (0,1 моль/л, рн=6,0) в течение 15 минут для демаскировки антигенов. Блокирование эндогенной пероксидазной активности осуществлялось 1 %-м раствором перикиси водорода. Неспецифическое фоновое окрашивание препаратов, как результат неспецифической абсорбции первичных антител, было редуцировано инкубацией с нормальной неиммунной сывороткой в течение 15 минут.
Для детекции стероидных рецепторов эндометрия использовали первичные моноклональные и вторичные универсальные антитела. После обработки срезов первичными антителами они были подвергнуты инкубации в течение 35 минут при добавлении вторичных антител с последующей инкубацией на протяжении 25 минут при температуре 25С. После повторного промывания в фосфатном буфере препараты были окрашены в данном буфере 0,2 мг/мл 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлоридом с содержанием 0,005 % перекиси водорода. Кроме того, срезы докрашивали гематоксилином. Для позитивного контроля использовались срезы ткани опухоли с известной экспрессией рецепторов эстрогена и прогестерона (рак молочной железы). Для отрицательного контроля — первичные антитела исключали из протокола и заменяли неиммунной сывороткой.
Оценка окрашивания препаратов эндометрия проводилась полуколичественным методом. Оценивались окрашивание клеток эпителия и клеток стромы. При этом, во-первых, оценивалась интенсивность окрашивания клеток: слабая-1 балл; умеренная-2 балла; выраженная 3 балла; во-вторых, при увеличении х 400 проводился подсчет окрашенных клеток. Количественное выражение окрашенных клеток эндометрия производилось посредством формулы — (производная % клеток со слабым окрашиванием и 1) + (производная % клеток с умеренным окрашиванием и 2) + (производная % клеток с выраженным окрашиванием и 3). Полученные числовые значения оценивали следующим образом: О - 9 - отрицательная реакция; 10 - 99 - слабая реакция; 100 - 199 - умеренная реакция; 200 - 300 - выраженная реакция.
Концентрация цитокинов в сыворотке крови женщин с привычным невынашиванием беременности
Известно, что ведущими факторами, приводящими к привычному невынашиванию беременности, являются эндокринные и иммунные, которые, зачастую, реализуются в рамках прогестероновой недостаточности и дисбаланса биологически активных медиаторов иммунных и межклеточных взаи моотношений - цитокинов. В связи с этим представляются значимыми исследования, направленные на изучение содержания цитокинов, играющих вксомую роль в динамике предгравидарной подготовки, процессах инициации беременности.
В соответствии с целью и задачами настоящего исследования до проведения лечебных мероприятий было обследовано 80 женщин репродуктивного возраста с диагнозом привычного невынашивания беременности, находившихся для плановой предгравидарной подготовки на базе МУЗ Муниципальный центр планирования семьи и репродукции г. Новосибирска.
Для оценки баланса цитокинов у обследуемой группы пациенток было проведено определение в сыворотке крови концентраций провоспалительных интерлейкинов ИЛ-ір и ИЛ-6, и индукторов активации гуморального и/или клеточного звеньев иммунной системы ИЛ-4 и ИНФ-у.
Выбор тестируемых в исследовании цитокинов основывался на следующих научных фактах: ИЛ-ір является основным провоспалительным цитокином, повышение концентраций которого связано с активацией иммунного ответа по Т- хел-перному пути 1 типа и взаимосвязано с развитием процессов воспаления и деструкции. Высокие концентрации этого цитокина, по данным литературы, являются неблагоприятным фактором для инициации и физиологического развития беременности.
ИЛ-6 — провоспалительный цитокин, высокие концентрации которого определяются при воспалительных процессах.
ИЛ-4 отводится важная роль в поддержании иммунного баланса, что связывается с его способностью активировать Т-хелперный ответ второго типа, участвует в активации синтеза блокирующих антител, необходимых для развития беременности. ИЛ-4 обладает противовоспалительными свойствами.
ИНФ-у -важнейший эндогенный иммуномодулятор, способный активировать Т-хелперный ответ первого типа, NK-клетки, клеточную цитоток-сичность. Его высокие уровни, по данным литературы, зачастую связывают с развитием различных осложнений течения беременности.
При обследовании пациенток, отобранных в контрольную группу, учитывались данные объективного обследования и анамнеза. Все женщины контрольной группы были репродуктивного возраста, на момент обследования не предъявляли субъективных жалоб, в анамнезе у них не отмечалось наличие хронических инфекционновоспалительных заболеваний (ИВЗ) различных органов и систем, в том числе генитальной сферы, а также острых ИВЗ за 3 месяца до проведения обследования.
В настоящее время не вызывает сомнения значимость изучения не только изменений значений тестируемого показателя в группах обследованных лиц, но и процент отклонений индивидуальных показателей от границ нормативных значений. В связи с этим, при статистической обработки данных, в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения, были выведены границы нормативных значений методом прибавления или вычитания сигмального отклонения из значения «средней» показателя.
Использование в работе критерия верхней и нижней границ нормы позволяет определить достоверное повышение или снижение уровня изучаемого показателя у конкретного пациента обследованной группы.
Нормативные значения определяемых в настоящем исследовании им-мунобиохимических показателей представлены в таблице 13.
Концентрация ИЛ-ір в сыворотке крови женщин с ПНБ до проведения предгравидарной подготовки составила 81,1 ± 14,2 пг/мл, что превышает значения нормативных показателей у пациенток контрольной группы, составляющей 63,1 ± 6,2 пг/мл (рис. 5), но достоверно от неё не отличается. Однако среднее значение изучаемого показателя превышало верхнюю границу нормативных значений — 77,3 пг/мл (табл. 13).
