Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 11
1.1. Функциональное состояі іие клеток крови и эндотелия при синдроме ишемии-реперфузии 11
1.1.1. Эндотелий при ишемии-реперфузии
1.1.2. Клетки крови при ишемии-реперфузии
1.2. Коагуляционный гемостаз при синдроме ишемии-реперфузии 20
1.3. Реактапты острой фазы
1.3.1. Функциональная значимость реактантов острой фазы 24
1.3.2. Альфа-1-кислый гликопротеин 26
ГЛАВА 2 Материалы и методы 36
2.1. Экспериментальные модели 36
2.2. Методы исследования 38
ГЛАВА 3 Гомеостаз организма при синдроме ишемии реперфузии 45
3.1. Выбор метода экспериментального моделирования 45
3.2. Состояние тромбоцитарного гемостаза при ишемии-реперфузии 47
3.3. Состояние свободнорадикальных процессов при ишемии-реперфузии 51
3.4. Коагуляционный гемостаз при ишемии-реперфузии 60
3.5. Реакция системы лейкоцитов при ишемии-реперфузии 64
3.6. Показатели эндогенной интоксикации при ишемии-реперфузии 67
Глава 4 Влияние препарата «орозин» на гомеостаз организма при синдроме ишемии-реперфузии 71
4.1. Влияние «орозина» на функциональное состояние тромбоцитов 71
4.2. Влияние «орозина» на состояние свободнорадикальных процессов при ишемии-реперфузии
4.3. Влияние «орозина» на коагуляционный гемостаз 82
4.4. Влияние «орозина» на лейкоцитарную реакцию при синдроме ишемии-реперфузии 85
4.5. Влияние «орозина» на показатели эндогенной интоксикации при ишемии-реперфузии 87
Глава 5 Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на гемостаз в условиях in vitro 90
5.1. Адгезивно-агрегационная способность тромбоцитов 90
5.2. Влияние кгп на коагуляционный гемостаз 102
Заключение 105
Выводы 136
Список литературы
- Коагуляционный гемостаз при синдроме ишемии-реперфузии
- Функциональная значимость реактантов острой фазы
- Состояние свободнорадикальных процессов при ишемии-реперфузии
- Влияние «орозина» на коагуляционный гемостаз
Введение к работе
Актуальность исследования Синдром ишемии-реперфузии, лежащий в основе таких патологических процессов, как стенокардия, инфаркт миокарда, инсульт, в настоящее время привлекает внимание большого числа исследовательских групп Целый ряд работ посвящен изучению месі ного состояния тканей, вовлеченных в реперфузионное повреждение и поиску возможных способов их защиты от таких отрицательных факторов, как гипоксии, лейкоцитарной инфильтрации, цитокиновой агрессии (Daemen MARC, 1999, Frangogiannis N G , 1998, Nita D A , 2001,OsukaK etal ,2004, TuplingR etal ,2001) В то же время недостаточно изучена роль в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии одной из наиболее значимых и динамичных гомеостатических систем организма -системы регуляции агрегатного состояния крови (PACK) Имеются работы, в которых рассматривается значение ее функциональных составляющих в локальных проявлениях синдрома ишемии-реперфузии (Armaganian L , 2000, Chong A J , 2003, Cooper D , 2003, Massberg S , 1999), ряд авторов указывают на развитие местного ДВС-синдрома (Schoots I G , 2003) Однако комплексная оценка функционального состояния системы гемостаза и активности регулирующих ее факторов, в частности процессов свободнорадикального окисления (окислительный стресс), эндогенной интоксикации, лейкоцитарной реакции, при синдроме ишемии-реперфузии до настоящего момента не производилась
Особый интерес в плане коррекции нарушений гомеостаза организма в настоящее время привлекают «естественные» факторы, в том числе вещества, относимые к группе так называемых «острофазовых белков» Одним из перспекгивных представителей данной группы является белок II эшелона альфа-1-кислый гликопротеип (орозомукоид, серомукоид, КГП), существующий в виде лекарственной формы - препарата «Орозин» Приоритет в разработке данного препарата принадлежит кафедре биохимии ЧелГМА, а технология производства освоена Челябинской областной станцией переливания крови Спектр возможных показаний для применения данного препарата требует расширения. Концентрация альфа-1-кислого гликопротеина в плазме нарастает в 3-5 раз при различных экстремальных воздействиях на организм уже через 18-24 часа (Gabay С , 1999, Schreiber G , 1989) Данные литературы позволяют характеризовать птпппгукоид тгптг шрмппытып компонент сосудистой стенки, участвугаьц^зд^гоС^ЙЙМ'^ё трони-
цаемости, как регулятор функционального состояния нейтрофилов и других клеток крови (Саломатин В В , 1993, Пухальский А Л , 2000, Sorrenson J , 1999, 2000) Имеются указания на наличие анти-оксидантной и антицитокиновой активности (Libert С , 1994, van Molle V, 1997) В последние годы орозомукоид привлекает внимание исследователей как корректор состояния организма при экстремальных состояниях (шок, бактериальная инфекция) (Hochepied Т , 2000, Kuebler J F , 2004), а также как фактор местной защиты тканей при ишемии-реперфузии (Daemen М A R.C , 2000) В то же время информация о системном влиянии альфа-1-кислого гликопротеи-на, в том числе и при ишемии-реперфузии не формирует целостной картины. Исходя \м этих предпосылок, были определена цель и задачи исследования
Цель исследован ия
Изучить патогенез нарушений гемостаза при синдроме ишемии-реперфузии и их коррекцию белком острой фазы альфа-1-кислым гликопротеином
Іадачи исследования
-
Разработать адекватную модель синдрома ишемии-реперфузии, позволяющую получить выраженные изменения гомеостаза целое того организма
-
Изучить нарушения системы гемостаза при ишемии-реперфузии' системы тромбоцитов, свертывающей, антикоагулянтной и фиб-ринолитической систем
-
Определить возможные механизмы нарушений системы гемостаза' изменения свободнорадикальных процессов в плазме и тромбоцитах, уровня эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов, выявить взаимосвязи между нарушениями системы іемостаза и факторами, регулирующими гемостатические процессы
-
Выявить влияние «Орозина» на основные патогенетические механизмы, наблюдаемые при синдроме ишемии-реперфуши состояние системы гемостаза, состояние свободнорадикальных процессов, состояние эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов
-
Выяснить влияние «Орозина» на состояние компонентов системы гемостаза в условиях in vitro
Научная новизна Впервые показано, что изменения сисіемьі ге-
мостаза в динамике экспериментального синдрома ишемии-реперфузии носят фазный характер Ранняя с гадия характеризуется изменениями, подобными ДВСК-синдрому Функциональная активность тромбоцитов повышается в раннем периоде синдрома и снижается в позднем В ранней фазе (1 час реперфузии) активация свертывающей системы происходит по внутреннему пути, а в позднем периоде (24 часа) - по внешнему пути Одновременно происходят фазные согласованные изменения активности процессов СРО в плазме и тромбоцитах Показано, что синдром ишемии-реперфузии сопровождается развитием острофазовой реакции организма, а также преходящей реакцией системы лейкоцитов, проявляющейся нейтрофильным палочкоядерным лейкоцитозом на фоне лейкопении
Впервые изучено действие препарата «Орозин» на состояние организма при ишемии-реперфузии Показано, что белок снижает повышенную агреї анионную способность тромбоцитов и не оказывает эффекта при пониженной агрегационной активности, нормализует адгезивную способность тромбоцитов В условиях ишемии-реперфузии препарат оказывает аншоксидантный эффект вне зависимости от срока, опосредованный через повышение общего антиоксидантного потенциала плазмы и активное]и каталазы, снижает выраженность лейкоцитарной реакции.
В условиях in vitro впервые показано, что альфа-1-кислый гли-копротеин ингибирует функциональную активность тромбоцитов за счет второй волны агрегации Влияние на адгезивную способность и продукцию свободных радикалов в тромбоцитах различно в условиях in vitro и in vivo при синдроме ишемии-реперфузии
Теорегическая и практическая значимость.
Результаты диссертационного исследования уточняют роль нарушений системы гемостаза, изменений свободнорадикальных процессов, уровня эндогенной интоксикации в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии, а также патофизиологическую значимость альфа-1-кислого гликопротеина как фактора неспецифической защиты организма Экспериментально обосновано применение препарата «Орозин» при состояниях, в основе которых лежит синдром ишемии-реперфузии, с целью коррекции нарушений тромбоцитарного, коагуляционного гемостаза и антикоагулянтной системы, нормализации свободнорадикальных процессов за счет усиления мощное ти антиоксидантной сист емы Разра-
ботанная модель синдрома ишемии-реперфузии является аналої ом ряда ситуаций в клинике сосудистой хирургии и может применяться для проведения дальнейших научных исследований
Внедрение результатов исследования.
Результаты диссертационной работы внедрены в преподавание патофизиологии, биохимии в разделах «Патофизиология системы крови», «Обмен белков» в Челябинской государственной медицинской академии
Разработанный «Способ моделирования синдрома ишемии-реперфузии» внедрен на кафедру патофизиологии Челябинской государственной медицинской академии для проведения дальнейших научных исследований
Положения, выносимые на защиту.
-
Массивный синдром ишемии-реперфузии сопровождается фазными изменениями состояния системы гемостаза, которые могу і быть расценены как ДВСК-синдром.
-
Изменения системы гемостаза опосредованы за счет изменения состояния свободнорадикальных процессов и эндогенной интоксикации
-
Препарат «Орозин» оказывает антиагрегантное и ангикоаіу-лянтное действие в условиях синдрома ишемии-реперфузии, опосредованное через изменение состояния свободнорадикальных процессов и уровня эндогенной интоксикации.
-
Препарат «Орозин» оказывает стереотипное антиоксидаитное действие, опосредованное за счет повышения активности каталазы и общей антиокислительной активности.
-
В условия ишемии-реперфузии препарат «Оро шн» снижает выраженность лейкоцитарной реакции и уровень эндогенной ин гоксика-ции
Апробация работы
Основные положения работы изложены на научной конференции «Молекулярные основы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию со дня рождения П М Альбицкого (Санкт-Петербург, 2003), научно-практической конференции «Биохимия от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), I итоговой научно-практической кон-
ференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2003), научно-практической конференции «Актуальные вопросы кардиологии и внутренней патологии», посвященной 70-летнему юбилею ЮУЖД (Челябинск, 2004), II итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2004), II Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), II конференции «Патология сосудов и гемостаз» (Омск, 2005)
Публикации.
По іеме диссертации опубликовано 9 печатных работ
Структура диссертации.
Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, библиографического указателя. Диссертация иллюстрирована 62 іаблицами и 22 рисунками Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 194 - зарубежных авторов
Коагуляционный гемостаз при синдроме ишемии-реперфузии
Пусковым фактором, вызывающим повреждение эндотелия при ишемии, является гипоксия. В механизмах структурно-функциональных изменений эндотелиальных клеток при острой ишемии играет роль целый ряд факторов, а именно: дефицит кислорода, недостаточное поступление органических субстратов, в первую очередь глюкозы, токсическое действие продуктов метаболизма, биологически активные вещества. В условиях гипоксии в сочетании с отсутствием глюкозы в среде эндотелиоциты гибнут быстрее, нежели при изолированном действии гипоксии, однако и в этом случае жизнеспособность клеток сохраняется в течение нескольких часов. Показано, что эндотелиальные клетки микрососудов крыс переносят гипоксию в течение 4 суток без видимых морфологических проявлений повреждения [84]. Полагают, что это связано со способностью клеток переходить на анаэробный энергетический обмен [159], синтезировать ряд ферментов анаэробного гликолиза (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), белки теплового шока (HSP), глюкозорегулирующие белки.
Таким образом, эндотелий сосудов всех органов является относительно устойчивой к гипоксии структурой, вместе с тем он претерпевает при гипоксии ряд изменений не вполне однозначного характера. Изменяются адгезивность, проницаемость, протромбогенная и антитромбогенная активность и другие свойства эндотелия, что в целом позволяет рассматривать изменения эндотелия при гипоксии как эндотелиальную дисфункцию. Гипоксия влияет на тромбогенные и антитромбогенные свойства эндотелия. Показано, что острая гипоксия стимулирует экспрессию гена эндотели-альной синтазы оксида азота (eNOS) и усиливает синтез NO [53,236]. Стимуляция синтеза N0 при острой гипоксии, вероятно, носит протективый характер, препятствуя адгезии тромбоцитов и лейкоцитов (за счет угнетения выработки Р-селектинов) к эндотелию. Данные по синтезу других антитромбогенных субстанций при ишемии менее определенны. Так, Redmond et al. [193] указывают на увеличение синтеза простациклина при острой гипоксии, тогда как по другим данным [232] эффект является прямо противоположным. При длительной же гипоксии (особенно более 24 часов) эндотелиальные клетки приобретают четко выраженные протромбогенные свойства. Длительная гипоксия угнетает синтез eNOS в культуре эндотелиальных клеток [155]. По данным Gertler et al. в культуре эндотелиальных клеток наблюдался повышенный синтез тканевого фактора [98], по данным Ogawa et al. эндотелиальные клетки при длительной гипоксии способны секретировать полипептид-активатор фактора X. Также при длительной гипоксии нарушается синтез тромбомодулина, который связывает тромбин и активирует протеин С, а также тканевого активатора плазминогена [97,177].
Острая гипоксия стимулирует появление Р-селектинов, являющихся молекулами адгезии для лейкоцитов и тромбоцитов, а также фактора Виллеб-ранда. Уже через 1 час с момента начала гипоксии происходит его высвобождение из телец Weibel-Palade [185]. Также гипоксия индуцирует появление тромбоспондина-1 с максимумом транскрипции через 24-48 часов и максимумом синтеза белка через 72 часа [183]. Тромбоспондин-1 регулирует адгезию тромбоцитов за счет торможения образования адгезивных молекул РЕСАМ-1 (тромбоцитарно-эндотелиальные клеточные молекулы адгезии) [205].
Острая гипоксия вызывает повышение синтеза эндотелина-1, являющегося мощным вазоконстриктором. Транскрипция гена эндотелина усиливается примерно в 8 раз через 1 час острой гипоксии и остается высокой в течение 48 часов [123]. Таким образом, антитромботическая функция эндотелия при ишемии вероятно носит двухфазный характер: в раннем периоде ишемии отмечается повышение антитромботической функции эндотелия, в более позднем периоде - напротив, эндотелий приобретает даже протромбогенную активность.
В условиях ишемии органа на эндотелиальные клетки помимо гипоксии действует целый ряд других факторов, в том числе продукты жизнедеятельности макрофагов и тучных клеток. В условиях гипоксии макрофаги выделяют такие факторы, как интерлейкин-1, ТНФ-альфа, интерлейкин-8. В экспериментах in vivo показано, что при воспроизведении инфаркта вне зависимости от органной локализации происходит выделение ИЛ-1 и ТНФ-альфа [93,110]. Данные цитокины оказывают мощное провоспалительное действие и вызывают экспрессию на эндотелии молекул адгезии (Е-селектины и ICAM-1). Тем самым создаются благоприятные условия для адгезии полиморфноядерных лейкоцитов к эндотелию. Кроме того, ТНФ-альфа стимулирует синтез эндотелиоцитами PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена 1 типа) [105], что может способствовать тромбообразованию в сосудах ишемизированного органа. С другой стороны, существует механизм, препятствующий действию ИЛ-1 и ТНФ-альфа на эндотелий. При гипоксии в эндотелии стимулируется синтез ИЛ-6, который в свою очередь стимулирует синтез антагонистов рецепторов к ИЛ-1 (IL-IRa) и растворимых рецепторов к ТНФ-альфа (TNFsRp55). Таким образом, действие провоспалительных цитокинов на эндотелий контролируется по принципу антагонистической регуляции [216].
В целом, эндотелий является весьма устойчивой к гипоксии структурой, и одновременно с тем - важным координатором межклеточных взаимодействий при воздействии на орган ишемии. При кратковременной ишемии основным механизмом компенсации является активация синтеза NO, препятствующая адгезии тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию.
При восстановлении кровотока эндотелиальные клетки первые воспринимают изменившиеся условия. Одновременно происходит целый ряд событий: повышение давления в сосуде, растяжение эндотелия, воздействие напряжения сдвига [218]. При воздействии механического раздражения на эндотелиоциты происходит растяжение цитоскелета, что активирует мембраноассоциирован-ные сигнальные системы (G-белки, калиевые каналы, протеинкиназы). В результате в течение нескольких секунд происходит увеличение активности эндо-телиальной NO-синтазы (eNOS), результатом чего является вазодилатация. Часть eNOS в клетках связана с мембраноассоциированиыми структурами — ка-веолами, в которых eNOS связана с кавеолином, кальмодулином, белками теплового шока. При изменении напряжения сдвига эти связи разрушаются и большое количество eNOS высвобождается в цитоплазму, тем самым приводя к активации синтеза NO [217]. В экспериментах на изолированных сердцах крыс Wang и Zweiler [231] показали, что синтез оксида азота в эндотелии возрастает сразу после реперфузии более чем в 30 раз. В дальнейшем этот уровень снижается, но остается высоким в течение минимум 2 суток, за счет индуцибельной NO-синтазы [59]. По данным Osuka et al., эндотелиальная NO-синтаза играет существенную роль в защите тканей при реперфузии. Она может активировать 9-І ся по двум механизмам: Са /кальмодулином и протеинкиназой Akt, которая осуществляет ее прямое фосфорилирование. Активность фосфо-eNOS возрастает к 6 часам с момента реперфузии и достигает максимума к 12 часам [182]. Вместе с активацией синтеза оксида азота напряжение сдвига приводит к уменьшению синтеза эндотелина-1 [149], активации синтеза тромбомодулина [148], тканевого активатора плазминогена, что способствует восстановлению кровотока в тканях при реперфузии. Имеются и противоположные данные об активности синтеза оксида азота. По сообщениям Ма и Uhlmann, имеется прогрессивное снижение продукции N0 в процессе реперфузии с одновременным повышением чувствительности к эндотелину. Введение L-аргинина или блока-тора эндотелиновых рецепторов восстанавливает нарушенную эндотелийзави-симую релаксацию и препятствует адгезии полиморфноядерных лейкоцитов [145,220].
Функциональная значимость реактантов острой фазы
К 1 мл суспензии мембран эритроцитов добавляли 0,02 мл БТП, перемешивали, вносили в кювету от фотоэлектроколориметра и облучали бактерицидной лампой БУВ-15 в течение 30 мин на расстоянии 80-100 мм. В контрольную пробу вместо исследуемой жидкости вносили 0,02 мл физиологического раствора. Затем к пробам прибавляли по 1 мл 28% трихло-руксусной кислоты, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Центрифугат смешивали с 1 мл 0,8 % раствора тиобарбитуровой кислоты в 50% уксусной кислоте и нагревали на кипящей водяной бане 15 минут. После нагревания пробирки быстро охлаждали в ледяной воде и определяли экстинкцию опытной и контрольной проб против воды. АОА выражали в процентах ингибирования свободнорадикального окисления в опытной пробе по отношению к контрольной.
Формула расчета: АОА = 100- АопыТ х100(%) Аконтроль Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по торможению реакции восстановления нитросинего тетразолия [41]. К 2мл реагента, состоящего из 200 мл фосфатного буфера рН=7,8; 12,4 мг ЭДТА, 100мг НСТ и 18,4 мг ФМС добавляют 0,1 мл реагента 2 (7,63 мг НАДФ, растворенного в 10 мл трис-буфера рН=8,0) и 0,05 мл БТП. После перемешивания компонентов пробы в кювете устанавливают начальную экстинкцию (Ei). Через 10 минут измеряют нарастание оптической плотности (Е2) раствора. Расчет ведут по формуле:
К 2мл реагента, состоящего из 0,036 мМ фосфатного буфера рН=7,4; 0,448 мМ ЭДТА и 35,8 мМ раствора NaCl добавляют 0,1 мл БТП. Тщательно перемешивают, прогревают в термостате 5 минут, затем добавляют 0,23 мл реагента 2 (смесь окисленного глютатиона 8 мМ и НАДФН - 2,4 мМ). Через 15 минут измеряют показания спектрофотометра (Е , 5 минут инкубируют при 37С и опять измеряют показания прибора (Ег). Расчет ведут по формуле: Е активности = (Ei - Ег) х 785,2 (ME)
Активность каталазы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония по методу М.А.Королюк с соавторами [17].
К 2 мл 0,03% перекиси водорода добавляли ОД мл БТП и оставляли при комнатной температуре 10 минут. В контрольную пробу добавляли дистиллированную воду. Реакцию останавливали 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Контрольную и опытную пробы смотрели на спектрофотометре при длине волны 410 нм против дистиллированной воды.
Формула расчета: Kat = (Ек - Eon) х 32,5 (мкат/л) Активность церулоплазмина определяли по методу Тена Э.В. [39] В пробирку вносили 0,1 мл БТП, 1 мл 0,4 М ацетатного буфера (рН = 5,6), 0,5 мл 1%-ного водного раствора п-фенилендиамина солянокислого. Перемешивали и инкубировали на водяной бане при температуре 60С в течение 10 минут. Реакцию останавливали 3,5 мл ледяного 25%-ного раствора едкого натра. Полученную оранжевого цвета жидкость спектрофотометрировали при 440 нм против контроля. В контрольной пробирке компоненты смешивали в той же последовательности, но раствор едкого натра добавляли до нагрева фермент-субстратной смеси. Активность церулоплазмина измеряли в единицах оптической плотности. Определение активности факторов свертывания крови производилось общепринятыми методами и включало [1,2,10,13]:
Время рекальцификации богатой и бедной тромбоцитами плазмы В пробирку, установленную на водяную баню с температурой 37С, помещали 0,2 мл богатой или бедной тромбоцитами плазмы, и инкубировали в течение 2 минут. По истечении этого времени в пробирку добавляли 0,2 мл прогретого при 37С 0,025 М раствора СаСЬ и отмечали время образования сгустка. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) В пробирку, установленную на водяной бане с температурой 37С, вносили 0,1 мл исследуемой бестромбоцитарной плазмы, 0,1 мл суспензии каолина (5 мг/мл) и 0,1 мл 0,05% суспензии кефалина. Смесь инкубировали в течение 2 минут при периодическом встряхивании, после чего добавляли 0,1 мл прогретого 0,025 М раствора СаС12. Отмечали время образования сгустка.
Протромбиновое время (ПТВ)
В пробирку, установленную на водяной бане с температурой 37С, помещали 0,1 мл исследуемой бестромбоцитарной плазмы, 0,1 мл эмульсии тром-бопластина и инкубировали в течение 3 минут. Затем добавляли 0,1 мл прогретого 0,025 М раствора СаС12. Отмечали время образования сгустка.
Тромбиновое время В пробирку, установленную на водяной бане с температурой 37С, помещали 0,2 мл тромбоцитарной плазмы и инкубировали в течение 1 минуты. Затем добавляли 0,2 мл раствора тромбина стандартной активности, имеющего комнатную температуру и отмечали время образования сгустка. Содержание фибриногена (гравиметрически по методу Рутберг) К 1 мл тромбоцитарной плазмы добавляли 0,1 мл раствора тромбина, после чего инкубировали 15 минут на водяной бане при 37С. Образовавшийся сгусток осторожно отжимали на фильтровальной бумаге и сушили в термостате при 37С 24 часа. Полученный сгусток взвешивали с точностью до 0,1 мг. Содержание фибриногена = вес сгустка (г/литр) Антитромбиновую активность К 0,1 мл бестромбоцитарной плазмы добавляли 0,9 мл стандартного раствора тромбина и инкубировали в течение 15 минут при 37С. Затем снимали 0,1 мл сыворотки и тестировали ее остаточную тромбиновую активность на водном растворе фибриногена с концентрацией 8 мг/мл. Отмечали время свертывания раствора фибриногена, после чего по калибровочной кривой, построенной для данных образцов фибриногена и тромбина с разведениями нормальной плазмы, определяли антитромбиновую активность.
Показатели эндогенной интоксикации определяли по содержанию ТХУ-резистентных веществ в плазме и эритроцитарной массе по методу Оболенского СВ. и Малаховой М.Я. [25]. Для этого к 0,3 мл плазмы или эритроцитарной массы добавляли 0,3 мл воды и 0,3 мл 15% трихлоруксусной кислоты. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 30 минут. 0,3 мл супернатанта разводили в 10 раз дистиллированной водой и спектрофотометрировали на длинах волн от 238 до 302 нм, с шагом 4 нм. Одновременно в супернатанте определяли содержание Лоури-позитивных веществ (ЛПВ, олигопептидов) по методу Lowry [143].
Рассчитывали следующие показатели: Степень интоксикации определяли как сумму экстинкций на длинах волн от 238 до 302 нм, умноженную на 4: СИ = L (Е238 + Е242 + ... + Е298 + Е302) 4. Индекс токсемии определяли как произведение: ИТ = СИ Олигопептиды Хемилюминесценцию тромбоцитов оценивали на приборе «Хемилю-миномер ХЛ-003» по оригинальной методике. Использовали тромбоцитарную плазму с числом клеток 250...300«109/л. В качестве услителя хемилюминесцен-ции применяли люминол. Полученные данные регистрировались на компьютере и выводились на печать. Регистрировали максимальную светимость (МСв) и светосумму (СС) базальной и АДФ-индуцированной хемилюминесценции за 5 минут.
Состояние свободнорадикальных процессов при ишемии-реперфузии
Одним из факторов, влияющих на активность свертывающей системы и тромбоцитов, являются процессы липопероксидации и свободнорадикального окисления. Накопление в тромбоцитах гидроперекисей липидов и МДА способствует их активации [12,42]. Также продукты ПОЛ (диеновые и триеновые коньюгаты) способны регулировать активность процессов свертывания [4]. Поэтому для оценки активности свободнорадикальных процессов в динамике синдрома ишемии-реперфузии производилась комплексная оценка показателей, включающая определение продуктов перекисного окисления липидов, компонентов антиокислительной системы в плазме, а также активности генерации супероксид-анион-радикала в тромбоцитах методом хемилюминесценции.
На сроке реперфузии 1 час активность процессов липопероксидации повышается. Растет содержание общих продуктов ПОЛ, диеновых и триеновых коньюгатов. Содержание ТБК-позитивных продуктов, напротив, снижается. Активность антиокислительной системы существенных изменений не претерпевает, за исключением достоверного снижения общей антиокислительной активности и снижения активности СОД на правах тенденции. Показатели хемилюминесценции тромбоцитов изменяются на правах сильной тенденции: светосумма и максимальная светимость АДФ-индуцированного свечения повышаются с 4,50±1,32 у.е.»мин до 7,17±3,18 у.е.«мин. Эти результаты отражены в таблицах 8,9 и 10. Аналогичный набор показателей определяли у экспериментальных животных на сроке 24 часа реперфузии. Эти результаты представлены в таблицах 11, 12 и 13.
Таким образом, на сроке реперфузии 24 часа характер изменения сво-боднорадикальных процессов принципиально отличается от такового на сроке 1 час. Содержание общих и первичных продуктов ПОЛ снижается по сравнению с интактными животными. Изменяются показатели антиокислительный защиты организма: снижена активность СОД, одновременно нарастает общая антиокислительная активность и активность церулоплазмина. Прирост активности церулоплазмина, вероятно, указывает на развитие острофазовой реакции организма, так как он относится к положительным белкам острой фазы III эшелона. Также за счет церулоплазмина может быть опосредован прирост общей антиокислительной активности плазмы, так как он является главным физиологическим антиоксидантом.
Изменения активности СРО в тромбоцитах носят аналогичный характер: при неизменных показателях базисной светимости показатели АДФ-индуцированного свечения существенно снижаются. Таким образом, изменения агрегационной способности тромбоцитов и СРО в динамике синдрома ишемии-реперфузи носят согласованный характер.
Для оценки влияния процессов липопероксидации на функциональную активность тромбоцитов применялся корреляционный анализ. Здесь же приводятся результаты, полученные для интактных животных.
В физиологических условиях корреляционных взаимосвязей между показателями функциональной активности тромбоцитов и содержанием продуктов ПОЛ относительно немного. Наибольшее количество связей образуют ТБК 56 позитивные продукты и основания Шиффа, относящиеся к конечным продуктам ПОЛ. Заслуживает внимания тот факт, что основания Шиффа оказывают ингибирующее действие на активность СРО в тромбоцитах, образуя отрицательные связи с показателями АДФ-индуцированной хемилюминесценции (г = -0,60), и в то же время стимулируют процессы агрегации и адгезии (для показателя адгезии г = +0,71; дла максимальной амплитуды агрегации г = +0,64; для времени агрегации г = +0,60).
Показатели антиокислительной системы в плазме также оказывают умеренное влияние на функциональную активность тромбоцитов. Наибольшее ингибирующее влияние на агрегационно-адгезивную способность оказывают СОД и каталаза. В то же время показатели индуцированной хемилюминесценции в физиологических условиях мало зависят от активности АОС.
Ишемия-реперфузия приводит к формированию сильных положительных корреляционных взаимосвязей между всеми показателями функции тромбоцитов и содержанием продуктов ПОЛ, за исключением ТБК-позитивных продуктов, при этом необходимо отметить, что они являются единственной группой продуктов, содержание которых снижается.
Таким образом, корреляционных взаимосвязей между активностью АОС и функциональной активностью тромбоцитов при синдроме ишемии-реперфузии на сроке 1 час обнаруживается меньше, чем в физиологических условиях. Следует обратить внимание на появление сильных отрицательных связей между активностью СОД и показателями хемилюминесценции тромбоцитов (г = -0,63), что указывает на ее значимость как фермента «аварийного звена» антиоксидантной защиты [11].
Влияние «орозина» на коагуляционный гемостаз
Влияние КГП на светосумму АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов достоверно с вероятностью 3 0,95. Показатель силы влияния составляет 0,32±0,043. Влияние КГП на результативный признак составляет не менее 12,7% и не более 51,3% от общей совокупности факторов.
Таким образом, степень активации свободнорадикальных процессов при активации тромбоцитов в присутствии КГП повышается (увеличение свето-суммы медленной вспышки и ее длительности). В то же время, КГП достоверно не влияет на базисную активность СРО в тромбоцитах (светосумма за первую минуту).
Следующим этапом процесса тромбоцитарного гемостаза является агрегация, развивающаяся в ответ на высвобождение АДФ из плотных гранул тромбоцитов и мобилизацию внутриклеточного кальция. Это приводит к кон-формации рецептора GP ИЬ/Ша и обеспечивает его связывание с фибриногеном. В условиях in vitro данный процесс моделируется внесением экзогенного индуктора агрегации (АДФ), и оказывается возможным регистрировать две волны агрегации. Первая волна соответствует агрегации тромбоцитов под действием экзогенного индуктора и в ходе ее протекания происходит высвобождение эндогенных индукторов агрегации. Соответственно, вторая волна отражает агрегацию в ответ на эндогенный стимулятор и полностью зависит от степени выраженности реакции высвобождения.
Влиянию альфа-1-кислого гликопротеина на агрегационную способность тромбоцитов посвящены несколько работ, опубликованных в 70-80 гг. XX века, которые не формируют целостной картины. Поэтому влияние КГП на агрегабельность тромбоцитов было изучено в нескольких вариантах постановки опыта. На первом этапе изучали наличие у КГП собственного агрегирующего эффекта, для чего в тромбоцитарную плазму вносили КГП. Контролем служили пробы в которые добавляли АДФ. Результаты представлены на рисунке 2. КГП-индуцированная агрегация тромбоцитов АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов а і» v\ v Рис. 2. КГП- и АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов Таким образом, КГП в концентрации 3 мг/мл не обладает собственным агрегирующим эффектом. На втором этапе изучали влияние КГП на агрегационную способность тромбоцитов. Использовались три экспериментальные модели: 1) КГП вносили в тромбоцитарную плазму, после чего опытный и контрольный образцы инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре 18-20С. Известно, что «комнатная» температура является фактором, способным вызывать активацию тромбоцитов и повышать их агрегационно-адгезивную способность. Результаты представлены в таблице .
Таким образом, инкубация с КГП вызывает «перераспределение» вклада первой и второй волн агрегации тромбоцитов в общую амплитуду и длительность. Амплитуда и длительность первой волны увеличивается, а амплитуда второй волны, соответственно, уменьшается. 2) КГП добавляли в тромбоцитарную плазму, а через 1 минуту вносили индуктор агрегации - АДФ. В контроле использовалась та же плазма, но вместо КГП в нее добавляли физиологический раствор. Длительность контакта КГП с тромбоцитами до начала их стимуляции была минимальной. Результаты представлены в таблице
Скорость 2 волны, мм/мин 2,04±0,26 0,70 1,87±0,22 2,59 Примечание: п - число наблюдений, р - достоверные отличия от контроля по Z-критерию Вилкоксона (р 0,05)
Таким образом, при минимальном контакте с тромбоцитами (1-2 минуты) КГП в основном влияет на вторую волну агрегации, снижая ее амплитуду и укорачивая длительность. Скорость второй волны не изменилась. Общие параметры агрегатограммы также не изменились, за исключением укорочения общей длительности агрегации.
Для создания условий, максимально имитирующих физиологические, КГП вносили в тромбоцитарную плазму, после чего и контрольную, и опытную пробы инкубировали в термостате в течение 30 минут. Результаты представлены в таблице Таблица 59 Влияние КГП на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с ин кубацией при 37С в течение 30 минут (доза 3 мг/мл) Показатель Контроль (п=7) Орозин (п=7) Р М±т а М±т а Амплитуда агрегации, мм 35,3±3,56 9,42 32,6±3,91 10,3 Длительность агрегации, мин 7,25±1,13 3,00 5,67±0,91 2,42 0,05 Скорость агрегации, мм/мин 5,37±0,72 1,90 6,21±0,84 2,21 Амплитуда 1 волны, мм 28,4±2,84 7,52 28,0±3,41 9,01 Длительность 1 волны, мин 2,90±0,29 0,77 2,95±0,37 0,99 Скорость 1 волны, мм/мин 10,3±1,22 3,23 9,71±0,99 2,61 Амплитуда 2 волны, мм 6,8±0,99 2,61 4,43±0,84 2,22 0,05 Длительность 2 волны, мин 4,4±0,89 2,38 2,71±0,65 1,73 0,05 Скорость 2 волны, мм/мин 1,74±0,25 0,65 1,81±0,20 0,54 Примечание: п - число наблюдений, р - достоверные отличия от контроля по Z-критерию Вилкоксона (р 0,05)
Таким образом, инкубация в течение 30 минут при 37С принципиально не изменяет характер действия КГП на тромбоциты: укорачивается общая длительность агрегации, уменьшаются амплитуда и длительность второй волны при неизменных скоростных показателях.
В целом во всех трех сериях экспериментов выявлено, что КГП достоверно влияет на вторую волну агрегации тромбоцитов, снижая ее амплитуду и укорачивая длительность, не влияя при этом на скоростные показатели.
С целью оценки сочетанного влияния способа введения препарата (без инкубации, с инкубацией при 18С и при 37С) применен двухфакторный дисперсионный анализ. Результаты представлены в таблицах. Таблица 60 Двухфакторный дисперсионный комплекс по оценке влияния КГП и способа его внесения на амплитуду второй волны агрегации тромбоцитов
