Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 10
1.1 Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система (ГГАС) 10
1.1.1. Основы физиологии 10
1.1.1.1. Гипоталамический контроль синтеза АКТГ 10
1.1.1.2. АКТГ - глюкокортикостероиды 14
1.1.1.3. Механизмы обратных связей в ГГАС 16
1.1.1.4. ГГАС и цитокины 19
1.2. ГТАС и острое воспаление 22
1.2.1. Гипоталамус 25
1.2.1.1. Механизмы действия цитокинов 25
1.2.1.2. Эффекты цитокинов 27
1.2.2. Гипофиз 28
1.2.2.1 Восприимчивость к центральным (гипоталамическим) влияниям 28
1.2.2.2. Эффекты цитокинов 30
1.2.3. Надпочечники 31
1.2.3.1 Влияние АКТГ на стероидогенез 31
1.2.3.2. Эффекты цитокинов 32
1.3. ГГАС и хроническое воспаление 35
1.4. Заключение 37
2. Материалы и методы 38
2.1. Моделирование воспаления у крыс 38
2.2. In situ гибридизация 39
2.2.1. Краткая характеристика гибридизационных проб 40
2.2.2. Приготовление гибридизационных проб на основе клонированных в плазмиды векторов 40
2.2.3. Гибридизация мРНК с использованием рибопроб 41
2.2.4. Гибридизация мРНК с использованием олигопроб 42
2.2.5. Количественный анализ 42
2.2.6. Статистический анализ 43
2.3. Иммунная гистохимия 44
2.3.1. ДАБ-глюкозоксидазный метод 44
2.3.2. Радиоавтографическая иммунная гистохимия 45
2.4. Морфологическое исследование надпочечника 46
2.4.1. Световая микроскопи 46
2.4.1.1 Статистический анализ 46
2.4.2. Электронная микроскопия 47
3. Результаты собственных иследовании 47
3.1. Острое и хроническое введение ЛПС 47
3.1.1. Характеристика ГТАС при остром и хроническом воспалени 47
3.1.1.1 Вес животных и надпочечников 47
3.1.1.2. Гипоталамус 47
3.1.1.2.1 мРНККРГвПВЯ 47
3.1.1.2.2. мРНК рецептора КРГ в ПВЯ 49
3.1.1.2.3. КРГ-иммунореактивность в ПВЯ и СВ 50
3.1.1.2.4. мРНК мелкоклеточного ВП в ПВЯ 51
3.1.1.2.5. ВП-иммунореактивность в ПВЯ и СВ 53
3.1.1.2.6. Глюкокортикоидные рецепторы в ПВЯ 55
3.1.1.3. Гипофиз 56
3.1.1.3.1. мРНК ПОМК и КРГ-Р в аденогипофизе 56
3.1.1.4. Надпочечник 57
3.1.1.4.1. мРНК Пбета гидроксилазы в надпочечниках 57
3.1.1.4.2. Морфологическое исследование 57
3.1.1.5. Экспрессия мРНК цитокинов в мозге, гипофизе 68
3.1.1.5.1. Интерлейкин-Ібета 68
3.1.1.5.2. Интерлейкин-6 70
4. Обсуждение 72
4.1. Эффекты острого и хронического воспаления 72
4.1.1 Гипоталамус 72
4.1.2. Гипофиз 75
4.1.3. Надпочечник 77
5. Заключение 81
6. Выводы 85
7. Благодарности 87
8. Список литературы 88
- Гипоталамический контроль синтеза АКТГ
- ГГАС и хроническое воспаление
- Морфологическое исследование
- Надпочечник
Введение к работе
Актуальность проблемы
С позиций современной науки жизнь представляется динамическим процессом поддержания равновесия внутренней среды организма (гомеостаза), подверженнго постоянному воздействию внешних и внутренних агрессивных факторов - стрессоров. Независимо от своей природы и продолжительности, любой стрессор вызывает неспецифическую, стереотипную реакцию определенную Гансом Селье как "основной адаптационный синдром" [Selye 1936; Selye et al., 1949]. Дальнейшее развитие учения об адаптационном синдроме привело к заключению, что природа стрессирующего агента вносит определенную специфичность в характер адаптивного ответа. При этом исход ответа зависит от двунаправленного взаимодействия основных интегрирующих систем организма - нервной, эндокринной и иммунной (рис. 1). Такое тесное взаимодействие возможно благодаря единым сигнальным молекулам и рецепторам синтезируемым и экспрессируемым клетками и тканями обеих систем [Акмаев 1996, 2003; Акмаев и др.,2003; Гриневич и др., 1999; Turnbull, Rivier., 1999]. В силу значимости подобных взаимодействий на рубеже XX и XXI веков сформировалась новая медико-биологическая дисциплина - нейроиммуноэндокринология, которая объединяет и координирует исследования, направленные на изучение механизмов взаимодействия основных интегрирующих систем организма: нервной, эндокринной, иммунной [Боголепова, 1968; Акмаев, 1996, 1997; Акмаев, Гриневич., 2001, 2003]. Истоки этих взаимодействий следует искать в процессе эволюции самих интегрирующих систем [Акмаев, 2003], прообразы которых присутствуют у примитивных многоклеточных (Metazoa), таких как кишечнополостные и губки [Акмаев и др., 2001].
Ведущим нейроэндокринным компонентом единой интегрирующей
системы у млекопитающих является гипоталамо-гипофизарно-
адренокортикальная система (ГГАС), а иммунным — паттерн цитокинов -сигнальных молекул, вырабатываемых преимущественно клетками лимфоцитарного и макрофагально-мононуклеарного ряда [Elenkov et al., 1998; Maseketal., 2003].
Единство регуляторных систем наиболее ярко проявляется при воспалительной реакции. В основе ее реализации лежит феномен общеорганизменной хемокоммуникации - обмен информацией между клетками с помощью биологически активных веществ обладающих исключительной эволюционной консервативностью [Акмаев и др., 2002].
Цитокины, как главные факторы воспаления, оказывают разнообразные эффекты на нейроэндокринные нейроны гипоталамуса и клетки эндокринных желез, изменяя активность гормональных систем, которые в свою очередь компенсируют вызванные воспалением нарушения. Процесс регуляции воспаления должен быть чрезвычайно точным, поскольку недостаточный ответ не позволит элиминировать возбудителя, а чрезмерная активация грозит повреждением здоровых тканей и развитием аутоиммунной патологии.
Цель и задачи работы
Целью настоящей работы явилось изучение нейроиммуноэндокринных механизмов регуляции ГГАС в условиях хронического бактериального воспаления у крыс.
Для достижения данной цели мы поставили следующие задачи:
Разработать адекватную модель хронического бактериального воспаления путем введения крысам бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС).
Исследовать эффекты острого и длительного введения бактериального эндотоксина ЛПС на экспрессию генов основных гормонов ГГАС в гипоталамусе, гипофизе и надпочечниках.
Исследовать эффекты хронического бактериального воспаления на продукцию цитокинов в органах ГГАС.
Исследовать морфологию конечного звена ГГАС - надпочечников -при хроническом воспалении для выявления изменений как в стероидогенных клетках, так и для обнаружения возможных источников синтеза цитокинов.
Научная новизна исследования
На основании экспериментальных данных обнаружено несколько новых физиологических феноменов в нейроэндокринной и иммунной системах, сопутствующих острому и хроническому воспалению.
Впервые использована принципиально новая модель хронического бактериального воспаления (длительное введение ЛПС в нарастающих дозах), вызывающая в ГГАС изменения близкие к аутоиммунной патологии и выражающиеся в изменении экспрессии генов гормонов и их рецепторов.
Показано нарастание количества биологически-активных рецепторов к глюкокортикоидным гормонам в мелкоклеточной части паравентрикулярного ядра гипоталамуса при остром воспалении (однократное введение ЛПС) и его снижение до контрольных величин при хроническом воспалении (длительное введение ЛПС), что определяет регуляцию экспрессии гена кортиколиберина в этих условиях.
Обнаружено, что экспрессия генов центральных нейрогормонов ГТАС -ВП и КРГ, при хроническом воспалении не зависит непосредственно от локального или периферического синтеза цитокинов, интерлейкина-ір и интерлейкина-6, в то время как активация синтеза АКТГ в гипофизе коррелирует с нарастанием локальной продукции интерлейкина-ф, но не интерлейкина-6.
Световая и электронная микроскопия позволили выявить в надпочечнике характерные морфологические изменения, свойственные воспалительному процессу. Показана возможность локального влияния медиаторов иммунной системы, выделяемых активированными лейкоцитами, на стероидпродуцирующие клетки коркового вещества надпочечника.
Теоретическая и практическая значимость
Воспалительный процесс, имеющий глубокие эволюционные корни, неизменно привлекает специалистов в области биологии и медицины, как с точки зрения своей феноменологии, так и практического здравоохранения. Все исследования, проливающие свет на механизмы его реализации и понимания роли в этих механизмах взаимодействия основных регулирующих систем организма, представляются важными в своей концептуальной основе и значимыми для практической медицины, поскольку подводят теоретический базис к разработке новых диагностических критериев и терапевтических подходов к лечению и профилактике воспалительных процессов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Длительное введение бактериального эндотоксина в нарастающих дозировках, судя по состоянию ГГАС, воспроизводит изменения характерные для воспалительных процессов наблюдаемых в клинке и
10 других моделях хронического (аутоиммунного) воспаления у животных. Это характеризуется угнетением синтеза кортиколиберина и нарастанием экспрессии вазопрессина в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса, а также повышенным синтезом АКТГ в аденогипофизе и кортикостерона в надпочечниках.
Наблюдаемые в ГГАС изменения обусловлены влиянием основных провоспалительных цитокинов (интерлейкина-ір и интерлейкина-6) на различные ее звенья, преимущественно гипофизарно-адренокортикальную ось.
При хроническом воспалении происходит частичная автономизация функций надпочечников, вероятно обусловленная действием локальных факторов (включающих цитокины), основным источником последних служат клетки иммунной системы.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Гипоталамический контроль синтеза АКТГ
КРГ - основной гипоталамический 41-аминокислотный пептид с молекулярной массой 4670 Да, впервые выделенный из гипоталамуса овец в 11 1981 году и осуществляющий контроль синтеза ПОМК в аденогипофизе [Rivier, Vale., 1981]. КРГ принадлежит к семейству, включающему уротензин-1 (рыбы), саюважин (амфибии) и урокортин (млекопитающие) [Donaldson et al., 1996; Lederis et al., 1982a; Montecucchi et al., 1980; Vale et al., 1981,1997].
У различных видов млекопитающих КРГ нейроны широко распространены в различных отделах гипоталамуса, таких как: паравентрикулярное (ПВЯ) и супраоптическое ядро (СОЯ), латеральный гипоталамус, зона инсерта и премамиллярные ядра.
КРГ обнаружен также и за пределами гипоталамуса: в диагональном пучке Брока, [Гриневич и др., 1993, 1996; Olschowka et al 1982; Daikoku, Hisano., 1992], медиальном ядре септума, центральном ядре миндалины [Eliava et al., 2003], обонятельных луковицах, голубом пятне и парабрахеальном ядре [Olschowka et al., 1982; Daikoku, Hisano., 1992; Swanson, Sawchenko.,1983].
Основным источником КРГ, как центрального гормона ГГАС, являются нейросекреторные нейроны мелколеточной части ПВЯ. Основная часть их аксонов следует в наружную зону срединного возвышения (НЗСВ), откуда КРГ выделяется в портальный кровоток и действует на мембранные высокоаффинные места связывания на АКТГ клетках - сопряженные с G-белками семидоменные трансмембранные рецепторы, активация которых вызывает увеличение уровня внутриклеточного цАМФ.
К настоящему времени известны два типа таких рецепторов - КРГ-Р1 и КРГ-Р2 (а, Р, и у субтипы), обладающих приблизительно 70%-ной гомологией, но являющиеся продуктами двух различных генов [Turnbull, Rivier., 1997; Day et al., 2004]. Максимальная экспрессия КРГ-Р1 описана в аденогипофизе и мелкоклеточной части ПВЯ [Schulkin, Gold., 1998]. Помимо этого, данный тип рецептора широко распространен в различных отделах мозга и клетках иммунной системы. КРГ-Р2 в основном и экспрессируется в миндалине, гиппокампе и других субкортикальных струтурах, а также в эндотелии сосудов и сердца [Рыбникова и др., 2001; Wong et al., 1994; Audhya et al., 1991; Perrin, Vale., 1999].
Связывание радиолигандов и исследование систем вторичных мессенжеров показало, что КРГ-Р1 обладает высокой аффинностью к КРГ, урокортину и саюважину, в то время КРГ-Р2 - высокоаффинен только к двум последним. Поэтому, основную роль в регуляции ГГАС и действии КРГ на АКТГ- клетки аденогипофиза связывают именно с КРГ-Р1, что подтверждено в исследованиях на мышах, лишенных этого рецептора [Chen et al., 1993; De Sousa, 1995; Grigoriadis et al., 1996; Kishimoto et al., 1995; Kostich et al., 1998; Liaw et al., 1996; Lovenberg et al., 1995a,6; Montecucchi et al., 1980; Perrin et al., 1995,1998; Smith et al., 1998; Stenzel et al., 1995., Venihaki et al.,2001].
КРГ, как и большая часть нерастворимых гормонов, не имеет специальных транспортных белков. Их стимулирующее действие на клетки связано с мембранными рецепторам. Связывание КРГ с его рецептором стимулирует систему аденилатциклазы, что приводит к нарастанию уровня цАМФ. Этот процесс опосредуется по крайней мере двумя ГТФ -зависимыми регуляторными белками обозначаемыми Gi (ингибирующий) и Gs (стимулирующий). Аденилатциклаза, локализованная на внутренней поверхности плазматической мембраны, катализирует образование цАМФ из АТФ в присутствии ионов магния. цАМФ связывается с протеинкиназой, происходит активация С субъединиц последней. Данные субъединицы катализируют перенос концевой (у) фосфатной группы от АТФ на остаток серина или треонина в различных белках и таким образом гормон запускает каскад реакций фосфорилирования в клетке, причем один или несколько продуктов этого каскада служат внутриклеточными посредниками. Фосфорилирование CREB - конституционального фактора транскрипции в АКТГ - клетках аденогипофиза, приводит к увеличению уровня мРНК c-fos (белок раннего ответа). Связьшающий элемент для c-fos локализован в 1кзоне гена ПОМК [Bousquet et al., 1997]. Однако c-fos независимая индукция синтеза ПОМК может осуществляться еще через один КРГ-индуцибельный элемент в промоторе гена ПОМК, локализованный в позиции между 173-160 основаниями [Bousquet et al., 1997].
Помимо КРГ центральным регулятором синтеза ПОМК служит другой гипоталамический нейрогормон - аргинин-вазопрессин (ВП), синтезирующийся в аналогичной с КРГ мелкоклеточной части ПВЯ [Aguilera, 1994]. Причем, можно выделить две популяции таких нейронов -синтезирующие ВП и одновременно экспрессирующие как ВП, так и КРГ. Такая коэкспрессия нарастает у адреналэктомированных крыс, у которых по различным источникам от 50% до 90% нейронов мелкоклеточной части ПВЯ экспрессируют оба нейрогормона [Antoni, 1986; Aguilera, 1994; Sawchenko et al., 1984; Whitnall et al., 1985; Whitnall, 1988].
На АКТГ клетках имеются ВП-Р 1 типа (субтип б), существенно отличающийся от рецепторов на гладкомьппечных клетках сосудов (субтип а) и на эпителии собирательных трубочек почки (2 тип). Активация ВП-Р 16 не приводит, как в случае с КРГ, к активации цАМФ-зависимой трансдукции, но вызывает стимуляцию инозитол-фосфатного пути, что приводит к быстрой активации протеин-киназы С и нарастанию мРНК c-fos [Aguilera, 1994].
В физиологических условиях ВП потенцирует действие КРГ на АКТГ клетки и его собственное действие на синтез и выделение АКТГ в десятки раз ниже, чем КРГ [Antoni, 1986; Aguilera, 1994].
Помимо вазопрессина в одних и тех же нейронах с КРГ коэкспрессируется ряд нейропептидов. Наиболее известными из них являются нейропептид РАСАР {pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) и нейропептид Y (neuropeptide Y, NPY).
PACAP - полипептид, активирующий аденилат-циклазу в гипофизе. Этот нейропептид избирательно стимулирует уровни мессенжер-РНК (мРНК) КРГ как при центральном, так и при периферическом путях введения, что отражает его возможную роль в аутокриннои регуляции синтеза КРГ при стрессе [Гриневич, 1997а; Grinevich et al., 1997].
NPY - полипептид, стимулирующий фосфорилирование CREB в КРГ нейронах. Действие данного полипептида связано с действием на МС4 рецептор и усилением эндотоксинстимулированной экспрессии генов iNOS, COX-2[Caruso et al.,2004]. Также NPY ослабляет потенциалзависимый выход кальция и действуя главным образом через рецепторУІ, усиливает спонтанную импульсацию, снижая, в конечном итоге, активность пре- и постсинаптической передачи, что так же не исключает его роли в аутокриннои регуляции синтеза КРГ при стрессе [Sarkar, Lechan., 2003; Campbell et al., 2003; Chowdhury et al., 2004; Fu et al., 2004].
ГГАС и хроническое воспаление
Обычно ответ на стресс с сопутствующей активацией ГГАС является процессом острым, т.е. ограниченным по продолжительности. Вызванные активацией ГГАС катаболический, антирепродуктивный и иммуносупрессивный эффекты носят временный характер и оказываются целесообразнее, чем повреждение упомянутых систем и функций медиаторами воспаления.
В противоположность острому процессу, хроническая активация ГГАС ведет к развитию синдромального состояния впервые описанного Г. Селье, и характеризующегося гипертрофией и нарастанием стероидогенной активности коры надпочечника, инволюцией тимуса и появлением язв слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта [Selye, 1936].
В патогенезе данного состояния, вероятно, лежит длительное повышение уровней гормонов стрессорной оси и цитокинов, что с одной стороны обеспечивает координацию поведенческих реакций, нейроэндокринной и автономной адаптации, а с другой ведет к токсическому воздействию на ряд систем и органов [Buckingham et al.,1996]. При этом крайне трудно создать адекватную экспериментальную модель, вызывающую в целостном организме реальную картину хронического воспаления, которую мы видим в природе и клинике. Кроме того, практически невозможно смоделировать хроническое воспаление in vitro. Если острое воспаление и ГГАС изучались главным образом в моделях с использованием бактериального эндотоксина, то попытки длительного введения ЛПС заканчивались безуспешно, поскольку введение животным ЛПС в одной и той же дозировке в течение 5-7 дней приводило к десенситизации к этому препарату [Grigoriadis et al., 1996].
Однако, состояние ГГАС было изучено в экспериментальных моделях хронического воспаления аутоиммунного характера, созданных группами Lightman a (Университет Бристоля, Соединенное Королевство) и Strenberg a (Национальные Институты Здоровья США), состояние ГГАС в которых мы опишем далее. Этими моделями были: 1) Артрит вызванный введением аадъюванта (АА). Животным вводился адьювант - Micobacteria tuberculosi и через 14 дней у животных развивалось аутоиммунное поражение синовиальных влагалищ мелких суставов конечностей [Besedovsky, Del Rey., 1996; Borque, Oliet, 1997]. 2) Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ). Крысам вводили гомогенаты головного и спинного мозга (энцефалолитогена) кроликов с добавлением адьюванта. Это вызывало аутоиммуное поражение ткани мозга с характерными неврологическими симптомами - парезами и плегиями хвоста и конечностей и смертью, вызванной поражением сосудодвигательного и дыхательного центров ствола [Blatteis, Sehic, 1992]. 3) Системная красная волчанка (СКВ). Использовалась линия мышей MRL/lpr, у которых вследствие генетических дефектов спонтанно развивалась красная волчанка с характерными поражениями кожи, почек и нервной системы. Основными патофизиологическими агентами при этом служили высокие титры аутоиммуных антител к мембранам цитоплазмы, ядра и ДНК [Elmquist et al., 1997]. При исследовании ГГАС во всех этих состояниях (в фазах наибольшей выраженности патофизиологических проявлений) были обнаружены аналогичные черты: 1) повышенные уровни АКТГ и ГК в крови, которые, как считается, в ходе хронического воспаления лимитируют его развитие. Так, показано, что удаление надпочечников у животных с АА и ЭАЭ животных приводило к их быстрой гибели, а экзогенное введение ГК - позволяло им выживать [Chikanza, Grossman., 1998; Blatteis, Sehic, 1992]. 2) Парадоксальное подавление синтеза КРГ, экспрессии его рецептора в ПВЯ и выделения КРГ в портальный кровоток [Donaldson et al., 1996]. До сих пор не ясно, что является причиной этих изменений. С одной стороны, длительное повышение уровней ГК напрямую (через рецепторы 2 типа в ПВЯ) или опосредованно через гиппокамп (рецепторы 1 типа) может приводить угнетению синтеза КРГ по механизму отрицательной обратной связи. С другой - при хроническом воспалении возможен дисбаланс в афферентации КРГ нейронов: в гипоталамусе изменяются соотношения серотонина субстанции Р и норадреналина [Akmayev, 1986]. Определять этот дисбаланс могут ноцицептивная система мозга (всем этим состояниям присуща боль) и подавление пищевых центров. Помимо этого, возможно, пролонгированное воздействие цитокинов на КРГ нейрон вызывает какие-то изменения в транскрипционной активности его гена. 3) Нарастание экспрессии ВП в КРГ нейронах ПВЯ. Остается неясным, почему в одной и той же клетке ген КРГ столь чувствителен к действию ГК (возможно и других факторов), а ген ВП - нет, хотя оба имеют в промотороном участке негативный ГК - отвечающий элемент [Chover Gonzalez et al., 1994]. Обобщая представленные в этой главе данные, можно заключить, что при остром воспалении (введение эндотоксина ЛПС) происходит активация всех звеньев ГГАС и существенная модификация механизмов прямых и обратных связей в этой системе. Действие различных физиологических/патофизиологических факторов ведет к активации интегрирующих систем организма, в том числе иммунной, изменяя динамику секреции медиаторов иммунной системы и рецепторов к ним. Цитокины при этом являются основным регулирующим инструментом в процессе коммуникации с нейроэндокринной системой. Наиболее «слабым» аспектом в изучении ГГАС является ее состояние при хроническом воспалении. В этом ключе, на первый план выступают следующие вопросы: 1) Возможно ли в принципе создать модель с использованием бактериального эндотоксина, аналогичную аутоиммунным экспериментальным состояниям и (или) сопоставимую с клинической картиной бактериального воспаления? 2) Каковы изменения в рецепторной чувствительности мелкоклеточных нейронов ПВЯ к ГК при хроническом воспалении? 3) Какова роль основных провоспалительных цитокинов в регуляции ГГАС при хроническом воспалении? 4) Какие клетки в органах ГГАС могут служить источником цитокинов?
Морфологическое исследование
Однократная инъекция ЛПС приводила к нарастанию уровней мРНК КРГ и его рецептора в мелко и крупноклеточных частях ПВЯ гипоталамуса, что согласуется с данными группы Rivest из университета Лаваля, Канада [Rivest, Laflamme., 1995]. В работах данной группы тоже было обнаружено, что после введения ЛПС происходит повышение плотности метки мРНК ВП в мелкоклеточной части ПВЯ. Наши данные, основанные на морфологической идентификации мелкоклеточных нейронов, показывают совершенно отчетливое нарастание уровней мРНК ВП в КРГ нейроне после введения ЛПС. Смыслом подобной коэкспрессии могут быть альтернативные пути трансдукции через цАМФ (КРГ) и протеинкиназу А (ВП) синтеза АКТГ [Gilles et al., 1982; Munk et al., 1984; Aguilera, 1994; McEwen et al., 1997; Гриневич и др., 1999].
Хотелось бы отметить, что экспрессия мРНК КРГ и КРГ-Р1 коррелируют друг с другом при остром воспалении, что указьшает на роль этого рецептора в ауторегуляции КРГ нейрона. Хотя до сих пор нет однозначных свидетельств этой зависимости [Luo et al., 1994], можно лишь предполагать, что локальное выделение дендритами КРГ приводит к связыванию КРГ с рецептором, что активирует цАМФ и стимулирует транскрипцию гена КРГ. На нокаутных по гену рецептора КРГ мышах отмечается снижение синтеза самого КРГ [Smith et al., 1999]. Таким образом, КРГ-синтезирующий нейрон может представлять собой некую замкнутую саморегулируемую систему, что проявляется как при остром воспалении, так и при хроническом (о чем речь пойдет далее).
Пожалуй, самой интересной и приоритетной находкой при остром введении ЛПС было обнаружение парадоксального нарастания количества биологически-активных, «открытых» ГК рецепторов в мелкоклеточной части ПВЯ (хотя известно, что нейрогенные стрессы приводят к «даун-регуляции» ГК рецепторов) [Herman et al., 1995, Makino et al., 1995]. Это вызывает снижение ингибирующего действия ГК на КРГ нейрон по принципу обратной связи и способствует его активации при стрессе. Скорее всего, именно поэтому ГК не подавляют стресс-индуцированную (иммобилизация и инъекция болевого 1.5М раствора NaCl) экспрессию мРНК КРГ, что было недавно показано [Гриневич и др., 1999; Grinevich et al., 2001].
Важно отметить, что после длительного введения ЛПС количество рецепторов ГК в мелкоклеточной части ПВЯ у этих животных достоверно не отличается от контроля (с некоторой тенденцией к нарастанию). Снижение количества «открытых» ГК рецепторов (по сравнению с однократным введением ЛПС) отражает процесс их связывания и транслокации в ядро. Это может лежать в основе угнетения транскрипции гена КРГ в условиях хронического воспаления, указывая на реализацию длинной отрицательной обратной связи на гипоталамическом уровне. Нельзя исключать и роли цитокинов в регуляции экспрессии рецепторов в ГГАС. Так известна ингибирующая роль ИЛ-1а на процесс транслокации ГК-Р в ядро и индукции транскрипции ГК- чувствительных генов, через активацию р38 МАРК (mitogen- activated protein kinase) [Wang et al., 2004].
Следует также учитывать, что ГК могут также действовать на КРГ-синтезирующий нейрон не прямо - через ядерные или цитоплазматические рецепторы, а опосредовано - через стероид-связывающий сайт рецептора основного ингибиторного нейротрансмитттера в гипоталамусе - ГАМК, что впервые было описано в 1998 [Givalois et al., 1998]. Было показано, что активация ГАМК/безодиазепинового комплекса (тип А рецептора ГАМК) существенно модифицируется циркулирующими адреналовыми (но не половыми) стероидами. Так, в условиях адреналэктомии активация этого комплекса селективным агонистом (продукт процессинга бензодиазепина -октадеканейропептид) приводила к инверсии в реакции КРГ-синтезирующего нейрона - вместо ожидаемого подавления экспрессии мРНК КРГ наблюдалось нарастание его синтеза, что указывало на роль ГК в процессе транссинаптической передачи через ГАМКА рецептор [Givalous et. al., 1998]. Первые сведения об источнике ИЛ-1 в ПВЯ были получены с помощью метода иммунной гистохимии с использованием поликлональных антител.
При этом было показано, что ИЛ-1-иммунореактивность присутствует в нейронах и их отростках мелко- и крупноклеточных частей ПВЯ и СОЯ у крысы и человека [Breder, Dinarelo., 1988; Lechan et al., 1990]. В дальнейшем попытки подтвердить эти данные к успеху не привели. И только десятилетие спустя в ряде работ, включая работы нашей группы, стали появляться данные о присутствии мРНК ИЛ-1 в ПВЯ (но не СОЯ) у крыс после инъекции ЛПС.
Однако морфологический анализ распределения метки показал, что источником синтеза ИЛ-1 в ПВЯ служат не нейроны, а глиальные элементы (скорее всего микроглия) [Quan et al., 1998], что подтверждается нашими исследованиями и данными представленными группой Swaab (Голландия) о присутствии ИЛ-1-иммунореактивности в нейронах гипоталамуса у людей [Huitinga et al., 2000]. Причем иммунореактивное вещество локализовалось как в мелкоклеточных КРГ-синтезирующих, так и в крупноклеточных окситоцин-синтезирующих нейронах.
Противоречия между данными, полученными с помощью in situ гибридизации и иммунной гистохимии могут объясняться двояко: либо ИЛ-1 действительно синтезируется в нейронах гипоталамуса, но уровни его мРНК в перикарионе столь низки, что лежат за пределами чувствительности метода in situ гибридизации, либо этот пептид захватывается из окружающих нейрон глиальных клеток, которые, способны к синтезу цитокинов [Ledebouer et al., 2000]. При этом также нельзя исключить варианта присутствия в нейроэндокринном нейроне не ИЛ-1, а подобного ему пептида, синтез которого кодируется иной мРНК.
Надпочечник
Длительное введение ЛПС в нарастающих дозировках оказывало характерное для хронического стресса и хронического воспаления общеорганизменное влияние, снижая динамику роста животных, увеличение массы их надпочечников. Увеличение ширины коркового вещества надпочечника в острой фазе, вероятно, связано с реактивным отеком сопровождающим перитонит. При этом, сравнительно большая ширина коры через 6 ч после однократного введения ЛПС, также может быть обусловлена ослаблением острофазного полнокровия сосудов и уменьшением отека от 6 к 24 часам, когда бо лыпая ширина коркового вещества обусловлена только функциональной гипертрофией.
Помимо этого в корковом веществе надпочечников отмечается нарастание уровня мРНК Пр-гидроксилазы, (цитохром, конвертирующий гидроксикортикостерон в кортикостерон), что отражает увеличение синтеза и содержание кортикостерона в крови. Причем это нарастание превосходило таковое при однократном введении ЛПС. При этом уровни мРНК цитокинов, ИЛ-1 и ИЛ-6, в селезенке также не отличались от уровней при остром введении ЛПС, что указывает на отсутствие десенситизации к препарату.
Работы последних лет в значительной мере сместились в область молекулярных исследований, что с одной стороны позволяет раскрыть молекулярные механизмы межсистемных взаимодействий, но с другой оставляет неясными тканевые и клеточные механизмы их реализации. Комплексного исследования ГГАС с детальным морфологическим исследованием надпочечников при хроническом воспалении проведено не было.
Данные, полученные при морфологическом исследовании надпочечника на световом уровне, демонстрируют выраженные неспецифические изменения наблюдаемые в различных органах (в нашей ситуации органов брюшной полости) и характерные для воспалительных процессов, оказывающих системное влияние.
Вероятно, в основе сосудистых изменений в надпочечнике, как и других органов брюшной полости, лежит гиперсекреция клеточных и активация плазменных медиаторов воспаления (гистамина, серотонина и кининов). Данные вещества являются инициальными факторами в развитии экссудативных реакций, усиливая проницаемость сосудистого русла в том числе и для форменных элементов крови. Особое внимание мы уделяли элементам клеточного инфильтрата надпочечника. Полученные нами данные согласуются с патофизиологическими изменениями сопровождающими бактериальное воспаление, когда на смену преимущественно полиморфноядерному инфильтрату, отражающему активность процесса к 6 часам происходит увеличение количества мононуклеаров многие из которых имеют морфологию малых лимфоцитов, в том числе НК (натуральных киллеров), способных оказывать цитотоксическое действие [Masek et al., 2003]. Такая динамика говорит о том, что в группе животных, длительно получавших ЛПС и забитых через 6 ч после последней инъекции на фоне выраженности воспалительного процесса, связанного с длительным введением антигена, сохраняется его активность вызванная новой инъекцией антигена.
В группах 24 часа острота процесса падает. Тем не менее, сохраняющийся воспалительный процесс заставляет функционировать ГГАС на пределе функциональных возможностей. Продукты выделяемые активированными иммуноцитами инфильтрирующими надпочечник с одной стороны, способны оказывать стимулирующее действие на секреторные клетки (цитокины), а с другой стороны (ферменты активированных макрфагов, НК, продукты респираторного взрыва) оказывают токсическое действие на функционально перегруженные клетки, что в конечном итогоге приводит к их деградации и возможной гибели части из них. Тот факт, что при хроническом воспалении максимальное количество клеток крови выявлено в периферическом отделе пучковой зоны и сетчатой зоне, так же подтверждает теорию о роли клеток ИС в локальной регуляции ГГАС и в частности, ее периферического отдела посредством выделения различных медиаторов, в том числе цитокинов. Однако, в работе В.В.Гриневича и соавт. с использованием модели артрита, вызванного введением адьюванта, показано отсутствие достоверного нарастание уровней ИЛ-1 и ИЛ-6. Это может говорить о роли других медиаторов воспаления и в частности цитокинов, (по аналогии с ИЛ-6 в гипофизе) или о недостаточной чувствительности метода in situ гибридизации, которая использовалась в этой работе [Grinevich et al.,2002.]. Изменения же в циркуляторном русле демонстрируют предпосылки для такой "точечной" регуляции (Рис.27). Как дополнительное свидетельство роли клеток белого ростка крови служит работа De Rijk в которой демонстрируется значительное снижение ЛПС индуцированных уровней циркулирующегоИЛ-1 после деструкции макрофагов [De Rijk et al., 1991]. He следует исключать из списка возможных источников тканевых цитокинов стероидогенные клетки, фибробласты и другие элементы стромы. Наиболее наглядные изменения получены с помощью электронной микроскопии. Электронно-микроскопическая картина свидельствует в пользу активации стероидогенеза в адренокортикоцитах. Увеличение площади сечения клетки без деструкции ее компонентов в острой фазе воспалительного процесса является объективным ультраструктурным критерием высокой функциональной активности клеток. Развитие воспалительного процесса от острого к хроническому ведет к значительным тканевым изменениям. Отчетливое усиление процесса деструкции везикулярных крист митохондрий с дезорганизацией их наружной и внутренней мембран, отеком, увеличением числа первичных лизосом и аутофагосом в адренокортикоцитах, пикнозом, рексисом ядер, являются электронно-микроскопическим признаком ранней фазы апоптоза [Bornstein et al.,1998]. Однако нельзя однозначно говорить об исходе данных изменений и гибели упомянутых клеток через апоптоз.
