Введение к работе
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания - наиболее распространенная причина смертности в развитых странах. Большинство сердечнососудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов человека
Одним из ключевых моментов патогенеза атеросклероза является внутриклеточное накопление липидов, в частности эфиров холестерина, в протеогликановом слое интимы артерий [Аничков, 1947; Smith, 1974; Houst, 1978; Mahley, 1979; Fowler et al, 1979] Было показано, что эти липиды ведут свое происхождение от циркулирующих в крови липопротеидов низкой плотности (ЛНП) [Alaupovic, 1971; Cookson, 1971]. Однако нативные ЛНП не вызывают накопления липидов в культуре клеток [Bates et al., 1976, Ross, Harker, 1976; Goldstein et al., 1979] С другой стороны, было продемонстрировано, что различным образом модифицированные in vitro ЛНП (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, окисленные, гликозилированные и т.д.) характеризуются атерогенностью -способностью вызывать накопление липидов в культивируемых клетках [Goldstein et al, 1979, Fogelman et al, 1980; Khoo et al., 1990, Lopes-Virella et al., 1988].
Было показано, что модифицированные разными способами ЛНП образуют ассоциаты, и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства [Tertov et al. 1989] Этот факт был подтвержден многими исследователями, изучающими захват клетками ассоциатов ЛНП, полученных in vitro любыми способами: вортексирование (интенсивное встряхивание) [Buton et al, 1999, Liorente-Cortes et al, 2000, Zhang et al, 2000], окисление медью [Hoffet al, 1992], окисление азо-инициатором [Kawabe et al, 1991; Tertov et al, 1998], обработка гипохлоритом [Hazell et al, 1994, Tertov et al., 1998; Панасенко с соавт, 2004], миелопероксидазой [Панасенко с соавт., 2004], фосфолипазой С [Zhang et al, 2000], сфингомиелиназой [Zhang et al., 2000; Marathe et al, 1999], протеазами [Piha et al, 1995], гликозидазами [Панасенко с соавт., 2006]. После установления факта атерогенности модифицированных т vitro липопротеидов приобрел актуальность вопрос о существовании подобных ЛНП т vivo.
В крови больных ишемической болезнью сердца были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные ЛНП (цммЛНП) [Orekhov et al., 1989; Tertov et al., 1990], значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам Так, они имели пониженное содержание сиаловой кислоты, маннозы и других Сахаров. В крови человека были обнаружены также так называемые мелкие, плотные [Shen et al., 1981; La Belle and Krauss, 1990, Avogaro et al., 1991] и электроотрицательные [Avogaro et al., 1988] ЛНП. И мелкие, плотные, и электроотрицательные ЛНП обладают весьма сходными, если не идентичными с цммЛНП свойствами и, по-видимому, представляют собой одну и ту же подфракцию липопротеидных частиц, подвергшихся множественной модификации in vivo [Tertov ct al 1995]. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП обладают двумя общими важнейшими свойствами: стимулируют липоидоз на клеточном уровне (являются атерогенными) и проявляют склонность к ассоциации, причем, их атерогенный потенциал напрямую зависит от устойчивости к ассоциации и увеличивается с ее понижением [Orekhov et al., 1990; Tertov et al, 1989,1998]
Было установлено, что' без модификации ЛНП невозможна их ассоциация, без ассоциации ЛНП не проявляют выраженные атерогенные свойства [Tertov et al 1989] В связи с этим, представляет значительный интерес изучение механизмов ассоциации; изменений, которые происходят в частице ЛНП, теряющей устойчивость к ассоциации; а также выявление агентов, способствующих модификации липопротеидов и стимулирующих ассоциацию ЛНП, и, кроме того, ингибиторов ассоциации ЛНП. Учитывая это, цели и задачи настоящей работы были сформулированы следующим образом'
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение стимуляции ассоциации ЛНП ферментами и альдегидами эндогенного происхождения, ведущей к изменению основных структурных компонентов ЛНП, характеристика происходящих под влиянием различных модификаторов изменений главного стабилизирующего компонента частицы ЛНП - апоВ-100, поиск и изучение свойств экзогенных ингибиторов ассоциации ЛНП.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи;
Изучение ассоциации ЛНП крови человека, происходящей вследствие их протеолитической, липолитической, окислительной, десиалирующей модификации, а также модификации альдегидами эндогенного происхождения, ведущей к изменению основных структурных компонентов частицы ЛНП белка, липидов, полисахаридов
Используя панель моноклональных антител к апоВ-100, сравнить особенности пространственного расположения этого белка в различным образом модифицированных т vitro ЛНП и в цммЛНП.
3 Изучить влияние экзогенных биодоступных амфифильных блок-сополимеров окиси пропилена и окиси этилена (шпороников) на ассоциацию ЛНП.
Научная новизна работы. В работе впервые с использованием широкой панели моноклональных антител как к нативным, так и к модифицированным ЛНП исследованы особенности расположения антигенных детерминант апоВ-100 в циркулирующих модифицированных ЛНП и ЛНП, модифицированных in vitro протеолитическими, липолитическими, окислительными, десиалирующими ферментами, а также альдегидами эндогенного происхождения. Показано, что модификация ЛНП перечисленными выше агентами вызывает ассоциацию ЛНП Выявлено ингибирующее действие плюроников на ассоциацию ЛНП; изучено влияние структуры и свойств плюроника на способность подавлять ассоциацию ЛНП
Теоретическая значимость работы В диссертации показано, что изменение физико-химических свойств частиц ЛНП, которое может происходить в организме под воздействием различных модификаций, снижает их устойчивость к ассоциации Кроме того, показана возможность подавления ассоциации ЛНП при помощи экзогенных биодоступных полимеров - плюроников.
Практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер, тем не менее, полученные результаты могут иметь практическое значение. Полученные результаты
открывают перспективы разработки принципиально новых подходов и средств, направленных на стабилизацию и повышение устойчивости ЛНП к ассоциации с целью профилактики, замедления или предотвращения агрегации ЛНП, а вместе с ней и торможения процессов отложения липидов в сосудистой стенке, а значит и развития ранних стадий атеросклероза
Положения выносимые на защиту:
1. Модификация любого компонента ЛНП (белка, липида, полисахарида) не
зависимо от ее химической природы снижает устойчивость частиц ЛНП, вызывая их ассоциацию
Сравнение антигенных профилей цммЛНП и ЛНП, ферментативно модифицированных т -vitro, свидетельствует о том, что ни одна из ферментативных модификаций (протеолиз, липолиз, десиалирование, окисление) не воспроизводит полностью изменений пространственного расположения апоВ-100 на поверхности частицы ЛНП, наблюдающихся в случае цммЛНП. Это значит, что формирование структуры цммЛНП является следствием множественной модификации лшюпротеидной частицы, происходящей т VIVO
Экзогенные амфифильные блок-сополимеры окиси пропилена и окиси этилена -плюроники подавляют ассоциацию ЛНП. Эта способность зависит от гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования плюроника, что свидетельствует о важной роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП
Апиобапия работы Материалы диссертации были представлены на: 13-м Международном симпозиуме по атеросклерозу (Киото, 2003); 75-м Конгрессе европейского атеросклеротического общества (Прага, 2005); 76-м Конгрессе европейского атеросклеротического общества (Рим, 2006), Третьем Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2006)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ в центральных академических, медицинских и международных изданиях.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, четырех глав с результатами экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 116 стр , содержит 14 таблиц, проиллюстрирована 25-ю рисунками и схемами Библиография включает 125 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов
Обзор литературы
В обзоре литературы рассмотрены современные представления о роли модифицированных разными способами ЛНП в развитии атеросклероза, охарактеризованы циркулирующие в крови человека множественно модифицированные ЛНП, показано, что любая модификация
ЛНП in vitro приводит к снижению их устойчивости, увеличивая склонность к ассоциации. Увеличенные в размерах ассоциаты ЛНП вызывают интенсивное накопление холестерина в культуре клеток интимы.
