Введение к работе
з
Актуальность проблемы
Функционирование системы гемостаза в физиологических условиях включено в эффективное кровоснабжение тканей, предупреждение кровопотерь, тромбозов, ишемий и инфарктов, защиту от диссеминации бактерий и токсинов. В то же время чрезвычайные по силе или продолжительности воздействия вовлекают реакции гемостаза в механизмы заболеваний, как в качестве центральных звеньев патогенеза, так и в качестве усугубляющих первичное повреждение [Балуда В.П., 1995; Петрищев Н.Н., 2000; Баркаган З.С., 2001; Воробьев А.И., 2001; Макацария А.Д., 2002; Кузник Б.И., 2004]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов свертывания крови и тромбообразования, артериальная, венозная или системная тромбоэмболия остается основной причиной смерти и нетрудоспособности населения индустриально развитых стран [Nordstrom М. et al, 1992; Sallah S. et al, 2002; Nowak-Gottl U. et al, 2003/2004].
Развитие теории свертывания крови, в основе которой лежит главенство тканевого фактора в инициации тромботического процесса, а также активное участие клеток крови и эндотелия в ключевой составляющей свертывания - генерации тромбина, расставляет новые акценты в патогенезе тромбозов. Гиперкоагуляционное или претромботическое состояние развивается как следствие преобладания активации прокоагулянтных факторов над антикоагулянтными, представления о которых продолжают уточняться. Несколько десятилетий назад клеточные и плазменные компоненты системы гемостаза были дополнены субклеточными элементами - мембранными фрагментами - микровезикулами, отделяемыми при активации и апоптозе клеток и обладающими прокоагулянтной активностью клеточного источника [Wolf Р., 1967; Зубаиров Д.М. и др.,1974]. Они признаны не только полноправными компонентами системы гемостаза, но и рассматриваются в качестве важнейших участников инициальных событий активации свертывания крови и тромбообразования [Зубаиров Д.М., 2000; Scholz Т. et al, 2002; Furie В. et al, 2005; Sinauridze E.I. et al, 2007]. Везикуляция клеток рассматривается, как способ увеличения прокоагулянтной поверхности, поскольку также, как и активированные клетки, микровезикулы снабжены аминофосфолипидами, необходимыми для сборки факторов свертывания крови в теназный (ГХа с Villa) и протромбиназный (Ха с Va) комплексы. Функциональные комплексы адгезии на микровезикулах, происходящих из тромбоцитов, опосредуют их взаимодействие с фактором фон Виллебранда, коллагеном, фибрином и фибриногеном [Miyazaki Y. et al, 1996; Siljander P. et al, 1996; Holme P.A. et al, 1997]. Однако микровезикулы не только несут доступный фосфатидилсерин и адгезивные белки или
4 комплексы, но также другие прокоагулянтные молекулы, и в первую очередь тканевой фактор, если они происходят из клеток, экспрессирующих эти вещества [Miiller I. et al, 2003].
Роль микровезикул в патологических процессах остается предметом дискуссии. С одной стороны, выявляется повышение уровня микровезикул крови при целом ряде заболеваний, сопровождающихся гиперкоагулемией [Mallat Z. et al, 2000; Kim H.K. et al, 2003; Preston R.A. et al, 2003]. Вместе с тем, в контексте гемостатических реакций повышенный уровень микровезикул не обязательно ведет к тромбозу, поскольку они могут также стимулировать экспрессию антикоагулянтнои активности активированного протеина С [Tans G. et al, 1991], а содержание фасфатидилсерина может меняться в зависимости от типа клетки, предмета и условия индукции микровезикуляции [Weerheim A.M. et al, 2002; Freyssinet J-M., 2003]. Кроме того, высокий уровень микровезикул может быть проявлением адаптивных изменений при патологии. Так, при аутоиммунной тромбоцитопении, более высокий уровень микровезикул был обнаружен у пациентов без геморрагических осложнений, что предполагает их адаптивную гемостатическую роль. Это продемонстрировано также при гемофилии, где уровень микровезикул выше нормального и может повышаться при развитии острого кровотечения, как отражение мобилизации системы гемостаза без угрозы тромботических осложнений, так как имеется недостаточность образования тромбина [Horstman L.L. et al, 1992; Proulle V. et al, 2001]. To есть микровезикулы, участвующие в физиологическом гемостазе, в целом выполняют адаптивную функцию.
Предполагается, что механизмы вовлечения микровезикул в физиологические и патологические процессы многообразны. Допускается, что их количество - определяющий физический фактор, что подразумевает проявление патогенных свойств микровезикул только после достижения их числа внепороговых значений. Исходя из концепции гомеостаза, уровень этих субклеточных образований, вероятно, отражает баланс между пролиферацией, активацией и смертью клетки. Сдвиг в одном из этих направлений ведет к патологическим нарушениям с существенными изменениями в составе микровезикул, зависящими от природы стимула, а дополнительно образующиеся микровезикулы вызывают усиление ответа в клетках-мишенях или реципиентах.
С тех пор, как достигнут относительный консенсус в определении этих субклеточных образований, характеристики микровезикул пополняются в рамках расшифровки механизма отторжения фрагментов клеточных мембран и внекоагуляционного значения этого процесса - их роли, как одной из форм межклеточной сигнализации. Вместе с тем, с точки зрения интегрального вклада микровезикуляционного механизма в адаптивные и патогенные последствия мобилизации системы гемостаза in vivo, представляется важным определение
5 динамики микровезикуляции на ранних этапах гемостатической реакции. Кроме того, система гемостаза, как всякая открытая система в организме, использует различные сценарии развития реакций при воздействии разных стимулов. Расшифровка особенностей микровезикуляции в этих обстоятельствах, расширит представления о механизмах острых гемокоагуляционных реакций и о возможности применения количественных и качественных характеристик микровезикул, как маркера при изучении коагуляционных нарушений.
Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором определены следующие цели и задачи.
Цель исследования
Определение патогенетической роли микровезикуляции клеток крови при острых гемостатических реакциях.
Задачи исследования
-
Оценить динамику микровезикуляции в ответ на краткосрочный однократный стресс при острой кровопотере, соотнести ее с изменениями гемостаза
-
Определить роль вазоактивных гормонов - адреналина и вазопрессина как индукторов микровезикуляции при острой гемостатической реакции.
-
Определить динамику микровезикуляции при персистенции внутрисосудистого прокоагулянтного стрессора - на ранних сроках эндотоксинемии и в ходе развития синдрома ДВС.
-
Исследовать прокоагулянтный фенотип микровезикул и оценить динамику их количества в системном кровотоке и на участке активации гемостаза, индуцированного на фоне гиперкоагулемии физиологическими родами.
-
Провести сравнительное исследование количественных и качественных характеристик микровезикул при физиологическом и оперативном родоразрешении.
Научная новизна
Впервые исследована динамика уровня микровезикуляции в крови на ранних стадиях
мобилизации гемостатических реакций in vivo, как функции различных моделей активации
клеток-эффекторов гемостаза. Показано, что острые стрессоры - массивная кровопотеря,
эндотоксинемия, гиперадреналинемия, 1 -дезамино-8-0-аргинин-вазопрессинемия,
инициирующие гиперкоагуляцию, индуцируют отделение клеточных микровезикул и диссеминацию их в системный кровоток в короткие сроки (15 минут). Выявлено, что интенсивность микровезикуляции под влиянием однократных стрессоров - адреналинемии и кровопотери меняется кратковременно. Длительное усиление микровезикуляции при
эндотоксинемии сопровождается развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания.
Впервые определен уровень и прокоагулянтный фенотип микровезикул в системном кровотоке и в маточной крови в динамике родоразрешения. Выявлено пространственное ограничение микровезикуляционной реакции при физиологическом родоразрешении, характеризующееся образованием в 11 раз большего количества микровезикул с двукратно повышенной экспрессией фосфатидилсеринов на плацентарной площадке. Впервые выявлено принципиальное различие процесса микровезикуляции при физиологическом и оперативном родоразрешении, состоящее в образовании микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов в системной циркуляции в динамике кесарева сечения. Таким образом, показан один из механизмов дезадаптации гемостатического ответа и повышенного риска развития тромбогеморрагического синдрома при оперативном родоразрешении.
Практическая значимость состоит в разработке нового подхода к оценке патогенеза коагуляционных нарушений, как базы для совершенствования диагностики и методов терапии протромботических состояний, основанного на расширении знаний о механизмах, вовлеченных в формирование гиперкоагулемии. Полученные данные о динамике микровезикуляции в крови, отражающей степень мобилизации системы гемостаза, позволяют считать образование микровезикул универсальным механизмом стрессовой реакции клеток и использовать определение количества микровезикул для выявления инициальной стадии острой гиперкоагулемии. Прокоагулянтный фенотип микровезикул, оцениваемый методом проточной цитометрии по уровню связывания липофильного флюорохрома мероцианина 540, может использоваться как маркер для выявления инициирования гиперкоагуляции. Отсутствие видовой специфичности маркера позволяет применять данный метод исследования и в экспериментах на животных. Результаты проведенного исследования могут быть использованы патофизиологами и гемостазиологами в научной, практической и учебной работе.
Внедрение результатов исследования в практику. Теоретические положения, разработанные в диссертационном исследовании, внедрены в научно-педагогическую деятельность кафедр патологической физиологии и биохимии Казанского государственного медицинского университета Росздрава при изучении механизмов тромбообразования и свертывания крови. Вновь использованные лабораторные методы внедрены в лаборатории иммунологии Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ МЗ РТ и клинико-диагностической лаборатории ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр » МЗ РТ, о чем свидетельствуют соответствующие акты внедрения.
7 Основные положения, выносимые на защиту:
-
Усиление микровезикуляции клеток сосудистого сектора является типовой реакцией на острый стрессор, развивающейся в течение 15 минут, при этом мобилизуется популяция микровезикул, содержащая в составе липидных плотов экто-5' нуклеотидазу и обогащенная прокоагулянтными фосфатидилсеринами. Пик микровезикуляции, совпадающий с максимальным ускорением свертывания крови, позволяет считать микровезикулы патогенетическим фактором гиперкоагуляции при остром стрессе.
-
Динамика интегральной микровезикуляции в крови отражает варианты клеточных реакций на стимул - при однократном стрессе реакция развивается за минуты, в соответствии с рефлекторным принципом нервной регуляции свертывания крови. Персистенция стрессора сопровождается продлением микровезикуляционной реакции в течение часов с распространением в кровоток частиц, обогащенных фосфатидилсеринами. В организме, претерпевшем прокоагулянтную перестройку, микровезикуляция в ответ на острую активацию гемостаза ограничена рамками локального адаптивного ответа.
-
Существенное усиление микровезикуляционной реакции под влиянием чрезвычайных по продолжительности и силе прокоагулянтных стрессоров, сопровождается развитием явной картины синдрома ДВС при эндотоксинемии и более интенсивной локальной микровезикуляцией с диссеминацией в системную циркуляцию микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов, кореллирующей с циркуляцией активированных тромбоцитов, при оперативном родоразрешении.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на V Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудистой стенки, «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения».- Москва.-2000; Региональной конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии».- Ижевск.- 2001; Первой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии».-Москва- 2003; Третьем Российском конгрессе по патофизиологии "Дизрегуляционная патология органов и систем" Москва, 2004; Второй Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии».- Москва.- 2005; Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения".- Ярославль-2005; Первом Всероссийском форуме «Инновационные технологии медицины XXI века».-Москва.- 2005; Всероссийской конференции с международным участием «Гемореология в макро- и микроциркуляции», Ярославль, 2005; Третьей Международной конференции
8 молодых врачей «3-rd Young Medics International Conference», Армения, Ереван, 2005; Беломорском симпозиуме "Актуальные вопросы гемостазиологии и трансфузиологии"-Архангельск.- 2005; VIII World Congress International society for adaptive medicine, Moscow, 2006; Всероссийская конференция с международным участием "Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия". - Санкт-Петербург, 2007. Личный вклад автора.
Определен алгоритм исследования, предполагающий интегральную оценку количества микровезикул и их прокоагулянтного фенотипа в динамике гемостатического ответа, инициированного тремя прокоагулянтными стрессорами - острой кровопотерей, эндотоксинемией, родоразрешением. Проведен анализ научной литературы, собрана и структурирована информация по проблеме исследования, определены методики, проведено разделение на логически завершенные этапы. Для изучения поставленной проблемы с моим участием проведены экспериментальные исследования микровезикуляционнои реакции при постгеморрагической и индуцированной эндотоксином гиперкоагулемии. Под моим руководством проведено исследование особенностей микровезикуляции при физиологическом и оперативном родоразрешении. Проведена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретированы полученные данные.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 36 работ, из них 9 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования Российской Федерации.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 224 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 33 рисунками. Библиография содержит 314 источников, в том числе 47 отечественных и 267 зарубежных авторов.
![Влияние фотомодифицированной крови на метаболические реакции и систему гемостаза при перитоните [Электронный ресурс]](/i/i/4237/211470.png "Влияние фотомодифицированной крови на метаболические реакции и систему гемостаза при перитоните [Электронный ресурс] Мишарин Игорь Валерьевич")