Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 .Активация процессов перекисного окисления липидов - общее звено патогенеза гипоксических повреждений 9
1.2. Биохимические механизмы метгемоглобинемии и гемической гипоксии 15
1.3.Коррекция гемической гипоксии фармакологическими средствами 26
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
Глава 3. Влияние метиленового синего, цистамина, мексидола и тонарола на процессы радикально-цепного окисления в модельных системах и длительность жизни мышей в условиях острой гемической гипоксии 47
3.1. Влияние препаратов и их комбинаций на продолжительность жизни мышей при ОГеГ 47
3.2. Система инициированного окисления этилбензола (константа К7) 49
3.3. Система генерирования супероксидного анион-радикала (О ) 50
3.4. Хемилюминесценция митохондрий печени крыс 52
3.5. Система окисления оксигемоглобина нитритом натрия. Накопление метгемоглобина ин виво 53
3.6. Заключение 56
Глава 4. Система перекисное окисление липидов/антиоксидантная защита эритрона, головного мозга, печени в условиях острой гипоксии, метгемоглобинемии и коррекции 57
4.1. Ориентировочные реакции 57
4.2. Содержание диеновых конъюгатов 57
4.3. Количество Шиффовых оснований 65
4.4. Активность каталазы, супероксиддисмутазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы 58
4.5. Активность сукцинатдегидрогеназы и моноаминоксидазы 74
4.6. Комбинированная фармакокоррекция 80
4.7. Заключение 83
Глава 5. Система перекисное окисление липидов/антиоксидантная защита эритрона, головного мозга, печени в условиях длительной нитритной интоксикации и коррекции 84
5.1. Ориентировочные реакции 84
5.2. Содержание метгемоглобина 86
5.3. Кислотная резистентность эритроцитов 86
5.4. Содержание диеновых конъюгатов в эритроцитах, головном мозге и печени крыс 95
5.5. Количество Шиффовых оснований в головном мозге и печени 99
5.6. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 102
5.7. Заключение 109
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 110
Выводы 121
Список литературы 123
- Биохимические механизмы метгемоглобинемии и гемической гипоксии
- Система окисления оксигемоглобина нитритом натрия. Накопление метгемоглобина ин виво
- Комбинированная фармакокоррекция
- Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Биохимические механизмы метгемоглобинемии и гемической гипоксии
Главными звеньями механизма снижения кислородной емкости крови является уменьшение содержания НЬ в единице объема крови (и, как правило, в организме в целом) и нарушение транспортных свойств НЬ. В целом гемичес-кий тип гипоксии характеризуется снижением способности НЬ эритроцитов связывать кислород (в капиллярах легких), транспортировать и отдавать определенное количество его в тканях. При этом реальная кислородная емкость крови может снижаться до 5-10% (объемных) [151].
Известно, что частой причиной кровяной (гемической) гипоксии является метгемоглобинемия, вызванная химическими веществами. Для анализа механизма образования метгемоглобина под воздействием химических веществ существенное значение имеет знание биологических процессов его образования и восстановления в организме интактных животных.
В физиологических условиях в организме человека и животных за счет постоянного эндогенного окисления гемоглобина содержится определенное количество метгемоглобина (от 1 до 5% всего красящего вещества крови). Некоторые продукты промежуточного обмена, фермент ксантиноксидаза вызывают в физиологических условиях окисление гемоглобина в метгемоглобин [3, 76, 140, 223, 265]. При ряде патологических состояний, даже не связанных с прямым действием окислителей, количество метгемоглобина может возрастать [124, 126, 223].
В связи с ролью эндогенных перекисных продуктов в процессах метгемо-глобинообразования метгемоглобинемия может сопровождать интоксикации различными соединениями, которые активируют ПОЛ, увеличивают образование перекисей жирных кислот, блокируют сульфгидрильные группы, угнетают глюкозомонофосфатный шунт, тормозят образование НАДН и НАДФН, необходимых для функционирования метгемоглобинредуктазы, повреждают систему глутатиона, разрушают антирадикальные механизмы [124, 247, 249, 250]. Отмечена повышенная чувствительность облученных животных к действию метгемоглобинообразователей, являющаяся следствием комплексногорадиаци-онно-токсического действия в виде нарушения внутренней структуры гемоглобина и его устойчивости к окислительно-восстановительным факторам и дополнительного образования эндогенных метгемоглобинообразователей [162]. Показано, что этанол, введенный до или одновременно с нитритом натрия, также усиливает образование метгемоглобина [175].
Параллельно с процессами образования метгемоглобина идет и его восстановление. В организме существуют ферментативные и неферментативные пути восстановления метгемоглобина в гемоглобин. Ферментативная система -это редуктаза метгемоглобина, зависимая от НАДН, и редуктаза метгемоглобина, зависимая от НАДФН. Первый из этих кофакторов генерируется в процессе реакции гликолиза, при окислении 3-фосфо-глицеринового альдегида до 1,3-дифосфо-глицериновой кислоты под действием дегидрогеназы фосфоглицери-нового альдегида и лактатдегидрогеназы. НАДФН образуется в реакции глюко-зо-монофосфатного шунта при окислении глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглю-коновой кислоты под действием фермента- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и при окислении 6-фосфоглюконата, катализируемого фосфоглюконат дегидро-геназой [141, 271].
Наряду с ферментативными существует и неферментативный путь восстановления метгемоглобина биоантиоксидантами - аскорбиновой кислотой и восстановленным глутатионом, которые представляют как бы вторую линию защиты против метгемоглобина. Глутатион -трипептид, присутствующий во всех клетках млекопитающих, выполняет в организме разнообразные функции, обеспечивая нормальное течение целого ряда физиологических и биохимических процессов, наиболее существенной из которых является участие в процессах детоксикации ксенобиотиков [249, 257]. Глутатион связывает все звенья биохимических механизмов детоксикации ксенобиотиков, обеспечивая их единое функционирование и является одним из элементов общих механизмов, оп ределяющих устойчивость организма к повреждающему действиюксенобиоти-ков [72, 248; 257, 360; 361]іВосстановленный глутатион играет большую роль в поддержании эритроцитов!в; деятельном; состоянии, сохранении их структуры; Мишенями его действия являются: а) гемоглобин?- защита судьфгидрильных групп,. система, глутатионпероксидаза, восстановление: дегидроаскорбиновой кислоты;, б) тиоловые ферменты - поддержание их высокой активности; в) защита мембраны; эритроцитов. Рлутатиошвосстанавливает дисульфидные. связи; образующиеся;выбелках внешней;мембраны при "окислительных стрессах регулирует уровень эндогенной перекиси: водорода; активируя, метгемоглобинре-дуктазу [124, 197, 249, 250;.361, 370].Восстановлениеглутатионавэритроцитах человека и сохранениев них стабильношконцентрациигІЗНІосуществляется через: пентозофосфатныш шунт пршучастии; специализированного фермента глу-татионредуктазы:
Аскорбиновая- кислота восстанавливает метгемоглобин за счет; непосредственной окислительно-восстановительною реакции между ней ш метгемогло-бином: Она является донором» водорода дляе фермента- АК-пероксидазы, разру-шающеш перекиси- [59]! Реакция протекает сравнительно1 медленно; Обитую схему можно выразить следующим образом:
АК + 2МеНЬ (Ре+++0Н): ДАК + 2Hb (Fe++) + 2Н20::
В физиологических условиях роль аскорбиновой? кислоты; в процессах восстановления! метгемоглобина незначительна;, возрастая при; врожденных метгемоглобинемиях, когда энзиматическиш дефект лишает возможности эрит-роцитышормально:восстанавливать метгемоглобин [59]: Аскорбиновая кислота и глутатион-являются важными компонентамибиологической антиоксидантнош системы, тесно взаимосвязаны; и обеспечивают поток атомов; водорода от восстановленных пиридиннуклеотидов через токоферол на гашение свободных радикалов липидов:
Следовательно, в эритроцитах постоянно функционирует антиокислительная/ система, которая непосредственно участвует в восстановлении метге моглобина и защищает от окисления нормальный гемоглобин. При этом, как свидетельствуют расчеты, ферменты восстанавливают 75-76%, аскорбиновая кислота 12-16%, восстановленный глутатион 9-12% метгемоглобина [108, 141].
Химические вещества могут образовывать метгемоглобин за счет непосредственного действия на гемоглобин, а также путем повреждения биологических систем, ответственных за восстановление метгемоглобина, либо двумя путями оновременно.
Механизм метгемоглобинизирующего действия нитритов in vitro подробно изучен. Процесс окисления оксигемоглобина нитрит-ионом является ион-радикальным [273, 274, 275, 276, 277, 278, 340]. Перенос электрона от донора (нитрит-иона) на молекулу оксигемоглобина приводит к образованию активного интермедиата-супероксидного анион-радикала:
НЬ(02)4+ N07 — [НЬ(02)4Г +NO 2
[НЬ(02)4Г - О" + Hb(02)3 -» и т.д.
Свободный радикал 0 2 способен инициировать свободнорадикальное окисление. В то же время, по мнению некоторых авторов [161, 172], его реактивность в водной фазе сравнительно невелика. В органической гидрофобной среде агрессивность 0 2 значительно выше, чем в водной. Учитывая, что 0 2 образуется в мембраносвязанных ферментных системах, есть основание полагать, что в гидрофобном слое мембран он может активно индуцировать пере-кисное окисление липидов [46].
Ингибирующий эффект 4-гидроокси-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-ок-сила, способного рекомбинировать с активными свободными радикалами, подтверждает цепной механизм окисления нитритом и говорит об участии в данном процессе в реакции продолжения цепи радикалов типа N02 и N0 .
Система окисления оксигемоглобина нитритом натрия. Накопление метгемоглобина ин виво
Процесс окисления гемоглобина в метгемоглобин является свободнора-дикальным с вырожденным разветвлением цепей. Учитывая антирадикальную активность тонарола, мексидола и цистамина, показанную выше, оценивалось деметгемоглобинизирующее действие препаратов в модельной системе окисления оксигемоглобина нитритом натрия [275; 276]. Об активности препаратов судили по изменению кинетики накопления метгемоглобина. Данный процесс имеет характерную S-образную форму, с некоторым периодом индукции и затем с быстрым изменением оптической плотности с постепенным выходом на плато.
Исследуемые препараты вводились в инкубационную смесь в конечной концентрации 10" - 10 моль.
Результаты представлены в таблице 6 в относительных единицах. Из исследуемых соединений высокой активностью в данной модельной системе обладает только цистамин. Цистамин оказывает эффект только в достаточно большой концентрации. Мексидол и тонарол, несмотря на высокую константу К7, практически неактивны.
В основном окисление оксигемоглобина нитритом натрия осуществляется через взаимодействие радикала NO с двухвалентным железом гема и регенерацией нитрит-иона [276]. Поэтому ингибирующий эффект цистамина на накопление метгемоглобина указывает на его антирадикальную активность в отношении радикала N0.
В опытах на мышах изучалось деметгемоглобинизирующее действие препаратов при острой гемической гипоксии. Цистамин, мексидол и тонарол вводились животным профилактически за 1 час до введения нитрита натрия. Результаты представлены на рисунке 2. Цистамин достоверно понижает уровень метгемоглобина по сравнению с контролем. Тонарол и мексидол практически не активны при тестировании через 1 час и 3 часа.
Таким образом, цистамин отчетливо ингибирует накопление метгемоглобина как в модельной системе, так и in vivo.
Мексидол потенцирует защитный эффект цистамина и метиленового синего при острой гемической гипоксии, что может быть использовано в дальнейших исследованиях при комбинированной лекарственной коррекции.
Мексидол в витральных системах проявляет умеренную антирадикаль-ную активность - К7 = (6,4±0,5)"10 моль/лх, уступая по активности тонаролу [К7=(2,3±0,6)-104 моль/л-с].
Выявлен определенный антагонизм мексидола по отношению к супероксидному анион-радикалу. Препарат тормозит восстановление нитротетразолия синего (НТС) в системе, содержащей НАДН и феназинметасульфат. В данной модельной системе мексидол более активен, чем цистамин, но менее, чем-тонарол. В суспензии митохондрий печени крыс мексидол более значительно по сравнению с тонаролом и цистамином, снижает светосумму свечения хеми-люминесценции, что свидетельствует об антиоксидантных свойствах препарата. Мексидол и тонарол практически не влияют на накопление метгемоглобина in vitro и in vivo.
В механизме действия цистамина лидирующее значение имеет его демет-гемоглобинизирующий эффект и антирадикальная активность.
Комбинированная фармакокоррекция
Известно, что в механизме гипоксического усиления процесса ПОЛ важную роль играет нарушение функционирования сукцинат - зависимого транспорта электронов в результате возрастания генерации активных форм кислорода. С учетом данных представлений можно предположить, что перспективным подходом к коррекции ПОЛ при гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия, может быть использование комбинаций лекарственных средств, обладающих деметгемоглобинизирующей, антиоксидантной и противогипоксиче-ской активностью. Нами было установлено (см. главу 3), что цистамин потенцирует защитный эффект мексидола при острой гемической гипоксии, вызванной однократным введением токсической дозы нитрита натрия. Поэтому представлялось целесообразным исследование эффективности комбинации двух препаратов цистамина и мексидола, имеющих различный механизм противоги-поксического действия, в качестве метода коррекции ПОЛ в эритроцитах и полушариях головного мозга в ближайшие часы после введения нитрита натрия.
Опыты проведены на белых крысах - самцах, массой 180 - 230 г. Гемиче-скую гипоксию создавали однократным введением под кожу спины 4% водного раствора нитрита натрия в дозе 120 мг/кг. Опытным группам крыс (п = 10) внутрибрюшинно вводили комбинацию двух препаратов цистамина (50 мг/кг) и мексидола (50 мг/кг) за 1 час до введения нитрита натрия и через 15-20 минут после токсиканта. Двум другим группам крыс вводили мексидол и цистамин по аналогичной схеме. Контрольным крысам (п = 10) вводили растворитель в адекватном объеме. Полученные данные сравнивали с аналогичными показателями интактных крыс (п = 11). В эритроцитах определяли диеновые конъюгаты, активность супероксиддисмутазы, каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
В полушариях головного мозга исследовали количество диеновых конъю-гатов и активность компонентов антиоксидантной защиты - каталазы и глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы. Тестирование осуществляли через 6 часов после введения нитрита натрия. Результаты представлены в таблице 8. Они свидетельствуют о том, что наиболее эффективным методом коррекции ТІОЛ является комбинация цистамина и мексидола. В эритроцитах крыс, получавших данную комбинацию препаратов, количество диеновых конъюгатов, а также активность супероксиддисмутазы; каталазы и. глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы практически не отличаются от аналогичных показателей у интактных животных, что свидетельствует о нормализующем действии препаратов. Причем по двум исследованным показателям: количеству диеновых конъюгатов и активности каталазы комбинация имеет преимущества перед индивидуальными препаратами.
В полушариях головного мозга лечебно-профилактический эффект комбинации цистамина и мексидола проявляется в нормализации содержания диеновых конъюгатов и активности каталазы.
Применение по аналогичной схеме индивидуальных препаратов - цистамина и мексидола не оказывает благоприятного эффекта на указанные показатели.
Таким образом метаболический эффект комбинации цистамин + мексидол в данных условиях эксперимента выше, чем у индивидуальных препаратов.
Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Определяли активность каталазы и супероксиддисмутазы в эритроцитах в динамике при длительной нитритной интоксикации, а также активность каталазы в печени и мозге на 30 сутки отравления. Исследованные препараты вводились в режиме сопроводительной коррекции. Результаты регистрировали через 2 часа после затравки.
На рисунках 28(A) и 28(Б) представлены данные изменения активности каталазы и супероксиддисмутазы в эритроцитах. Как видно из рисунка 28(A) уровень каталазы в эритроцитах достоверно ниже исходного контроля в течение всего срока эксперимента. Максимальное падение активности фермента на 31,5% и 36,2% отмечается соответственно к 3 и 30 суткам. На 7 и 10 сутки активность фермента несколько повышается, оставаясь тем не менее ниже контрольных показателей, что может свидетельствовать о развитии адаптационных процессов.
Мексидол в дозах 50 и 100 мг/кг практически нормализуют ферментативную активность, которая, однако, не достигает исходного уровня. Корригирующий эффект цистамина и тонарола менее выражен. Хотя активность фермента и повышается по сравнению с незащищенными животными, показатели остаются статистически ниже контрольных.
Динамика активности супероксиддисмутазы эритроцитов аналогична ката-лазе. Наибольшее падение активности фермента наблюдается в I и 30 сутки эксперимента, достигая 17,8% и 12,2% соответственно. В остальные сроки показатели лишь несколько ниже контроля. Мексидол в дозах 50 и 100 мг/кг, цис-тамин, тонарол нормализуют ферментативную активность, причем в наибольшей степени это выражено у мексидола.
При применении мексидола (50 мг/кг) показатели в первые 7 суток даже несколько выше контроля. Эффективность цистамина явно ниже на I, 21 и 30 сутки эксперимента. Синхронность изменений активности каталазы и СОД объяснима, если учесть, что перекись водорода, образующаяся при дисмутации супероксидного радикала, ингибирует фермент.
Из данных, представленных на рисунке 29-следует, что уровень глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах при длительной-интоксикации нитритом натрия, видно, что активность фермента статистически ниже контроля во все сроки исследования, падая в I сутки на 32%, в 14 сутки на 23% и в 30 сутки на 13%. Мексидол в дозах 50 и 100 мг/кг наиболее полно восстанавливают ферментативную активность, не достигающую, однако, показателей интактных животных. Цистамин и тонарол в сравнении с мексидолом в I и 14 сутки менее эффективны, а к 30 суткам их показатели практически выравниваются.
Таким образом, при длительной интоксикации нитритом натрия в эритроцитах отмечается падение активности супероксиддисмутазы, каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, наиболее выраженное в первые сутки. На рисунках 30 и 31 представлены данные активности каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в полушариях головного мозга и печени крыс на 30 сутки интоксикации. Как видно, уровень каталазы у незащищенных животных ниже контроля на 34,8% в полушариях головного мозга и на 33,4% в печени. Мексидол (50мг/кг и 100 мг/кг) и.тонарол нормализуют эти показатели, при этом эффективность мексидола несколько выше. Цистамин в данных условиях оказался менее активным.
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у нелеченных животных в полушариях головного мозга практически не меняется, а в печени отмечается падение на 49,5%. Исследуемые препараты повышают активность фермента в печеночной ткани, однако при применении мексидола и тонарола она остается статистически ниже контроля, в отличие от цистамина.
Проведенные исследования показали, что, в условиях метгемоглобинемии вызванной длительной нитритной интоксикацией наблюдается накопление диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в полушариях головного мозга, печени и эритроцитах крыс, а также снижение активности ферментов антиокси-дантной защиты говорят о сдвигах в системе регуляции свободнорадикального окисления липидов. Изменения кислотной резистентности эритроцитов, глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы могут указывать, в том числе и на повреждение эритроцитарных мембран.
Лечение крыс мексидолом в дозах 50 и 100 мг/кг, цистамином (50 мг/кг), то-наролом (50 мг/кг) в определенной мере нормализует ферментативную активность, свободнорадикальное окисление липидов, восстанавливает рефлекторную активность, причем эффективность мексидола в обоих исследованных дозах значительно выше. Мексидол обладает отчетливым мембраностабилизи-рующим эффектом.
