Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы , 17
1.1. Роль системы иммунитета в патогенезе длительной персистенции вирусов 17
1.1.1. Особенности реагирования иммунной системы в условиях персистенции вирусов 19
1.1.2. Механизмы «ускользания» вирусов от иммунного надзора 26
1.2. Иммунорегуляторные медиаторы и длительная персистенция вирусов 35
1.2.1. Основные закономерности функционирования цитокиновой сети 35
1.2.2. Иммунорегуляторные цитокины и вирусоносительство 43
1.2.3. Структурные основы аллельного полиморфизма генов цитокинов 50
1.2.4. Ассоциации аллельных вариантов генов цитокинов с заболеваниями человека 55
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 67
2.1 Общая характеристика клинического материала 67
2.1.1. Клиническая характеристика пациентов с вирусными гепатитами 68
2.1.2. Клиническая характеристика пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита 70
2.1.3. Клиническая характеристика пациентов с хронической герпетической инфекцией 71
2.2. Методы исследования 72
2.2.1. Определение общего количества лейкоцитов периферической крови и подсчет их отдельных морфологических форм 72
2.2.2. Выделение мононуклеаров из периферической крови
2.2.3. Исследование экспрессии CD-антигенов лимфоцитами 74
2.2.4. Исследование пролиферативной активности лимфоцитов 75
2.2.5. Исследование поверхностной архитектоники лимфоцитов 76
2.2.6. Исследование ультраструктуры лимфоцитов 77
2.2.7. Исследование структурных особенностей плазматической мембраны лимфоцитов 78
2.2.8. Исследование метаболического статуса лимфоцитов 2.2.8.1. Определение содержания гликогена в лимфоцитах 79
2.2.8.2. Определение содержания липидов в лимфоцитах 80
2.2.8.3. Определение активности кислой фосфатазы в лимфоцитах 81
2.2.8.4. Определение активности неспецифической эстеразы в лимфоцитах 82
2.2.9. Культивирование мононуклеаров периферической крови 82
2.2.10. Исследование цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров 83
2.2.11. Выделение ДНК 85
2.2.12. Исследование полиморфизма генов цитокинов 86
2.2.13. Статистическая обработка результатов 88
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 91
3.1. Структурные, метаболические, функциональные свойства лимфоцитов периферической крови и полиморфизм генов цитокинов у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 91
3.1.1. Иммунофенотипические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 91
3.1.2. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 109
3.1.3. Морфологические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 115
3.1.4. Структурное состояние плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом... 130
3.1.5. Метаболический статус лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 136
3.1.6. Цитокинпродуцирующая способность мононуклеаров периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 142
3.1.7. Анализ распределения аллельных вариантов и генотипов генов цитокинов у пациентов с хроническим вирусным гепатитом 157
3.2. Структурные, метаболические и функциональные свойства лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита 177
3.2.1. Иммунофенотипические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита 177
3.2.2. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита... 182
3.2.3. Морфологические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита... 184
3.2.4. Структурное состояние плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита 189
3.2.5. Метаболический статус лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита... 191
3.2.6. Цитоішнпродуцирующая способность мононуклеаров периферической крови у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита 193
3.3. Структурные, метаболические и функциональные свойства лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической герпетической инфекцией 198
3.3.1. Иммунофенотипические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической герпетической инфекцией 198
3.3.2. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической герпетической инфекцией 203
3.3.3. Морфологические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической герпетической инфекцией 204
3.3.4. Метаболический статус лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической герпетической инфекцией 208
3.3.6. Цитокинпродуцирующая способность мононуклеаров периферической крови у пациентов с хронической герпетической инфекцией 210
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 214
Заключение 274
Выводы 278
Список литературы 2
- Механизмы «ускользания» вирусов от иммунного надзора
- Ассоциации аллельных вариантов генов цитокинов с заболеваниями человека
- Клиническая характеристика пациентов с хронической герпетической инфекцией
- Иммунофенотипические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом
Введение к работе
~ ZJ O'i О
Актуальность проблемы. Клинический облик многих вирусных инфекций связан с длительным присутствием возбудителя в организме. Феномен вирусной персистенции является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [Dillon А.Р., Dusheiko G.M., 1995; Ahmed R. et. Al, 1996; Porh A., 1997; Маянский A.H., 1999; Cerny A., Chisari F., 1999; Антонов П.В., Цинзер-линг B.A., 2001; Апросина З.Г., Серов В.В., 2001; Жукова О.Б. и соавт., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003]. В ее основе лежит способность вирусов закрепляться в клеточных популяциях, используя для этого разнообразные приемы - от «замораживания» собственных генов в хромосомах клетки-хозяина до агрессивного вмешательства в систему индукторов и эффекторов иммунитета [Маянский А.Н. и соавт., 1998; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001; Непомнящих Г.И. и соавт., 2001; Львов Д.К., 2004].
Понятие «персистенция» включает различные формы длительного взаимодействия вируса с клеткой или организмом. В настоящее время принято различать: латентное персистирование - длительное бессимптомное пребывание возбудителя в организме или в клеточной системе с затрудненным выделением вируса; хроническое персистирование возбудителя, сопровождающееся периодической манифестацией процесса; и собственно персистенцию - длительное пребывание возбудителя в организме или клеточной системе с регулярным выделением вируса [Ахмадулина Н. Б., 1990; Алгол В.И., 1997; Борисов Л.Б., 2001; Покровский В.И. и соавт., 2003]. Сегодня посредством молекулярно-генетических методов исследования вполне убедительно доказана способность большинства вирусов к длительной, нередко пожизненной персистенции в инфицированном организме [Маянский А.Н., 1999; Короток A.M., Сбойчаков В.Б., 2002; Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., 2002].
Многие вирусы, в частности вирусы гепатита В и С, иммунодефицита человека, простого герпеса, Эпштейна-Барр, клещевого энцефалита, цитомегалии, гриппа, полиомиелита, ретровирусы, аденовирусы и др., обладающие способностью длительно сохраняться в макроорганизме, могут поражать многие органы и системы, вызывая хроническую форму инфекции [Алгол В.И., 1997; Амосов А.Д., 2002; Непомнящих Г.И. и соавт., 2003; Серов В.В. и соавт., 2003; Львов Д.К., 2004]. Исследования последних лет показали, что, несмотря на достигнутые успехи в изучении молекулярно-биологических основ длительной вирусной персистенции, на сегодня не существует единой концепции патогенеза данной инфекционной патологии [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000, 2001; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Arbutnot P., Kew М., 2001].
Следует отметить, что факторы, позволяющие вирусам сохраняться в организме человека, и условия, способствующий ішишши фонических форм бо-
С Петербург; 8 ІМгТм
лезней, также остаются недостаточно изученными [Ploegh H.L., 1998; Ивашкин В.Т. и соавт., 2000, 2001; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Новицкий В.В., Ура-зова О.И., 2004]. Несмотря на индукцию вирусспецифического иммунного ответа, у большинства инфицированных лиц это не приводит к элиминации возбудителя инфекции [Маянский А.Н., 1999; Долгих В.Т., 2000; Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Хаитов P.M., 2001; Arbutnot P., Kew M., 2001; Mazzaro С. et al., 2001; Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., 2002].
В середине прошлого столетия была сформулирована концепция, согласно которой подверженность той или иной болезни обусловлена сочетанием в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся при взаимодействии с факторами среды патологического фенотипа [Falconer D. S., 1965]. В соответствии с этим одни индивиды обладают относительной резистентностью к инфицированию вирусами, тогда как другие — подвержены развитию болезни при контакте с ее возбудителем.
Переход вирусного инфекционного заболевания в хроническую форму может быть вызван нарушением генетического контроля за иммунным ответом. На сегодняшний день картирован ряд генов, непосредственно определяющих высокую или низкую чувствительность организма к инфекционным агентам [Samuel С.Е., 1991, 2001; Stark G.R. et al., 1998; Lio D. et al., 2003; Mueller T. et al., 2004; Oilier W.E., 2004].
По современным представлениям, генетическая детерминированность иммунного ответа макроорганизма предопределяет жизненный цикл инфекционного агента. Однако при этом нельзя не учитывать свойства вируса, действие которого направлено на модулирование защитных сил организма и «ускользание» от иммунного надзора [Петров Р.В. и соавт., 1981; Хаитов P.M., Алексеев Л.П., 1998; Ploegh H.L., 1998; Mondelli M.U., Silini Е., 1999; Петров Р.В., Хаитов P.M., 2000; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001].
Несмотря на получение новых данных фундаментального характера о механизмах персистеннии вирусов, неразрешенным остаётся вопрос: вирусоноси-тельство - вариант «мирного сосуществования» возбудителя инфекции и макроорганизма либо скрытый патологический процесс? Следует признать, что единого мнения на этот счет нет. В любом случае внедрение вируса в клетку макроорганизма - прежде всего «сигнал опасности», активизирующий врожденные и адаптивные механизмы системы иммунитета, направленные на элиминацию ин-фектогена. При этом основной детерминантой патогенеза хронических перси-стентных вирусных инфекций, на наш взгляд, следует считать клеточно-опосредованный иммунитет.
Цель исследования: установить общие закономерности и особенности иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций разного генеза.
Задачи исследования:
-
Определить направленность клеточной дифференцировки и пролифератив-ный потенциал лимфоцитов периферической крови у пациентов с перси-стентными вирусными инфекциями, вызванными вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса.
-
Оценить роль дисбаланса иммунорегуляторных цитокинов в механизмах нарушения межклеточной кооперации иммуноцитов при персистентных вирусных инфекциях.
-
Дать комплексную оценку структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.
-
Выявить иммуногенетические критерии предрасположенности к хрониза-ции вирусных гепатитов и резистентности к прогрессированию заболевания. Путем определения характера распределения аллельных вариантов промо-торных регионов генов цитокинов ГЬ2, BL4, IL10 среди лиц европеоидной популяции, а также степень их ассоциированности с уровнем продукции соответствующих цитокинов.
-
Определить клинико-иммунологические параллели при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.
Научная новизна. Впервые с привлечением комплекса современных гематологических, иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования освещены пути реализации иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций. Установлено, что изменения реагирования системы иммунитета при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса являются однонаправленными.
Показано, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией развивается дизрегуляция антигенспецифи-ческого звена системы иммунитета, проявляющаяся нарушением процессов дифференцировки лимфоцитов (уменьшение количества CD3+-, СБ4+-клеток и снижение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+)), изменение пролифера-тивной активности и апоптотического потенциала лимфоцитарных клеток периферической крови.
Установлено, что персистентные вирусные инфекции сопровождает выраженный дисбаланс продукции иммунорегуляторных цитокинов. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С, В+С, хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией отмечается значительное повышение продукции IFN-y мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. При персистентных вирусных инфекциях увеличивается секреция EL-4, DL-6 и снижается продукция TNF-a, IL-2, IL-12 моно-
нуклеарами крови. У больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С продукция IL-10 мононуклеарными лейкоцитами увеличена.
Получены новые данные, указывающие на факт дезорганизация поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови. Длительная перси-стенция вирусов гепатита В и С, а также антигенемия вируса клещевого энцефалита сопровождается структурной модификацией липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов. Изменение метаболического статуса лимфоцитов периферической крови у пациентов с пер-систентными вирусными инфекциями характеризуется увеличением содержания внутриклеточных липидов и активностью неспецифической эстеразы.
Установлено, что степень риска прогрессирования и хронизации вирусных гепатитов среди лиц европеоидной популяции ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена IL10, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена IL4. Фактором резистентности к длительной персистенции вирусов гепатита В и С является генотип С/С промоторного региона С-592А гена IL10.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые патофизиологические, иммунологические и иммуногенетические аспекты развития персистентньгх вирусных инфекций. Показана значимая роль нарушений структурно-метаболического и функционального состояния лимфоцитарных клеток, цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров периферической крови в механизмах формирования персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса. Выявлены иммуногенетические факторы риска прогрессирования и резистентности к хронизации вирусных гепатитов В, С и В+С, ассоциированные с аллелями промоторных регионов генов IL2, IL4 и ПЛО. Положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения патогенетических механизмов персистентньгх вирусных инфекций, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения инфекционного процесса при гепатитах В, С, В+С, клещевом энцефалите, герпетической инфекции.
Положения, выносимые на защиту:
-
Персистентные вирусные инфекции (хронический вирусный гепатит В, С, В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) сопровождаются угнетением Т-клеточного звена иммунитета, выраженным изменением процессов пролиферации и дифферен-цировки лимфоцитарных клеток, а также нарушением межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток.
-
Механизмы дисбаланса кооперативного взаимодействия иммуноцитов при персистентньгх вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и
В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) сопряжены с поляризацией иммунного ответа в направлении Th2.
-
Персистентные вирусные инфекции сопровождаются выраженными изменениями структурно-метаболических свойств лимфоцитов периферической крови, к числу которых относятся дезорганизация поверхностной архитектоники, структурная модификация липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов, увеличение содержания липидов и активности неспецифической эстеразы в лимфоцитарных клетках.
-
Иммуногенетическим фактором предрасположенности к длительной перси-стенции вирусов гепатита В и С среди лиц европеоидной популяции является генотип С/С промоторного региона С-592А гена ПЛО. Степень риска про-грессирования и хронизации вирусного гепатита В и С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена НЛО, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена BL4.
-
Общая направленность иммунопатологических расстройств (угнетение ан-тигенспецифического звена иммунного ответа, дисбаланс кооперативного взаимодействия иммуноцитов, дизрегуляция процессов пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, нарушение структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови) при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция), проявляющихся стертым клиническим течением, не определяется таксономической принадлежностью возбудителя инфекции.
Апробация и реализация работы. Результаты исследования обсуждались на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003), Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), Выездном пленуме правления Научного общества гастроэнтерологов «Новые горизонты гастроэнтерологии» (Новосибирск, 2004), Четвертом съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизре-гуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004), Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005).
Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (раздел «Патофизиология системы иммунитета», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология клетки») на лечебном, педиатрическом и фармацевтическом факультетах ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава».
Исследование выполнено в рамках Федеральной научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006 годов» по мероприятию «Развитие системы ведущих научных школ как среды генерации знаний и подготовки научно-педагогических кадров высшей квалификации. Проведение научно-исследовательских работ по приоритетным направлениям Программы» (№ РИ 112/001/158), а также при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (№ НШ-1051.2003.4) «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток при патологии» и Администрации Томской области (договор №136 от 23.09.2004) «Создание и внедрение панели молекулярно-генетических маркеров для прогнозирования течения и исхода вирусных гепатитов».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 работ, из них 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ, одна монография в соавторстве и 27 статей и тезисов в сборниках научных трудов и материалов съездов, конгрессов и конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 346 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 83 таблицами и 18 рисунками. Библиографический указатель включает 680 источников (393 - отечественных и 287 - иностранных).
Механизмы «ускользания» вирусов от иммунного надзора
Факт формирования расстройств иммунного реагирования при развитии различных заболеваний установлен давно. Известно, что возбудители инфекционных заболеваний обладают иммуномодулирующей активностью, вызывая иммунодефицитные состояния, степень выраженности которых непосредственно связана с характером и тяжестью инфекционного процесса, а также зависит от преморбидного фона пациента [Абелев Г.И., 1998; Антонова Т.В. и соавт., 1999; Карпова М.Р. и соавт., 1999; Долгих В.Т., 2000; Павлович С.А., 2001; Субботин А.В. и соавт., 2002; Чуйкова К.И., 2002; Ивашкин В.Т. и соавт., 2004; Серов В.В. и соавт., 2004]. Однако не решен вопрос о том, являются ли и насколько эти изменения специфическими, характерными для данной патологии или их характер случаен и зависит от множества разных причин [Lok A.S.F., 2000; Земсков A.M. и соавт., 2001; Крыжановский Г.Н., 2001,2002].
В науке традиционно прослеживается желание исследователей выявить типовые изменения клеточных структур при той или иной патологии, получить данные, свидетельствующие в пользу включения специфических механизмов возникновения и развития заболеваний. При этом известные типовые патологические процессы, не имеющие специфической нозологической и этиологической характеристики, сводятся лишь к общеизвестным из них (гипоксия, воспаление, стресс, нарушение микроциркуляции, иммунодефицитные состояния и др.) [Сторожаков Г.И., Никитин И.Г., 1998; Гавришева Н.А., Антонова Т.В., 1999; Серов В.В., 2001; Папонов В.Д. и соавт., 2002; Пименов Е.В. и соавт., 2003]. Нарушение функций одних клеток может быть первопричиной развития болезни, тогда как состояние других клеток становится нарушенным вследствие развития основного патологического процесса [Шахламов В.А., 1998; Карпова М.Р., 1999; Крыжановский Г.Н., 2001; Терехова Н.А. , Караваев В.Г., 2003]. С одной стороны, репликация вирусов в иммунонеприкосновенных местах, каковыми являются клетки иммунной системы, позволяет вирусам «избегать» иммунного надзора [Серов В.В., Мухин Ы.А., 2000; Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; Пименов Е.В. и соавт., 2003]. С другой стороны, инфицирование вирусами лимфоцитов и моноцитов нарушает их иммунную функцию, что, в свою очередь, играет важную роль в патогенезе поражений печени и других органов, обусловленных этими вирусами [Серов В.В., Мухин Н.А., 2000].
В ответ на попадание вируса в макроорганизм срабатывают врожденные и адаптивные механизмы иммунного ответа, направленные на ограничение и элиминацию инфекции. В связи с этим вирусы для обеспечения собственного выживания используют пути, позволяющие им избежать действия защитных реакций организма [Кирдей Е.Г., 2000; Львов Д.К., 2000, 2004; Blackwell J.M., 2001; Фридлянд И.Ф. и соавт., 2002; Жукова О.Б. и соавт., 2003]. Так, вирусы способны подавлять индукцию иммунного ответа путем блокирования процессинга и презентации антигенов, «мимикрии» собственных антигенных детерминант, а также накоплением мутаций «иммунного ускользания». Кроме этого, вирусы могут угнетать реализацию иммунного ответа за счет высокой вирусной нагрузки, в результате чего развивается истощение и нарушение функции Т-клеточного звена, играющего ключевую роль в формировании противовирусного иммунитета [Букринская А.Г., 1986; Бук-ринская А.Г., Жданов В.М., 1991; Ющук Н.Д. и соавт., 2000; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001].
Одним из свойств вирусов, выработавшихся в результате длительной эволюции, как раз и является их способность модулировать иммунный ответ, и склонять течение инфекции в сторону ее хронизации, чем, вероятно, и объясняется феномен длительной персистенции в макроорганизме [Погодина В.В и соавт., 1986; Arai К. et al., 1990; Ивашкин В.Т. и соавт., 2000, 2001, 2202, 2004].
Среди актуальных проблем современной медицинской науки все боль 19 шую значимость приобретают вопросы индивидуального прогноза возникновения заболевания на доклинической стадии, прогноза течения и возможного исхода болезней. Гены ЦИТОКРШОВ, обеспечивающие генетический контроль иммунного ответа, являются одной из полиморфных генетических систем в геноме человека. Генетическое разнообразие генов цитокинов лежит в основе предрасположенности и устойчивости организма к мультифакториальной патологии, в первую очередь к патогенетически связанной с дисфункцией иммунной системы [Turner Р., 1997; Авдошина В.В., Коненков В.И., 2004; Woolley N. et al.,2005].
Вопрос о том, имеется ли генетическая основа индивидуальных особенностей реагирования системы иммунитета в условиях длительной вирусной персистенции, изучен недостаточно. В то же время изучение этой проблемы весьма перспективно, поскольку может принести новые данные о генетических механизмах предрасположенности и патогенеза вирусных инфекций, открыть новые возможности для более точного индивидуального прогноза предрасположенности или донозологической диагностики, профилактики и терапевтического воздействия.
Персистенция вирусов затрагивает практически все факторы антивирусного иммунитета и сочетает в себе элементы пассивной и активной самозащиты [Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Хаитов P.M., 1999, 2001; Ярилин А.А., 1999, 2001]. Иммунные реакции макроорганизма в ответ на действие вирусов, с одной стороны, имеют в своей основе универсальные механизмы иммунного ответа на антигены любой природы, с другой стороны, характеризуются некоторыми особенностями, связанными с характером паразитиро-вания вирусов [Погодина В.В и соавт., 1986; Сухих Г.Т. и соавт., 1997; Маян-ский А.Н. и соавт., 1998; Кирдей Е.Г., 2000; Жукова О.Б. и соавт., 2003]. Неспецифический (врожденный) гуморальный ответ обусловлен нарастанием уровня интерферонов (IFN), обладающих противовирусной активностью, сывороточных иммуноглобулинов (Ig), активацией системы комплемента и натуральных киллеров (NK-клеток) [Pestka S. et al., 1987; Samuel C.E., 1988, 1991; 2001; Stark G.B. et al., 1998; Хаитов P.M., 2001; Симбирцев A.C., 1998, 2002, 2004]. В свою очередь, специфический иммунный ответ направлен на элиминацию циркулирующих и клеточных антигенов вируса, а также на защиту клеток от повторного реинфицирования [Титова Н.Г., 1996; Simpson K.J. et al., 1997; Кирдей Е.Г., 2000; Ивашкин ВТ. и соавт., 2000].
Известно, что пусковым моментом для включения специфического иммунного ответа является взаимодействие клеток - Т-хелпера (Th) с анти-генпредставляющей или дендритной клеткой, на поверхности которой присутствует антигенный пептид, комплексированныи с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса [Koziel M.J., 1997, 1999; Madden D.R., 1995; Nicholson L.B., Kichroo V.K., 1997; Хаитов P.M., 1999; 2001; Ивашкин B.T. и соавт., 2000; Хаитов P.M. и соавт., 2000; Ярилин А.А., 2001; Маммаев С.Н. и соавт., 2002].
Ассоциации аллельных вариантов генов цитокинов с заболеваниями человека
Для оценки уровней TNF-a, IL-2 и IL-4 микропипеткой добавляли по 100 мкл «0 дозы» и стандартов данных цитокинов с известными концентрациями в соответствующие ячейки предварительно промытого буфером микропланшета. В остальные лунки вносили супернатант в объеме 100 мкл и ин о кубировали в течение 1 ч при 37 С. После нескольких циклов промывки в каждую ячейку добавляли по 100 (для определения TNF-a и IL-4) и 200 (IL-2) мкл раствора вторых антител и проводили часовую инкубацию при 37 С. Промыв планшеты буфером и дистиллированной водой, в каждую лунку вносили по 100 (TNF-a и IL-4) и 200 (IL-2) мкл конъюгата стрептавидина с при 37 С (IL-2). По окончании инкубации, промыв микропланшеты, в каждую ячейку добавляли по 100 (TNF-a и IL-4) и 200 (IL-2) мкл раствора субстрата с красителем. Через 10-15 мин в лунки вносили по 50 мкл стоп-реагента.
Для определения уровня IL-6 в супернатантах в лунки предварительно промытого буфером микропланшета вносили по 100 мкл вторых антител. Затем в соответствующие ячейки помещали по 100 мкл «0 дозы» и стандартов IL-6 с известными концентрациями. В оставшиеся ячейки микропипеткой вводили по 100 мкл супернатанта и инкубировали 1 ч при 37 С. После трехкратного цикла промывки фосфатным буфером в лунки микропланшета добавляли по 200 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена и инку о
бировали 30 мин при 37 С. Трижды промыв планшет буфером, в каждую ячейку вносили по 200 мкл раствора субстрата с красителем и инкубировали в темном месте при комнатной температуре 10-15 мин. Чтобы остановить реакцию, в лунки добавляли по 50 мкл стоп-реагента. Для оценки продукции IL-10 и IL-12 мононуклеарами периферической крови автоматической микропипеткой в соответствующие ячейки микропланшета добавляли по 100 мкл «0 дозы» и стандартов IL-10 и IL-12 с известными концентрациями. В оставшиеся ячейки помещали 100 мкл супер-натанта и 25 мкл поликлональных антител и инкубировали планшет 3 ч при комнатной температуре. После двухкратного цикла промывки в каждую лунку добавляли по 50 мкл козлиной антикроличьей щелочной фосфатазы и инкубировали 45 мин. После очередного цикла промывки в ячейки микропланшета вводили по 200 мкл окрашивающего раствора и инкубировали 10 мин при комнатной температуре в темном месте. По окончании завершающей фазы инкубации в лунки вносили по 50 мкл стоп-раствора.
Учет результатов иммуноферментого анализа производили с помощью фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 (для IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4 и IL-6) и 490 нм (для IL-10 и IL-12). Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой.
Выделение ДНК проводили методом фенольной экстракции с помощью коммерческого набора «ВектоДНКэкстракция» («Вектор-Бест», Россия). Для этого по 150 мкл суспензии лимфоцитов (см. 2.2.2.) вносили в пробирки типа «Эппендорф», добавляли по 15 мкл раствора трис-ЭДТА, 15 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия, перемешивали. Затем вносили по 15 мкл раствора протеолитического фермента, перемешивали и инкубировали 1 ч при температуре 56 С. Добавляли по 0,2 мл фенола и энергично встряхивали в течение 30 сек. Для образования плотной интерфазы пробирки помещали в морозильную камеру холодильника на 30 мин. Для разделения фаз пробирки центрифугировали 5 мин при 14 тыс.об./мин. После центрифугирования в пробирках образовывались три фазы: нижняя - фенол, средняя - интерфаза, верхняя - водная фаза, содержащая ДНК. Верхнюю водную фазу переносили в другие пробирки, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформа, встряхивали в течение 30 сек, центрифугировали 5 мин при 14 тыс.об./мин. Затем верхнюю водную фазу переносили в другие пробирки, добавляли равный объем хлороформа, также встряхивали в течение 30 сек, центрифугировали 5 мин при 14 тыс.об./мин. Верхнюю водную фазу переносили в другие пробирки, добавляли по 2 мкл раствора ДНК-носителя, 1/10 часть по объему 1,5 М раствора ацетата натрия, 2,5 объема этилового спирта, перемешивали и помещали в морозильную камеру холодильника на 1 ч. ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 14 тыс.об./мин. Супернатант удаляли пипеткой, осадок подсушивали с поддувом при температуре 37-45С и растворяли в 50 мкл воды.
Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли спектрофото-метрическим методом, измеряя оптическую плотность при длинах волн 260 и 280 нм, причем 1 о.е. соответствовала 50 мкг ДНК. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20С. Непосредственно для работы использовали небольшие количества ДНК, хранившиеся при +4С.
Генотипирование аллельных вариантов осуществляли методом рест-рикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ) специфических участков генома. Амплификацию осуществляли в пробирках типа «Эп-пендорф» путем ПНР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 4) и учитывая применение нами амплификатора «Tercik МС2» («ДНК-технология», Россия). Было исследовано три полиморфных варианта трех цитокинов: T-330G IL2, С-590Т IL4, С-592А IL10. Все изученные мутации локализованы в промоторных участках соответствующих генов. Реакционная среда общим объемом 20 мкл состояла из буфера для проведения ПЦР («Сибэнзим», Россия), включающего в себя следующие реагенты: 60 мМ Трис-HCl (рН 8,5); 25 мМ КС1; 1,5 мМ MgCl2; 10 мМ 0,1% меркаптоэтанола; Triton Х-100; а также 30 пкмолей каждого олигонуклеоти-да; 125 мкМ каждого dNTP («Сибэнзим», Россия); 50-200 нг геномной ДНК и 1-2 ед. Taq полимеразы («Сибэнзим», Россия). Смесь помещали в пробирки типа «Эппендорф» и покрывали 30-50 мкл минерального масла («ICN», США) для предотвращения испарения.
Программа амплификации включала в себя предварительную денатурацию при 94С в течение 5 мин, с последующими 30-35 циклами отжига при специфической для каждой пары праймеров температуре (1 мин), элонгации цепи при 72С (1 мин) и денатурации при 94С (1 мин). Программу завершала финальная элонгация при 72С в течение 5 мин.
Клиническая характеристика пациентов с хронической герпетической инфекцией
Оценка цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров периферической крови с помощью иммуноферментного анализа показала, что у больных ХВГВ отмечалось статистически значимое увеличение спонтанной и стимулированной продукции IFN-y, IL-4, IL-6 и IL-10 по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров. В то же время базальная секреция IL-2 оказалась выше (66,25±6,91 пг/мл, р 0,05), а ФГА-индуцированная, напротив, ниже (144,76±15,86 пг/мл, р 0505), чем в контроле. Кроме того, было зарегистрировано достоверное снижение (относительно нормы) конституциональной и стимулированной продукции TNF-a (69,06± 10,40 пг/мл, p 0,05 и 138,43±20,47 пг/мл, p 0,01), а также ФГА-индуцированного синтеза IL-12 (229,71±17,43 пг/мл, р 0,01) (табл. 36).
Исследование возможностей мононуклеарных лейкоцитов секретиро-вать цитокины у больных ХВГВ позволило зарегистрировать ряд сходных изменений при разной степени активности хронического гепатита. Так, у страдающих ХВГВ как слабовыраженной, так и умеренной степеней активности повышение базальной и стимулированной продукции IL-4, IL-10, конституционального синтеза IFN-y, IL-6 сопровождалось достоверным снижением индуцибельного уровня TNF-a, а также IL-12. Активация секреции IL-4 регистрировалась у 70% больных ХВГВ слабовыраженной и у 80% - умеренной степени активности, в то время как повышение способности мононук-леаров продуцировать IL-10 было отмечено у 100% больных ХВГВ. Дефект мононуклеарных лейкоцитов выделять IL-12 обнаруживался также у 100% больных ХВГВ вне зависимости от степени активности патологического процесса. Кроме того, конституциональная продукция IL-6 была повышена у 80% больных ХВГВ слабовыраженной и у 70% пациентов с ХВГВ умеренной степени активности. В то же время лишь у 20% больных ХВГВ слабовыраженной степени активности содержание IFN-y в супернатантах регистрировалось на нормальном уровне. Однако, у больных ХВГВ слабовыраженной степени активности имела место более высокая ФГА-стимулированная способность мононуклеаров продуцировать IFN-y (474,50±51,55 пг/мл, р 0,01) и, напротив, сниженная базальная секреция TNF-a (48,90±6,66 пг/мл, р 0,01) по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров и у лиц, страдающих ХВГВ умеренной степени активности. Небезынтересно отметить, что при ХВГВ слабовыраженной степени активности у 100% больных было отмечено угнетение способности мононуклеаров секретировать TNF-a , тогда как у 70% больных регистрировался повышенный уровень продукции IFN-y (табл. 37).
Оценка цитокинового профиля мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro у больных ХВГС показала, что повышение конституциональной и индуцированной ФГА продукции IL-4, IL-I0, а также базального уровня IFN-y сопровождалось снижением секреции TNF-a (спонтанной и стимулированной), IL-2 (стимулированной), IL-12 (стимулированной) относительно контроля. Кроме того, у больных ХВГС базальный и ФГА-индуциро ванный уровень продукции TNF-a и IL-10 оказался достоверно ниже (р 0,05), а IL-6 - выше (р 0,05), чем у страдающих ХВГВ (табл. 36).
У больных ХВГС при разной степени активности инфекционного процесса отмечались однонаправленные изменения - на фоне статистически значимого повышения спонтанной способности мононуклеаров продуцировать IFN-y, IL-4, IL-6, базальной и стимулированной секреции IL-10 выявлялось угнетение синтеза TNF-a (как спонтанного, так и индуцированного) относительно контроля (табл. 38). Обращала на себя внимание выраженная активация спонтанной продукции IFN-y, IL-4 и IL-6 у 100% больных ХВГС умеренной степени активности. При ХВГС слабовыраженной степени активности лишь у 60% больных регистрировался повышенный уровень секреции IFN-y и IL-4, у 90% - IL-6. Весьма информативным представляется тот факт, что у всех больных ХВГС базальная и стимулированная концентрация в су-пернатантах IL-10 оказалась повышенной, а TNF-a - пониженной.
Продолжение таблицы Исследование резервных возможностей культивируемых мононуклеарных лейкоцитов синтезировать IL-12 у страдающих ХВГС слабовыраженной и умеренной степеней активности показало угнетение данной способности клеток (197,09±8,28 и 207,22±9,06 пг/мл, р 0,001 соответственно) относительно контроля. Дефект синтеза иммунорегуляторного IL-12 обнаруживался у больных ХВГС как слабовыраженной (у 60% больных продукция этого цитокина была снижена, у 40% - соответствовала норме), так и умеренной (у 50% больных цитокинпродуцирующая способность мононуклеаров периферической крови оказалась угнетена) степеней активности. При этом у лиц, страдающих ХВГС умеренной степени активности стимулированная способность мононуклеаров продуцировать IL-2 оказалась ниже (р 0.,01), а базальный уровень секреции IL-4 - выше (р 0,05), чем у больных ХВГС умеренной степени активности (табл. 38).
Иммунофенотипические особенности лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом
Однако транскрипции гена недостаточно для продукции цитокина, индукция которой нуждается в сигнале, полученном через CD28, стабилизирующим мРНК IL-2, что способствует увеличению синтеза иммунного медиатора в десятки раз. При связывании TCR и CD28 происходит кооперация сигналов посредством JNK, фосфорилирующая фактор c-jun, что является необходимым для образования АР-1. Сигнал от CD28 принимает участие в активации и другого фактора транскрипции NP-кВ. Установлено, что в регуляторном участке гена IL-2 локализован элемент, отвечающий на CD28-CD28RE/MFRS, с которым связывается NF-KB. Связывание CD28 ведет к активации факторов транскрипции в 3 раза, при этом продукция IL-2 активированными Т-лимфоцитами возрастает в 100 раз [Eckels D.D. et al., 1999.].
В исследованиях альтернативного сплайсинга мРНК IL-2 установлено, что в мононуклеарных клетках периферической крови, стимулированных моноклональными антителами к CD3, идентифицируются три формы мРНК данного цитокина: полноразмерная и изоформы IL-252 и IL-283 с делецией соответственно 2 и 3 экзонов. В отличие от рекомбинантного полноразмерного IL-2 рекомбинантные белки IL-252 и IL-253 не обладают костимулирующим эффектом на пролиферацию мононуклеарных клеток, активированных моноклональными антителами к CD3. Более того, при добавлении альтернативных форм совместно с полноразмерной они ингибировали способность последней стимулировать пролиферацию активированных мононуклеарных клеток [Сенников СВ. и соавт., 2004].
Следует отметить, что у пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В, С, клещевого энцефалита и простого герпеса, как показало наше исследование, ФГА-индуцированная продукция IL-2 была достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Вполне закономерно, что угнетение стимулированной продукции IL-2 у больных ХВГ умеренной степени активности носило более выраженный характер, нежели у пациентов с гепатитом слабовыраженной степени активности. При этом у лиц с хронической герпетической инфекцией в стадии ремиссии уровень стимулированной секреции данного цитокина оказался достоверно выше, чем у пациентов в стадии рецидива (табл. 36-38, 40, 70, 79).
Механизмы подавления индуцированного синтеза IL-2 при вирусных инфекциях остаются недостаточно изученными. По-видимому, имеет место не один, а несколько типов ингибирования [Сенников СВ. и соавт., 2003; Gomez I. et al., 2004]. Особенности действия, уровень продукции цитокина и его биологическая активность находятся под влиянием различных факторов: соотношения рецепторов - агонистов и антагонистов («ловушек»), связи с компонентами внеклеточного матрикса и белками плазмы, в частности с а2 -макроглобулином, способствующим инактивации циркулирующего цитокина, величины рН, антиоксидантного потенциала [Ивашкин В.Т. и соавт., 2003]. Имеются сведения, например, что белковые продукты HCV могут блокировать внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов IFN и снижать секрецию IL-2 и IFN-y активированными Т-лимфоцитами. Это также вызывает смещение баланса в пользу Th2, что является частью стратегии выживания вируса [Jia Н. et al., 2003; Kasprzak A. et al., 2004]. Снижение стимулированной ФГА продукции IL-2, одного из основных ростовых факторов для Т-клеток, вероятно, и способствовало истощению популяции Т-лимфоцитов.
Особая роль пролиферации в ходе специфического противовирусного иммунного ответа понятна: исходная численность любого клона слишком мала для эффективной элиминации антигена из организма [Петров Р.В. и соавт., 1981, 2000; Шиффман Ф.Дж., 2000; Хаитов P.M., 2001; Фаллер Д.М., Шилдс Д., 2003]. На сегодняшний день имеется мнение, что чувствительность лимфоцитов к вирусным агентам коррелирует с тем, в какой фазе митотического цикла они пребывают. Установлено, что до активации вирусным антигеном лимфоцитарные клетки находятся в Go-фазе клеточного цикла и в таком состоянии непермиссивны для большинства вирусов. Репликация инфекта возможна только в активированных, пролиферирующих клетках [Ляшенко В.А. и соавт., 1998; Мищенко В. А. и соавт., 1994; Земсков А.М и соавт., 2001]. Индуцированная вирусами пролиферация также содействует увеличению в организме числа клеточных элементов, способных реагировать с чужеродными агентами [Уразова О.И. и соавт., 2003].
Лимфоциты, активированные связыванием антигена, вступают в цикл клеточного деления. Они экспрессируют новые рецепторы, позволяющие им реагировать на секретируемые другими клетками цитокины, которые служат сигналами к пролиферации, дифференцировке в клетки памяти и плазматические клетки, способные вновь активироваться при повторной встрече с антигеном [Антонова Т.В. и соавт., 1999; Фрейдлин И.С., 2001].
Взаимодействуя со специфическими рецепторами поверхности лимфоцитов и активируя клетки, митоген или антиген способен индуцировать каскад биохимических изменений, определяющих дальнейшую морфофункциональную эволюцию и приводящих лимфоциты к митозу [Козинец Г.И. и соавт., 1987, 2002; Phatak P.D. et al., 1998].
Для уточнения представлений о функциональных свойствах лимфоцитарных клеток нами была проведена оценка способности лимфоцитов к бласттрансформации при индукции митогеном ФГА. В отличие от специфического воздействия антигенов, ФГА неспецифически стимулирует лимфоциты к бласттрансформации. При взаимодействии с ФГА лимфоциты увеличиваются в размерах, в них усиливается синтез ДНК, РНК и белка, появляются многочисленные митозы [Козинец Г.И., 1997; Дергунова А.П. и соавт., 2003]. Как показало проведенное нами исследование, у пациентов с ХВГВ, ХВГС, ХВГВ+С, хроническим носительством вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией пролиферативный потенциал лимфоцитов периферической крови оказался достоверно выше, чем у здоровых доноров (табл. 12-14, 16, 63, 74).
Известно, что уровень пролиферации лимфоцитов при ФГА-стимуляции в определенной степени отражает активность иммунного ответа организма на действие вируса, т.е. эффективность иммунной защиты [Никонова М.Ф. и соавт., 1999; Дергунова Н.Н. и соавт., 2003]. Так, ранее проведенное в нашей лаборатории исследование функциональной активности лимфоцитов при персистенции EBV у детей показало, что в острый период инфекции (инфекционный мононуклеоз) ФГА-стимулированный пролиферативный потенциал лимфоцитарных клеток был снижен, однако через месяц после инфицирования показатель нормализовался
![Особенности гломерулонефрита у пациентов с HBV- и HCV-инфекцией [Электронный ресурс]](/i/i/4251/195267.png "Особенности гломерулонефрита у пациентов с HBV- и HCV-инфекцией [Электронный ресурс] Онищенко Анна Анатольевна")