Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль внешней среды, генетических факторов и иммунологических механизмов в развитии ХОБЛ 12
1.2. Значение цинка для функционирования иммунной системы и особенности бронхолегочной патологии при его дефиците 20
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Общая характеристика обследованных групп 32
2.2. Методы исследования 37
2.3. Методы статистического анализа 42
ГЛАВА 3. Состояние иммунной системы, содержание цинка и меди в периферической крови у больных ХОБЛ в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка 44
3.1. Состояние основных звеньев иммунной системы 44
3.2. Содержание цинка и меди в периферической крови 50
3.3. Влияние цинка на функционирование иммунной системы
in vitro и при клиническом применении у больных ХОБЛ 54
ГЛАВА 4. Иммуногенетические исследования при ХОБЛ у лиц, проживающих в регионе дефицита цинка 62
Обсуждение полученных результатов 67
Выводы 81
Практические рекомендации 82
Библиографический указатель 83
- Роль внешней среды, генетических факторов и иммунологических механизмов в развитии ХОБЛ
- Значение цинка для функционирования иммунной системы и особенности бронхолегочной патологии при его дефиците
- Общая характеристика обследованных групп
- Состояние основных звеньев иммунной системы
Введение к работе
Актуальность темы
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой одну из важнейших медицинских и социально-экономических проблем в связи с широкой распространенностью, прогрессирующим течением, сокращением продолжительности жизни больных (Чучалин А.Г. и соавт., 2004). Исследования, проведенные под эгидой ВОЗ и Всемирного Банка, установили средние цифры распространенности ХОБЛ в мире среди мужчин и женщин во всех возрастных .группах, составляющие у мужчин 9,3, у женщин 7,3 на 1000 населения (World Health Report, 2000). Помимо повсеместно наблюдаемого роста распространенности ХОБЛ, в настоящее время еще более высокие цифры представляет показатель смертности от этого заболевания. Эта болезнь занимает 4-5-е место среди причин смерти у людей старше 45 лет. В России показатель смертности для мужчин составил 141,7 на 100 тысяч населения (Чучалин А.Г. и соавт., 2004).
Ключевым звеном патогенеза этого заболевания является воспалительный процесс, поддерживаемый активностью накопившихся в респираторном тракте нейтрофилов, макрофагов и включающий аутоиммунный компонент за счет цитотоксического действия С08+-Т-лимфоцитов в отношении собственных клеток респираторной системы, модифицированных под влиянием внешних воздушных ирритантов (Tudhope SJ. et al., 2007; Yoshida Т., Tuder R.M., 2007). В связи с разночтениями в определении, диагностике и лечении ХОБЛ во всем мире эксперты ВОЗ разработали документ под названием GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung disease), включающий рекомендации (стандарты) к диагностике и лечению этого заболевания. Этиология ХОБЛ напрямую связана с факторами риска, вызывающими заболевание. Факторами риска ХОБЛ в соответствии с GOLD (2006) названы: вдыхание вредоносных частиц - табачного дыма и производственной пыли, дефекты питания, низкий социально-экономический
5 статус, острые респираторные инфекции и др. Действие указанных факторов реализуется через иммунологические механизмы (Yoshida Т., Tuder R.M., 2007; Mehta Н. et al., 2008; Mortaz E. et al., 2009). Приведенные в литературе данные по изучению характера иммунологических изменений при ХОБЛ на системном уровне неоднозначны и противоречивы. Примечательно, что существует большая вариабельность и в клинических проявлениях ХОБЛ, что, возможно, определяется разнородностью иммунологических изменений на системном уровне и зависит от вида фактора риска, приведшего к развитию заболевания в конкретном случае. В этой связи заслуживает внимания высокая распространенность и неблагоприятное течение ХОБЛ (гнойный характер воспаления, склонность к формированию бронхоэктазов, частые обострения, резистентность к проводимой терапии) у жителей так называемого Прикубнино-цивильского субрегиона Чувашской Республики (ЧР), отличающегося низким содержанием цинка в объектах окружающей среды (уровень подвижного цинка в почве менее 0,1 мг/кг) и в водно-пищевом рационе населения - 9,1±0,9 мг/сут (Сусликов В.Л., 2001) при рекомендованной ВОЗ норме - 15 мг/сут (Нормы физиологических потребностей в пищевых веществах и энергии для различных групп населения СССР, 1992; Committee on Dietary Allowances, Food and Nutrition Board, National Research Council. Recommended dietary allowances, 1980). Ранее проведенные исследования показали, что около 70 % жителей этой территории испытывают субклинический дефицит цинка, вызывающий нарушения в клеточном звене иммунного ответа и повышенную восприимчивость к респираторным инфекциям (Карзакова Л.М., 2005). Проживание в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка можно рассматривать как фактор риска развития инфекционно-воспалительных заболеваний органов дыхания (Геранюшкина Е.И., 2005; Карзакова Л.М., 2005; Еленкина Ж.В., 2006). Известно, что действие факторов риска реализуется в развитии ХОБЛ лишь при наличии определенной генетической предрасположенности (Дидковский Н.А.,
Жарова М.А., 2005; Joos L. et al., 2002). Влияние естественного дефицита цинка на иммунную систему также находится под генетическим контролем, в частности - аллелей системы HLA (от Human Leucocyte Antigens) (Карзакова Л.М., 2005). Многочисленные данные об обнаружении у больных ХОБЛ всякого рода изменений количественно-функциональных характеристик дендритных клеток (ДК) (Sabroe I. et al., 2007; Robbins C.S. et al., 2008; Tsoumakidou M. et al., 2008), являющихся, как известно, «профессиональными» антигенпредставляющими клетками и регуляторами иммунологического гомеостаза в организме, подчеркивают необходимость исследований связи ХОБЛ с аллелями системы HLA, обеспечивающей процессинг и презентацию антигенных пептидов (Janeway С.А., 1997; Krensky A.M., 1997).
В связи с вышесказанным можно полагать, что проживание в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка откладывает определенный отпечаток на иммунопатогенез и клиническое проявление ХОБЛ, возможно, контролируемых генетической системой HLA. Система генов HLA зарекомендовала себя в качестве наилучших генетических маркеров для выявления предрасположенности к развитию различных патологических состояний, связанных с иммунологическими нарушениями. В этой связи большой теоретический и практический интерес представляет установление связи HLA-аллелей с патогенетически важными особенностями иммунного статуса больных ХОБЛ.
Цель настоящего исследования - изучить иммуногенетическую структуру и состояние иммунной системы у больных ХОБЛ, проживающих в регионе естественного дефицита цинка.
Задачи исследования:
1. Изучить показатели врожденного и приобретенного иммунитета у больных ХОБЛ цинкдефицитного субрегиона (Прикубнино-цивильский
7 субрегион) и субрегиона с нормальным содержанием цинка (Присурский субрегион).
Исследовать содержание цинка и его конкурента за белково-связывающие сайты - меди в периферической крови у больных ХОБЛ указанных субрегионов.
Провести исследование особенностей распределения HLA-аллелей классов I и II, а также их связи с ХОБЛ и иммунологическими параметрами у больных, проживающих в условиях естественного дефицита цинка.
Оценить влияние сульфата цинка на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток (ИКК) больных ХОБЛ in vitro.
Провести анализ изменений клинико-иммунологических параметров у больных ХОБЛ под влиянием комплексного лечения, включающего сульфат цинка.
Научная новизна
Впервые проведено изучение связи между показателями иммунной системы, содержанием цинка и его конкурента за белковосвязывающие сайты -меди в периферической крови у больных ХОБЛ, проживающих на территориях с различным уровнем обеспеченности цинком. Показана специфичность патогенетических механизмов возникновения ХОБЛ в условиях дефицита цинка, когда на первый план выступают снижение Т-клеточной функции иммунной системы, фагоцитарной активности нейтрофилов, ускорение активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов, дисбаланс гомеостаза цинка и меди.
Дана характеристика иммуногенетического профиля больных ХОБЛ, проживающих в регионе естественного дефицита цинка, при этом показано, что реализация влияния внешних факторов на иммунную систему находится под контролем генов системы HLA. Идентифицированы маркеры предрасположенности к ХОБЛ в условиях дефицита цинка - аллели
8
DRB1* 11(05) и DQB 1*0301 и маркеры резистентности - аллели DRB1*01,
DQA1*0101 и DQB 1*0501. Выявлена связь HLA-маркеров
предрасположенности к ХОБЛ - DRB1*11 и DQB1*0301 - с рядом патогенетически важных параметров иммунного статуса (сниженное содержание циркулирующих в крови CD3+-, CD4+-, CD8+- субпопуляций лимфоцитов, снижение ФГА-индуцированной лимфопролиферативной активности).
Установлено иммуномодулирующее действие цинксодержащего препарата (сульфат цинка) in vitro в ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов и при клиническом применении у больных ХОБЛ (увеличение числа Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперной субпопуляции, повышение иммунорегуляторного индекса и ФГА-стимулированной лимфопролиферации, снижение уровня IgA).
Практическая значимость
Установление у больных ХОБЛ связи нарушений иммунного ответа с недостатком цинка в периферической крови создали предпосылки для разработки методов направленной иммунокоррекции. Выявление иммуномодулирующего действия сульфата цинка на пролиферативную активность Т-лимфоцитов in vitro и положительной клинико-иммунологической динамики у больных ХОБЛ при включении в лечебный комплекс перорального введения этого препарата открывает перспективы для использования цинксодержащих соединений при лечении больных ХОБЛ с нарушением Т-клеточных функций и дефицитом цинка.
Выявленные HLA-маркеры предрасположенности и резистентности к возникновению заболевания у жителей цинкдефицитной территории могут быть использованы для прогнозирования развития ХОБЛ и ее ранней диагностики.
9 Основные положения, выносимые на защиту:
Специфическим звеном патогенеза ХОБЛ в условиях природного недостатка цинка является дисбаланс гомеостаза цинка и меди, отрицательно влияющий преимущественно на Т-клеточное звено иммунной системы.
Наличие у жителей цинкдефицитной территории в генотипе аллелей DRB 1*11 (05) и DQB 1*0301, ассоциированных с патогенетически значимыми изменениями показателей клеточного механизма адаптивного иммунитета, определяет повышенный риск развития ХОБЛ.
Цинксодержащий препарат - сульфат цинка оказывает иммуномодулирующее действие in vitro и при клиническом применении у больных ХОБЛ.
Внедрение результатов исследования в практику
В процессе выполнения работы разработаны и реализованы два рационализаторских предложения (№1157 от 11.03.2009, №1158 от 11.03.2009). Рекомендации, разработанные и предложенные автором, используются для оценки клеточного звена адаптивного иммунного ответа, оптимизации лечения больных ХОБЛ в пульмонологическом отделении МУЗ «Центральная городская больница» Управления здравоохранения и социальной политики администрации г. Чебоксары.
Основные положения диссертации используются в процессе обучения на курсах повышения квалификации терапевтов, врачей общей практики, в учебном процессе на занятиях по клинической иммунологии, патологической физиологии и внутренним болезням для студентов медицинского факультета Чувашского государственного университета.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены на научно-практической
конференции, посвященной 70-летию ГУЗ «Республиканский
10 противотуберкулезный диспансер» Минздравсоцразвития ЧР «Актуальные вопросы фтизиатрии и пульмонологии» (Чебоксары, 2007); научной конференции к 60-летию ГУЗ «Республиканская клиническая больница» Минздравсоцразвития ЧР «Вопросы клинической медицины» (Чебоксары, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2008); Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008); объединенном заседании кафедр внутренних болезней лечебного факультета, патологической физиологии, внутренних болезней стоматологического и педиатрического факультетов ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова» (Чебоксары, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Оформлено два рационализаторских предложения.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106
страницах компьютерного набора, иллюстрирована 15 таблицами,
7 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 227 источников (77 отечественных и 150 зарубежных) и приложения.
Роль внешней среды, генетических факторов и иммунологических механизмов в развитии ХОБЛ
ХОБЛ - сложный патологический процесс респираторной системы, включающий воспаление с преимущественным поражением дистальных отделов дыхательных путей и легочной паренхимы с развитием эмфиземы. В связи с разночтениями в определении, диагностике и лечении ХОБЛ во всем мире эксперты ВОЗ разработали документ под названием GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung disease), включающий рекомендации (стандарты) к диагностике и лечению этого заболевания. Этот документ постоянно пересматривается и дополняется, последний вариант обновленной программы GOLD издан в 2006 г. (GOLD, 2006). В соответствии с GOLD, «ХОБЛ - болезненное состояние, характеризующееся не полностью обратимой бронхиальной обструкцией. Обструкция прогрессирует и является следствием атипичной воспалительной реакции легких на раздражающие частицы и газы».
Ключевые патологические компоненты ХОБЛ - деструкция легочной паренхимы (эмфизема легких), воспаление центральных воздухоносных путей (хронический бронхит) и воспаление периферических воздухоносных путей (респираторный бронхиолит). Этиология ХОБЛ напрямую связана с факторами риска, вызывающими заболевание. К основным факторам риска ХОБЛ в соответствии с GOLD относятся следующие факторы: генетические, вдыхание вредоносных частиц (табакокурение, производственные пыли - органические и неорганические, домашние пыли - экология жилища, пыли вне дома - экология окружающей среды), рост и развитие легких, оксидативный стресс, пол, возраст, респираторные инфекции, социоэкономический статус, питание, коморбидные состояния.
Главный фактор риска в 80-90 % случаев ХОБЛ - курение. Курильщики имеют максимальные показатели смертности, у них быстрее развиваются необратимые обструктивные изменения функции дыхания и все известные патоморфологические и патофизиологические признаки ХОБЛ. Курение индуцирует характерную для ХОБЛ перестройку врожденного и приобретенного иммунитета на местном уровне в респираторном тракте, апоптоз эпителиальных клеток, повреждение экстрацеллюлярного матрикса (Srominski J.M., Kedziora К., 2006; Robbins C.S. et al., 2008), иммунологические нарушения на системном уровне (Byron К.A. et al., 1994; Moszczynski P. et al, 2001). Исследованиями in vitro показано, что экспозиция макрофагальных клеток с сигаретным дымом вызывает изменение экспрессии на них генов цитокинов (Kent L.et al., 2008).
Среди основных факторов риска профессиональной природы наиболее агрессивными считаются кадмий и кремний. Профессии с повышенным риском развития ХОБЛ - шахтеры, строители, рабочие металлургической промышленности, рабочие, занятые переработкой зерна, хлопка и производством бумаги. Не все работники профессий с повышенным риском развития ХОБЛ, равно как и не все курящие, заболевают ХОБЛ. Видимо, действие факторов внешней среды реализуется в развитии ХОБЛ лишь при наличии определенной генетической предрасположенности (Дидковский Н.А., Жарова М.А., 2005; Joos L. et al., 2002). Доказательством значимости последней в развитии ХОБЛ является избирательность развития заболевания в группах риска (Joos L. et al., 2002). Другим подтверждением суммации внешних и внутренних (генетических) факторов является наблюдение, демонстрирующее, что у курящих родственников больных тяжелой ХОБЛ довольно быстро развивается эта болезнь (в сравнении с курящими, не состоящими в родстве с больным ХОБЛ). Предполагается наличие группы генов восприимчивости ХОБЛ, включающих гены фактора некроза опухоли-альфа (ФНОсс), трансформирующего фактора роста-бетаї (TGF-Pi) (Дидковский Н.А., Жарова М.А., 2005; Янбаева Д.Г. и соавт., 2005). Однако нет четких данных о локализации этих генов. Более того, недавно проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии связи между генами цитокинов, играющих значимую патогенетическую роль при ХОБЛ и риском развития этого заболевания (Hsieh М.Н. et al., 2008).
С.-А. Brandsma и соавторы (2008), основываясь на экспериментальных исследованиях, посвященных изучению роли в развитии ХОБЛ гемоксигеназы протективного фермента, обладающего антиоксидантным и противоспалительным действием, предполагают, что развитие ХОБЛ связано с полиморфными вариантами промоторного гена этого фермента. К настоящему моменту нет данных, подтверждающих это предположение. Дефицит аг антитрипсина является в настоящее время единственной хорошо изученной генетической патологией, ведущей к развитию ХОБЛ (Hutchison D.C., Cooper D., 2004). „
Многочисленные данные об обнаружении у больных ХОБЛ всякого рода изменений количественно-функциональных характеристик дендритных клеток (ДК) (Sabroe I. et ah, 2007; Robbins C.S. et al., 2008; Tsoumakidou M. et al, 2008), являющихся, как известно, «профессиональными» антигенпредставляющими клетками и регуляторами иммунологического гомеостаза в организме, диктуют необходимость исследований связи ХОБЛ с HLA-аллелями. Именуемый у человека главный комплекс гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex, сокращенно МНС) как система HLA (от Human Leucocyte Antigens), наряду с распознаванием своих и чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, обеспечивает запуск и реализацию иммунного ответа, осуществляя процессинг и презентацию антигенных пептидов (Janeway С.А., 1997; Krensky A.M., 1997). Молекулы HLA классов I и II в качестве рецепторов участвуют в регуляции процессов активации, пролиферации и дифференцировки ИКК. Центральным звеном клеточной кооперации при иммунном ответе является взаимодействие между экспрессированными на поверхности антигенпредставляющих клеток молекулами HLA в комплексе с антигенным пептидом и антиген-распознающим рецептором Т-лимфоцитов CR (T-cell receptor). При этом одновременно с распознаванием пептида происходит распознавание собственных HLA-антигенов (Zinkernagel R., Doherty P., 1974). Различия между HLA-антигенами класса I и II в функциональном отношении заключаются в том, что молекулы класса I презентируют СВ8+-лимфоцитам антигенные пептиды, синтезируемые эндогенно, в то время как антигены II представляют СБ4+-лимфоцитам пептиды экзогенного происхождения (Janeway С.А., 1997; Krensky A.M., 1997). Одним из механизмов развития ХОБЛ, возможно, является нарушение процессинга и презентации антигенов, связанное с определенными HLA-аллелями, реализующееся в расстройстве регуляции иммунного ответа. В доступной литературе мы нашли лишь единичные работы по изучению HLA ассоциации с ХОБЛ. Так, исследования в итальянской популяции и у европеоидов Канады не выявили связи ХОБЛ с HLA (Recalde Н. et al., 1999; Kasuga I. et al., 2005). Японские ученые, изучая связь HLA с диффузным панбронхиолитом, который входит в состав обструктивных заболеваний легких и объединяет с ХОБЛ наличие общего патоморфологического признака - воспалительного поражения дыхательных путей диаметром менее 2 мм, выявили HLA-маркер этого заболевания - HLA-B 5401 (Keicho N. et al., 1998).
Значение цинка для функционирования иммунной системы и особенности бронхолегочной патологии при его дефиците
Курение и вдыхание атмосферных поллютантов названы основными факторами риска развития ХОБЛ (GOLD, 2006). Однако в Китае, где курит 50 % мужчин и 6 % женщин, распространенность ХОБЛ среди мужчин и женщин примерно одинаковая. Возможно, курение и атмосферные поллютанты, являясь решающими факторами риска ХОБЛ в развитых странах, уступают по значимости в развивающихся странах другим факторам, прописанным в программе GOLD (дефекты питания, низкий социоэкономический уровень, частые респираторные инфекции, низкая масса тела при рождении). Вклад каждого фактора риска в развитие ХОБЛ может быть разным в каждом конкретном случае, что и определяет вариабельность характера течения заболевания у индивидуума и множественность вариантов течения в популяции. В этой связи наше внимание привлекла Чувашия, на территории которой выделяются два контрастных субрегиона - Прикубнино цивильский и Присурский, различающиеся по проявлению биологических реакций у населяющих их людей и клинико-эпидемиологическим характеристикам бронхолегочных заболеваний (Сусликов В.Л., 2000). В Прикубнино-цивильском субрегионе регистрируются наиболее высокие в Чувашии показатели заболеваемости и смертности по болезням органов дыхания - хронического бронхита, пневмонии, туберкулеза легких (Акугинова З.Д. и соавт., 1989; Михайлова И.В. и соавт., 1994; Воронова Г.В., 2003; Еленкина Ж.В., 2006). Указанные субрегионы Чувашии, выделенные В.Л.Сусликовым и В.Д. Семеновым (1981) на основе биогеохимического районирования Чувашии, отличаются содержанием подвижного цинка в почве и, следовательно, водно-пищевом рационе жителей.
Известно, что цинк является компонентом более 300 энзимов. К цинксодержащим ферментам относятся альдолазы, фосфатазы, пептидазы, циклическая фосфодиэстераза, протеинкиназа, алкогольдегидрогеназа и др. Данный микроэлемент принимает участие во всех видах обмена, обладает антиоксидантними свойствами, входит в состав генетического аппарата клетки. Он оказывает влияние на процессы роста и полового созревания организма. Цинк необходим для синтеза и функционирования таких ферментов, как нуклеотидаза, ДНК- и РНК-полимераза, тимидинкиназа (Тутельян В.А., 2001; Prasad A.S. et al., 1971; Williams R.B. et al. 1973; Vallee B.L., 1976; Prasad A.S., 1981; Riordan J.E., Williams R.B., 1989; Coleman I.E., 1992; Cousins R.J., 2003). Этим объясняется его существенное влияние на имaмунную систему. В настоящее время четко доказана зависимость функционирования иммунной системы от адекватности содержания цинка в организме (Prasad A.S., 1980; Chandra R.K., 1985; Dowd P.S.et al., 1986; Fraker P.J. et al., 2000; Dardenne M., 2002). Исследования R.Chandra (1980) продемонстрировали угнетение клеточного типа иммунного ответа у больных с врожденным цинкдефицитным состоянием - энтеропатическим акродерматитом. В дальнейших исследованиях, подтвердивших и дополнивших полученные R.Chandra результаты, было выявлено, что недостаток цинка вызывает инволюцию тимуса (Beshgetoor D., Lonnerdal В., 1997), снижение NK-активности и уменьшение общего числа Thy-1,2+- лимфоцитов (Allen J.I. et al., 1983; Prasad A.S. , 1998; Dardenne M., 2002). P. Fraker с соавторами (1982) и J.Wirth с соавторами (1986) показали, что дефицит цинка нарушает функции макрофагов и приводит к угнетению фагоцитоза и внутриклеточного киллинга.
Свидетельством нарушения функциональной активности Т-лимфоцитов при цинковой недостаточности является угнетение пролиферативного ответа мононуклеаров на различные митогены в реакции бласттрансформации. Добавление цинка in vitro в культуру лимфоцитов приводило к стимуляции их ФГА - индуцированной пролиферации (Winchurch R.A., 1988). Модулирующее влияние на митогенстимулированную пролиферативную активность лимфоцитов оказывало и пероральное введение соединений цинка (Duchateau J. et al., 1981). В ряде работ приводятся данные, показывающие, что стимуляция пролиферативной активности Т-лимфоцитов и активация синтеза медиаторов иммунного ответа, наблюдающиеся при добавлении определенных количеств цинка, а также обусловленные дефицитом цинка нарушения в иммунной системе (инволюция тимуса, отклонения в количественных и функциональных параметрах Т-системы иммунитета) реализуются на уровне плазматической мембраны иммуноцитов, являющейся ключевой структурой в иммунных функциях, включая такие феномены как кэппинг, межклеточный контакт, связывание антигена (Loor F., 1980; Parker P.J. et al., 1986; Csermely P. et al., 1988; Langlois M.A. et al., 2003).
Обращает внимание многочисленность публикаций, посвященных влиянию цинка на апоптоз различных клеток организма человека и лабораторных животных (Walker N.I. et al., 1988; Steller H., 1995; Telford W., Fraker P., 1995; Mathieu J. et al, 1996; Репу D.K. et al., 1997; Aiuchi T. et al., 1998; Ishido M. et al., 1999; Nodera M. et al., 2001; Ganju N., Eastman A., 2003; Fraker P.J., Lill-Elghanian D.A., 2004). Наиболее ярко проявляется антиапоптотическое действие цинка в отношении лимфоидных клеток (Fraker P.J., King L.E., 2004). В процессе развития клеток иммунной системы апоптоз многократно выступает в роли регулятора общей численности клеточных популяций и соответствующего распределения их в тканях, а также в качестве фактора отбора. Последняя функция проявляется при формировании клональной структуры популяций лимфоцитов (Ярилин А.А., 1996). Изучению и расшифровке механизмов антиапоптотического действия цинка посвящено множество работ. Первоначально антиапоптотическое действие цинка связывали с его ингибирующим влиянием на Са , Mg - зависимую эндонуклеазу. Позже было показано, что цинк ингибирует каспазу-3 -наиболее значимую для реализации апоптоза протеазу (Perry D.K. et al., 1997; Aiuchi Т. et al., 1998). В последнее время появились данные, свидетельствующие об ингибирующем влиянии цинка на более ранние стадии «апоптотической системы» - на уровне генной регуляции. В частности, показано, что цинк проявляет антиапоптогенное действие, ингибируя гены апоптоза Вах и Bak (Ganju N., Eastman А., 2003). У мышей описан эндогенный ингибитор апоптоза А20, представляющий собой цинк-связывающий белок (zinc finger protein), который спонтанно экспрессируется в тканях, особенно лимфоидных (Tewari М. et al., 1995). В тканях человека обнаружен ассоциированный с ионами цинка ген ZNF307 (ответственный за кодирование белка 545аа), повышенная экспрессия которого супресссирует процесс апоптоза (Li J. et al., 2007). Возможно, цинк реализует антиапоптотическое действие и опосредованно через ростовые факторы - ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-у. Вместе с тем, зависимые от адекватности содержания цинка в организме ИЛ-2, ИФН-у могут сами вызывать апоптоз клеток (Groux Н. et al., 1993; Migliorati G. et al., 1993). Причем показано, что апоптотическое действие ИЛ-2 проявляется лишь в том случае, когда концентрация цитокина достигает высоких значений (Groux Н. et al., 1993).
Общая характеристика обследованных групп
Для достижения поставленной цели было проведено популяционное иммуногенетическое исследование у 113 практически здоровых жителей и у 31 больного ХОБЛ (в стадии ремиссии) цинкдефицитной территории чувашской национальности, а также клинико-иммунологическое обследование 60 больных ХОБЛ чувашской национальности в стадии обострения, госпитализированных в пульмонологическое отделение ГУЗ «Республиканская клиническая больница» Минздравсоцразвития ЧР. Национальность обследованных устанавливали по паспортным данным и путем опроса с учетом предшествующих поколений родственников и места жительства. ХОБЛ диагностировали по данным анамнеза с учетом эпидемиологических критериев диагностики бронхитов, объективного обследования (перкуссия и аускультация), лабораторного исследования (включая гемограмму, общий и бактериологический анализ мокроты, исследование микрофлоры мокроты методом полимеразной цепной реакции - ПЦР), рентгенологических и бронхоскопических изменений, показателей функции внешнего дыхания, результатов фармакологических проб с бронхо лити ком антихолинергического действия - ипратропия бромидом в соответствии с диагностическими критериями GOLD (2006).
Больные ХОБЛ в стадии обострения были разделены на три группы: Группа IA (п=20) - больные, проживающие в цинкдефицитном субрегионе (Прикубнино-цивильском субрегионе), получавшие стандартное лечение: антибиотик амоксициллин, муколитик амброксол, бронхолитик ипратропия бромид, физиотерапевтические процедуры - электрическое поле УВЧ на боковые отделы грудной клетки, возраст больных 54,1±13,8 лет.
Группа ІБ (n=20) - больные, проживающие в Прикубнино-цивильском субрегионе. В отличие от больных группы IA, в схему лечения дополнительно к стандартной базисной терапии включали цинксодержащий препарат - сульфат цинка в средней суточной дозировке 150-200 мг, разделенной на 3 приема. Возраст больных 55,1+11,9 лет. Группа II (п=20) - больные, проживающие в контрольном субрегионе, получавшие стандартное лечение, как и больные IA группы. Возраст больных 56,1 ±9,1 лет. Для обеспечения репрезентативности результатов исследований проводили рандомизацию групп больных по характеру эндобронхита, функциональной характеристике заболевания, а также - по полу, возрасту, национальному составу, социальному статусу, наличию вредных привычек, длительности заболевания. При отборе руководствовались следующими критериями включения в исследование: 1) больные обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет, 2) установленный диагноз ХОБЛ, 3) письменное добровольное информированное согласие больного на участие в клиническом эксперименте. Клиническими критериями исключения из исследования являлись: 1) сопутствующие заболевания (сердечно-сосудистые, желудочно-кишечные, эндокринные и др.), за исключением заболеваний верхних дыхательных путей (синуситы, тонзиллит, фарингит); 2) патология органов дыхания, отличная от ХОБЛ; 3) лица с первичным иммунодефицитом; 4) возраст старше 60 лет; 5) беременные женщины; 6) отсутствие согласия между врачом и пациентом. Основную массу больных (88 %) составляли лица мужского пола. Средняя длительность заболевания у больных цинкдефицитного субрегиона 17,1±9,7 лет, контрольного субрегиона - 16,0±8,6 лет. Курящих в цинкдефицитном субрегионе - 78 % (количество «пачки/лет» - 12,2±5,6), в контрольном субрегионе - 80 % (количество «пачки/лет» - 14,2±7,6). При изучении наследственности у 52,5 % больных из зоны с дефицитом цинка и у 10 % контрольного субрегиона выявлено наличие хронических бронхолегочных заболеваний у родственников. У 95,1 % больных обострению ХОБЛ предшествовали простудные заболевания (ОРВИ, ангины), подавляющее большинство больных указывало на сезонные рецидивы болезни в осенне-весенний период. Обращали на себя внимание различия в клинических проявлениях заболевания в зависимости от принадлежности больных к тому или иному субрегиону. Так, у больных из контрольного субрегиона обострения ХОБЛ протекали более остро, с повышением температуры тела до субфебрильных (в 35 % случаев), в ряде случаев (у 2-х больных из 20 обследованных) - до фебрильных цифр. Обострение заболевания у жителей цинкдефицитного субрегиона имело вялое течение, редко сопровождалось повышением температуры до субфебрильных цифр. Лишь у 12,5 % больных обнаружено повышение температуры тела до субфебрильных цифр. Кашель отмечали все больные. У больных цинкдефицитной территории воспаление чаще носило гнойный характер, нередко имелись признаки полостного синдрома, обусловленные развитием такого осложнения, как вторичные бронхоэктазы. У большинства больных выслушивалось ослабленное везикулярное дыхание, с удлинением выдоха, на фоне которого выслушивались сухие, а у 45,0 % больных - влажные хрипы. При исследовании больных с физической нагрузкой (6-минутная шаговая проба) больные цинкдефицитного субрегиона в среднем проходили 403±125 м, контрольного субрегиона -450+130 м.
Определение общего белка и его фракций, С-реактивного белка, билирубина, аминотрансфераз, показателей коагулограммы, а также общий анализ крови проводили унифицированными клиническими лабораторными методами исследований (Лабораторные методы исследования в клинике, 1982). Средние показатели СОЭ были примерно одинаковыми у всех обследованных: у больных контрольной группы - 16",6±8,3 мм/ч, у пациентов из цинкдефицитных территорий - 15,4±12,2 мм/ч, С-реактивный белок — 13,2+3,1 мг/л в контрольной группе и 11,2±2,7 мг/л в цинкдефицитном субрегионе.
При бактериологическом исследовании мокроты у больных из контрольного субрегиона в преобладающем большинстве случаев обнаруживали а-гемолитический стрептококк (55 %) и гемофильную палочку (20 %). Доля Р-гемолитического стрептококка группы А составила 5 %. У больных цинкдефицитных территорий, кроме того, высевались такие грамотрицательные микроорганизмы, как клебсиелла, синегнойная палочка, вульгарный протей. Исследование мокроты методом ПЦР чаще выявляло у больных цинкдефицитного субрегиона внутриклеточно развивающиеся микроорганизмы (Mycoplasma и Chlamydophila pneumoniae): в 22,5±6,6 % случаев - в Прикубнино-цивильском субрегионе и в 5,0±4,8 % - в контрольном субрегионе (р 0,05).
Функциональное исследование легких методом спирографии выявило нарушение функции внешнего дыхания по обструктивному типу (ОФВ] менее 80 % от должных величин, ОФВі/ФЖЕЛ менее 70 %) у всех больных. Бронходилатационный тест с ипратропиумом бромидом выявил необратимость обструкции (прирост ОФВ] менее 15 %) у 100 % больных. На основании учета функциональных показателей и основных клинических признаков установлены стадии ХОБЛ. Больные контрольной группы распределились по выраженности стадии заболевания следующим образом: I ст. - 5 % больных, II ст. - 40 %, III ст. - 50 %, IV ст. - 5 %. В группе пациентов из цинкдефицитной территории у 5 % установлена I ст. заболевания, у 40 % - II ст., у 52,5 % - III ст., у 2,5 % - IV ст.
Состояние основных звеньев иммунной системы
При анализе показателей иммунного статуса в группах больных цинкдефицитного и контрольного субрегионов ЧР использовали в качестве референтных величин показатели здоровых популяций указанных субрегионов, полученные в ранее проведенных исследованиях (Ковальчук Л.В. и соавт., 2004). Сравнительное изучение показателей иммунного статуса больных и здоровых жителей контрольного субрегиона (табл. 2) позволило установить, что при ХОБЛ достоверно увеличено число нейтрофилов и эозинофилов. Напротив, относительное число лимфоцитов и количественные показатели Т-системы иммунитета - число Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), относительное число цитотоксических лимфоцитов (CD8+) были уменьшены. Из иммунорегуляторных субпопуляций в большей степени сокращалась численность Т-хелперов, в результате чего снижался иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) с 1,52±0,3 у здоровых до 1,24±0,32 (р 0,01). Наблюдалось умеренное (р 0,05) снижение ФГА-стимулированной пролиферации лимфоцитов. На фоне обострения заболевания происходило увеличение числа В-лимфоцитов (CD20+) и повышение уровней IgM и IgA. Показатель фагоцитарной активности нейтрофилов - фагоцитарный индекс был достоверно снижен.
Изменения в иммунном статусе у больных цинкдефицитного субрегиона при ХОБЛ имели общие черты с таковыми у больных контрольного субрегиона, что проявлялось в увеличении числа нейтрофилов, уменьшении процентного числа лимфоцитов, снижении показателей клеточного звена адаптивного иммунного ответа (уменьшение числа Т-лимфоцитов и ФГА-стимулированной пролиферации лимфоцитов) и иммунорегуляторного индекса (с 1,4±0,24 у здоровых до 1,15+0,35 у больных, р 0,05), а также снижении фагоцитарного индекса нейтрофилов. У больных цинкдефицитного субрегиона, как и в контрольной группе, повышался уровень сывороточного IgA. Вместе с тем у больных, проживающих в субрегионе с недостатком цинка, выявлялись и некоторые «новые» черты иммунологических сдвигов, отсутствовавшие у больных контрольного субрегиона. В частности, обострение ХОБЛ в условиях дефицита цинка протекало на фоне нейтрофильного лейкоцитоза, в то время как у больных контрольного субрегиона число лейкоцитов не отличалось от показателя здоровых. При этом уменьшалось фагоцитарное число нейтрофилов. Сокращалось, по сравнению со здоровыми, число цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). Не увеличивалось, в отличие от больных контрольного субрегиона, число В-лимфоцитов (CD20+) и не повышалось содержание IgM в сыворотке крови. Сравнение иммунологических параметров исследуемых групп больных между собой показало, что в условиях естественного дефицита цинка обострение ХОБЛ сопровождалось более выраженной депрессией показателей клеточного составляющего адаптивного иммунитета -уменьшением общего числа Т-лимфоцитов, преимущественно за счет сокращения численности клеток Т-хелперной субпопуляции, и снижением ФГА-индуцированной лимфопролиферации. Кроме того, у больных цинкдефицитного региона уменьшено число В-лимфоцитов (CD20+), снижен фагоцитарный индекс, увеличено относительное число нейтрофилов на фоне уменьшения процентного содержания лимфоцитов и повышен уровень IgA в сыворотке крови.
Анализ показателей экспрессии активационных маркеров на мононуклеарах выявил у больных ХОБЛ контрольной группы снижение экспрессии рецептора к ИЛ-2 (CD25) - маркера ранней активации лимфоцитов (рис. 1). При этом абсолютные значения содержания клеток, несущих рецептор трансферрина (CD71+) и HLA-DR+-aHTHreHbi, изменялись несущественно, хотя и было увеличено процентное число HLA-DR+- eTOK. Другой маркер активированных клеток - CD95 встречался с такой же частотой, как и у здоровых. Несколько иной характер изменений экспрессии активационных маркеров на МНК обнаружен у больных цинкдефицитной территории. В частности, наряду с уменьшением числа С025+-клеток, у них наблюдалось снижение содержания СБ71+-клеток (рис. 2).
При сравнении показателей в группах между собой было выявлено, что у больных цинкдефицитной зоны снижено относительное и абсолютное содержание всех субпопуляций МНК, несущих исследуемые активационные маркеры, за исключением С095+-клеток, относительное число которых, напротив, было увеличено (рис. 3), а абсолютное - не отличалось от аналогичного показателя больных контрольного субрегиона.
