Генетические аспекты гипертонической болезни и подходов к антигипертензивной терапии Хасанов, Нияз Рустемович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 15

1.1. Роль наследственных факторов в развитии гипертоническойболезни.

1.2. Мембранная концепция гипертонической болезни .

1.3. Состояние вегетативной нервной системы при ГБ.

1.3.1. Изменения вегетативной нервной системы при ГБ.

1.3.2. Вариабельность ритма сердца - физиология,методы определения.

1.4. Лекарственная терапия гипертонической болезни. 15

Глава 2. Материал и методы исследования. 37

2.1 Материал исследования.

2.2 Дизайн исследования.

2.2.1. Определение функционального состояния клеточных мембран .

2.2.2. Исследование полиморфных маркеров генов-кандидатов.

2.2.3. Оценка функционального состояния ВИС. 37

Глава 3. Результаты собственных исследовании. 55

3.1. Данные клинического обследования. 55

3.2 Генетический анализ в когорте. 56

3.3. Генетический полиморфизму больных гипертонической болезнью в квартилях скорости Na+-Ы+-противотранспорта в мембране эритроцита . 60

3.4. Анализ ассоциаций полиморфизмов генов в сибсовых парах. 65

3.4.1. Анализ вклада полиморфизма генов в развитие гипертонической болезни в сибсовых парах. 65

3.4.2. Факторный анализ вклада полиморфных маркеров генов в раннее развитие гипертонической болезни. 69

3.4.3. Анализ ассоциации полиморфизма генов со скоростью Na -Li - противотранспорта в мембране эритроцита в сибсовых парах. 75

3.4.4. Анализ вклада полиморфизма генов в формирование уровня артериального давления в сибсовых парах. 76

3.4.5. Анализ вклада полиморфизма генов в развитие ремоделирования миокарда у пробандов-болъных гипертонической болезнью. 78

3.4.6. Вклад полиморфизма генов в формирование показателей спектра частот вариабельности сердечного ритма у пробандов-больных гипертонической болезнью. 80

3.5. Эффективность антигипертензивной терапии у больных гипертонической болезнью. 84

3.5.1. Эффективность гипотензивной терапии и генетический полиморфизм. 89

3.5.2. Эффективность антигипертензивной терапии и скорость Na+-Li+- противотранспорта в мембране эритроцита. 101

3.6. Эффективность гипотензивной терапии нифедипином. 109

3.6.1. Генетические маркеры эффективности антигипертензивной терапии нифедипином. 112

3.6.2. Эффективность антигипертензивной терапии нифедипином и скорость Na -Li -противотранспорта в мембране эритроцита. 114

Глава 4. Обсуждение полученных результатов. 139

4.1. Генетические маркеры гипертонической болезни.

4.2. Предикторы эффективности антигипертензивной терапии .

4.3. Способ прогнозирования эффективности антигипертензивнойтерапии.

4.4. Заключение. 139

Выводы 159

Практические рекомендации 161

Список литературы 162

• Мембранная концепция гипертонической болезни
• Определение функционального состояния клеточных мембран
• Генетический полиморфизму больных гипертонической болезнью в квартилях скорости Na+-Ы+-противотранспорта в мембране эритроцита
• Предикторы эффективности антигипертензивной терапии

Введение к работе

Актуальность проблемы

Гипертоническая болезнь относится к числу наиболее часто встречающихся и опасных своими осложнениями заболеваний сердечно-сосудистой системы. Распространенность ГБ в России составляет 37,2% среди мужчин и 40,1% среди женщин, но только 21,5% из них получают эффективное лечение (Шальнова С.А. с соавт., 2006). Нередко ГБ впервые выявляется при развития таких осложнений как мозговой инсульт и инфаркт миокарда, в 50% случаев являющихся причиной летального исхода (Оганов Р.Г., 2002).

Развитие ГБ обусловлено сложным взаимодействием внутренних (генетических) и внешних (окружающая среда) факторов. Несомненно участие в патогенезе ГБ нервной системы. Еще в 1950 г. Г.Ф.Ланг выдвинул тезис о значении конституциональных особенностей нервной системы, способствующих развитию заболевания. Были получены подтверждения наследственной предрасположенности нарушения баланса ВНС при ГБ (Шляхто Е.В., Конради А.О., 2003). В 1975 году Ю.В.Постновым было открыто генетически детерминированное нарушение структуры и функции мембран клеток как возбудимого, так и невозбудимого типов, составляющее основу развития ГБ. Критерием мембранных нарушений служит большая скорость облегченного переноса ионов через клеточную мембрану – скорость Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита (Canessa M. et al., 1980; Постнов Ю.В., Орлов С.Н., 1987). Однако, как при проведении популяционного исследования, так и в реальной клинической практике оказалось, что ГБ с мембранными нарушениями (т.е. с большими скоростями НЛП в мембране эритроцита) страдает лишь часть больных. При проведении квартильного анализа распределения величин скорости НЛП было обнаружено развитие ГБ при различных величинах НЛП, что фенотипически манифестировало генетическую разнородность ГБ (Ослопов В.Н., 1995).

В 2000 г. были завершены исследования человеческого генома, представившие данные о строении молекул ДНК человека. В результате открылись возможности не только определения ключевых генетических механизмов возникновения ГБ, но и прогнозирования эффективности лекарственной терапии. Считается, что вклад генетических факторов в формирование уровня АД составляет 30-50%, и определение генов, ответственных за развитие ГБ, поможет в понимании патогенетических механизмов развития заболевания и в выборе наиболее эффективной терапии (Mom T., Al Balushi K.A., 2005). На протяжении последних лет во многих странах мира ведется активный поиск генов, которые могли бы участвовать в развитии АГ. К настоящему времени более 150 генов рассматриваются в качестве генов-кандидатов АГ. Исследования, проведенные в разных популяциях, показали ассоциацию полиморфизма М235Т гена агиотензиногена, I/D полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента и ряда генетических маркеров других генов РААС с риском развития ГБ, гипертрофией миокарда левого желудочка, уровнем АД и ответом на лекарственную терапию (Kunz R. et al., 1997; Stavroulakis G.A. et al., 2000; Rankinen T. еt al, 2000; Saeed M. et al., 2005; Baker M. et al., 2007). В том числе обнаружена неодинаковая встречаемость и различие в ассоциации полиморфных маркеров гена ангиотензиногена (Т174М и А-20С полиморфизмы в гене AGТ) с развитием АГ и эффектом лечения у представителей двух этнических групп Республики Татарстан – татар и русских (Андреева М.Г., 2003; Газизова Р.Г., 2007). Известно о влиянии генетического полиморфизма на функциональную активность РААС и развитие сердечно-сосудистых заболеваний (Agerholm-Larsen B. et al., 2000; T. et al., 2011). Высокая активность РААС при АГ, наряду со снижением активности эндотелиальной NO-синтазы, способствует формированию дисфункции эндотелия с последующим развитием апоптоза, ремоделирования сердечно-сосудистой системы, поражения органов-мишеней и кардиоваскулярных осложнений (Беркович О.А. и соавт., 2008; Higashi Y. et al., 2009). Исследовались полиморфные маркеры генов эндотелиальной NO-синтазы NOS3, ₁-адренорецептора ADRB1 и аполипопротеинов у больных АГ и другими заболеваниями сердечно-сосудистой системы (Bengtsson K. et al., 2001; Kang B.Y. et al., 2002; Li X. et al., 2003; Zintzaras E. et al., 2006; Gluba A. et al., 2009). Показана ассоциация полиморфизма гена мембранного АТФ-связывающего кассетного транспортера АВСА1 с риском развития ГБ в японской популяции и связь его экспрессии с уровнем АД и эффектом антигипертензивного лечения (Yamada Y. et al., 2008; Xu M. et al., 2009). Уникальным методом изучения влияния молекулярно-генетических факторов на развитие заболеваний служит сибсовый метод анализа. В целом ряде семейных исследований была показана связь генов, локализованных на 1 и 6 хромосомах, а также полиморфизма в генах РААС с уровнем АД в покое и при нагрузке и с развитием АГ (Jeunemaitre X. et al., 1992; Bennett C.L. et al., 1993; Rankinen T. et al., 2000; Caulfield M., 2003; Arenas I. et al., 2011). Вопрос эффективности антигипертензивной терапии является самым важным с точки зрения цели лечения – снижения риска сердечно-сосудистых осложнений и поражения органов мишеней. По данным исследований ПИФАГОР II и ПИФАГОР III (2004, 2008 г.г.), в России наиболее принимаемые пациентами антигипертензивные препараты относятся к классам ингибиторов АПФ (33,2%), -адреноблокаторов (20,3%), диуретиков (19,7%) и антагонистов кальция (13,4%). Монотерапию получают 26% больных ГБ, комбинацию из 2-х препаратов – 37% пациентов и еще 37% больных получают комбинацию из 3-х препаратов (Леонова М.В. и соавт., 2010). Однако выбор антигипертензивного препарата для конкретного пациента в основном носит эмпирический характер. В крупных многоцентровых исследованиях, таких как ALLHAT и LIFE (Dahlf B. et al., 2002; Weber M.A., 2003), была показана связь эффективности различных классов антигипертензивных препаратов с расовой принадлежностью больных ГБ (Ferdinand K.C., 2003), что указывает на большую значимость генетической составляющей в ответе пациентов на лекарственную терапию, хотя идентифицировать какие-либо генетические маркеры на тот момент не удавалось. В других исследованиях были определены ассоциации полиморфных маркеров большого числа генов с поражением органов-мишеней, степенью снижения АД, частотой побочных эффектов при лечении, в первую очередь, ингибиторами АПФ и -адреноблокаторами (Минушкина Л.О. с соавт., 2005; Ueda S. et al., 1998; Schwartz G.L., Turner S.T., 2004; Mellen P.B., Herrington D.M., 2005). Однако многие из кандидатных генов были изучены недостаточно или оказались недооценены, что, в первую очередь, относится к генам регуляторных систем, в том числе к генам глутаматовой системы и апоптоза (Тимофеева А.В. с соавт., 2007). Вместе с тем, в ряде исследований изучалась роль апоптоза в ремоделировании сердечно-сосудистой системы при ГБ (Шляхто Е.В., Моисеева О.М., 2002; Hamet P. et al., 1995; Vega F. et al., 1999; Hang T. et al., 2007), а в последние годы появились первые данные об участии глутаматовой системы в регуляции АД, уровня ангиотензина II и симпатической активности у крыс со спонтанной АГ, являющихся экспериментальной моделью ГБ человека (Carvalho T.H.F. et al., 2003; Li D.-P., Pan H.-L., 2010).

Таким образом, большой интерес представляет проведение исследования по изучению роли полиморфизма кандидатных генов РААС, липидного обмена, глутаматовой системы и некоторых других генов-регуляторов апоптоза в развитии ГБ, формировании уровня АД, ремоделировании сердечно-сосудистой системы и в эффективности антигипертензивной терапии в ассоциации с функциональным состоянием клеточных мембран и вегетативными показателями гомеостаза.

Цель исследования

Изучение полиморфизма ряда кандидатных генов в ассоциации с функциональным состоянием клеточных мембран и вегетативными показателями гомеостаза у больных гипертонической болезнью и здоровых лиц для выявления генетических маркеров заболевания и прогнозирования эффективности антигипертензивной терапии.

Задачи исследования

1. Провести анализ распределения полиморфных ДНК-локусов генов AGT, ACE, ADRB1, NOS3, EFNB3, APOA5, ABCA1, EAAT, GluR1, GluR2, AIF, HIF-1A, CASP9 и PARP1 у больных гипертонической болезнью и лиц с нормальным АД на основе популяционного и сибсового методов.

2. Провести анализ генетических факторов раннего развития гипертонической болезни.

3. Изучить особенности распределения частот аллелей и генотипов генов AGT, ACE, ADRB1, NOS3, EFNB3, APOA5, ABCA1, EAAT, GluR1, GluR2, AIF, HIF-1A, CASP9 и PARP1 у больных гипертонической болезнью с учетом функционального состояния клеточных мембран.

4. Изучить уровень артериального давления у больных гипертонической болезнью и их здоровых родственников в ассоциации с различными полиморфными маркерами в генах AGT, ACE, ADRB1, NOS3, EFNB3, APOA5, ABCA1, EAAT, GluR1, GluR2, AIF, HIF-1A, CASP9 и PARP1.

5. Изучить особенности ремоделирования миокарда у больных гипертонической болезнью – носителей различных аллелей и генотипов в генах AGT, ACE, ADRB1, NOS3, EFNB3, APOA5, ABCA1, EAAT, GluR1, GluR2, AIF, HIF-1A, CASP9 и PARP1.

6. Выявить ассоциативность вегетативных показателей гомеостаза с генетическими факторами у больных гипертонической болезнью с различными уровнями скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита.

7. Оценить эффективность антигипертензивной терапии ингибитором АПФ эналаприлом, -адреноблокатором метопрололом и антагонистом кальция нифедипином у больных гипертонической болезнью с различной скоростью Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита.

8. Оценить индивидуальную чувствительность к антигипертензивной терапии эналаприлом, метопрололом и нифедипином у больных гипертонической болезнью с различными полиморфными вариантами ДНК-локусов генов AGT, ACE, ADRB1, NOS3, EFNB3, APOA5, ABCA1, EAAT, GluR1, GluR2, AIF, HIF-1A, CASP9 и PARP1.

9. Выработать алгоритм прогнозирования эффективности антигипертензивной терапии с применением многофакторного анализа исследуемых показателей больных гипертонической болезнью.

Научная новизна

Впервые изучены ассоциации полиморфных маркеров генов AGT, ACE, ADRB1, NOS3, EFNB3, APOA5, ABCA1, EAAT, GluR1, GluR2, AIF, HIF-1A, CASP9 и PARP1 с гипертонической болезнью среди лиц, относящихся к татарскому этносу, методами популяционного и сибсового анализа. Установлена ассоциация ГБ с генотипом М235М в гене ангиотензиногена у лиц с семейной отягощенностью по АГ. Впервые показана роль полиморфных маркеров генов мембранного АТФ-связывающего кассетного транспортера типа А1 и нейронального транспортёра глутамата как независимых факторов риска раннего развития ГБ у мужчин и женщин, установлена ассоциация полиморфных вариантов ДНК-локусов в генах нейронального транспортера глутамата и апоптоз-индуцирующего фактора с уровнем артериального давления. Для больных ГБ показано значение C/T полиморфизма гена апоптоз-индуцирующего фактора в развитии ремоделирования миокарда левого желудочка. Впервые установлено влияние полиморфизма в гене ионотропного глутаматового рецептора типа АМРА2 на характер вегетативной регуляции у больных ГБ.

Для больных ГБ установлена ассоциация различных диапазонов скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита и полиморфных ДНК-локусов генов ангиотензиногена, мембранного АТФ-связывающего кассетного транспортера АВСА1, каспазы 9 и белка эфрина В3.

Впервые изучена индивидуальная чувствительность к антигипертензивной терапии нифедипином, эналаприлом и метопрололом у больных ГБ с различной скоростью Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита и установлена бльшая эффективность монотерапии этими препаратами при высокой скорости трансмембранного ионотранспорта. Установлена ассоциация индивидуальной чувствительности к антигипертензивной терапии с полиморфными маркерами в генах ACE, GluR2, EFNВ3, CASP9 и HIF-1A. Впервые показана связь антигипертензивного эффекта нифедипина у больных ГБ с I/D полиморфизмом в гене ангиотензинпревращающего фермента.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в ходе проведенных исследований результаты свидетельствуют о генетической детерминированности раннего развития ГБ и поражения органов-мишеней. Определены генетические факторы, ассоциированные с ГБ у лиц с семейной отягощенностью по АГ, различным уровнем АД и ремоделированием миокарда левого желудочка, что позволяет прогнозировать развитие заболевания и применять дифференцированный подход к формированию групп диспансерного наблюдения и проведению мероприятий по сдерживанию развития ГБ и ранней профилактике поражения органов-мишеней.

Показана значимость определения мембранных характеристик эритроцитов и молекулярно-генетического анализа для прогнозирования эффективности антигипертензивной терапии нифедипином, эналаприлом и метопрололом у больных ГБ. Установлены мембранные и молекулярно-генетические критерии индивидуальной чувствительности к каждому из этих препаратов, которые могут применяться при выборе медикаментозной терапии больных ГБ.

Разработан алгоритм прогнозирования эффективности антигипертензивной терапии нифедипином, эналаприлом и метопрололом, позволяющий индивидуализировать медикаментозное лечение больных ГБ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гипертоническая болезнь среди лиц с семейной отягощенностью по ГБ, относящихся к татарскому этносу, ассоциирована с генотипом М235М в гене AGT.

2. Независимыми генетическими факторами риска раннего развития гипертонической болезни являются генотипы R2197R в гене АBCA1 и A603A в гене EAAT2.

3. Уровень артериального давления у лиц с семейной отягощенностью по АГ ассоциирован с G603A полиморфизмом в гене EAAT2 и C/T (rs189994) полиморфизмом в гене AIF.

4. Масса миокарда левого желудочка у больных гипертонической болезнью ассоциирована с C/T (rs189994) полиморфизмом в гене AIF.

5. Вегетативные показатели гомеостаза у больных гипертонической болезнью, определяемые методом спектрального анализа вариабельности ритма сердца, ассоциированы с C/T (rs9307959) полиморфизмом в гене GluR2.

6. Повышение индивидуальной эффективности антигипертензивной терапии нифедипином, эналаприлом и метопрололом достигается использованием комплексной оценки данных молекулярно-генетического анализа и мембранных характеристик больных гипертонической болезнью.

Апробация работы

Основные положения и материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании научного общества кардиологов Республики Татарстан (Казань, 2006 г.), на Российских национальных конгрессах кардиологов (Москва, 2006 г., 2008 г., 2010г.), на I-й Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2008 г.), на международной конференции LIPGEN 2011 «От скальпеля к геному и липидому» (Казань, 2011 г.).

Внедрение результатов диссертационной работы в практику

Предложенные критерии выявления предрасположенности к раннему развитию ГБ, а также индивидуальной чувствительности и прогнозирования эффективности антигипертензивной терапии нифедипином, эналаприлом и метопрололом внедрены в МУЗ «Клиническая больница №2» (г.Казань), МУЗ «Городская клиническая больница №9» (г.Казань), МУЗ «Городская больница №11» (г.Казань), Межрегиональном клинико-диагностическом центре (г.Казань) и в учебный процесс на кафедрах пропедевтики внутренних болезней и факультетской терапии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 35 научных работ, из них 14 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований и обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (388 наименования, из них 98 отечественных и 290 зарубежных источников). Работа проиллюстрирована 35 таблицами и 42 рисунками.

Личное участие диссертанта в получении научных результатов, изложенных в работе

Личное участие автора выразилось в определении идеи исследования, постановке целей и задач исследования, отборе больных гипертонической болезнью, анализе и обобщении литературных данных и результатов собственных исследований, их статистической обработке, разработке алгоритма прогнозирования эффективности антигипертензивной терапии нифедипином, эналаприлом и метопрололом.

Мембранная концепция гипертонической болезни

Согласно разработанной Ю.В.Постновым мембранной теории, в основе развития ГБ лежат распространенные (т.е. не ограниченные одним типом клеток) нарушения структуры и ионтранспортирующих механизмов плазма-тической мембраны клетки в отношении Na и Са [69]. По мнению В.А.Алмазова (1992), мембранная концепция раскрывает механизмы наследственной предрасположенности к ГБ [4]. Мембранные нарушения являются генетически детерминированными и обусловлены экспрессией протоонкоге-нов клеточного генома. В результате рс ходит_ніщргіление_избьіточного количества свободного цитоплазматического кальция в клетке. При исследовании эритроцитов [59, 66], синаптосом [36], адипоцитов [64, 65], гепатоци-тов больных ГБ и крыс со спонтанной гипертензией (SHR) линии Окамото-Аоки (экспериментальная модель эссенциальной гипертонии человека) выявлен дефект связывания кальция плазматическими мембранами клеток [167]. Эти изменения рассматриваются как проявление распространенных мембранных нарушений транспорта ионов при ГБ [69].

Увеличение концентрации свободного цитоплазматического Са , в частности, приводит к снижению обратной аккумуляции норадреналина в си 21 наптических нервных окончаниях, что усиливает действие нейромедиаторов на адренорецепторы постсинаптической мембраны и увеличивает реактивность сосудов, повышает сосудистый тонус [66, 69]. Этому, по-видимому, также способствует выявленная при ГБ исходная частичная деполяризация плазматической мембраны, которая объясняется повышением ее проницаемости для ионов натрия [38]. Кроме того, в сердце крыс SHR были выявлены структурные изменения межнейрональных синаптических связей, не обнаруженные у контрольной линии. В шейно-грудных ганглиях яркие различия между гипертензивными и контрольными крысами наблюдались уже в зрелом возрасте животных и проявились в гипертрофии тел нейронов, свидетельствующей о повышенной нагрузке в работе симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы в связи с наличием мембранных нарушений в самой нервной системе и иннервируемых ею тканях. Повышенная нагрузка на отделы вегетативной нервной системы приводит к их преждевременному истощению и явлениям резкого снижения депонирующей функции адренергических сплетений сердца [94].

В 1993 году Ю.В.Постнов представил новую трактовку своей теории и обозначил ГБ как естественное качество сложившегося в условиях мембранного «дефекта» равновесия между двумя системами регуляции водно-солевого гомеостаза - плазматической мембраной клетки и почкой [70]. Сохранность специфических функций_ 1е о удимю леток,__имеющих--мем— бранные нарушения, наравне с возбудимыми клетками, обеспечивается механизмом клеточной адаптации, названным «клеточным ресетингом». Развитие этого переключения клетки инициирует изменение гормонально-нейро-клеточных отношений, проявляющихся усилением кортикостероидной секреции, гиперинсулинемией и активированием симпатической нервной системы. Нормальный физиологический ответ «переключенной» клетки на действие катехоламинов достигается при более сильном, чем в норме адренергиче-ском влиянии. Активирование периферического звена симпатического отдела вегетативной нервной системы, обусловленное влиянием «изнутри», т.е. с уровня клеточной мишени, стремясь обеспечить нормальное функционирование «переключенной» клетки, как бы «непроизвольно» приводит к повышению АД. Повышение АД заставляет работать в режиме «переключения» и почку, т.к. только это позволяет сохранить нормальный объем экскреции воды и солей при высоком АД (вопреки «диурезу давления»). Переключение почки происходит параллельно с изменением взаимоотношений этого органа с нервной и эндокринной системами. «Переключенная» почка активирует по принципу обратной связи системы регуляции АД и поддерживает необходимый ей повышенный уровень АД для нового уровня своей работы.

Существует несколько основных путей транспорта ионов натрия через клеточную мембрану. Активный транспорт (движение ионов против электрохимического градиента), за счет работы Ыа+-К+-АТФ-азы, производит 80-90% общего переноса одновалентных катионов через плазматическую мембрану. При ингибировании в эксперименте Ыа+-К+-АТФазы уабаином, движение ионов осуществляется при помощи так называемой облегченной диффузии -Ыа+/т\[а+-противотранспорт, Ыа+-К+-котранспорт, анионный переносчик и пассивной диффузии, под которой понимают процесс проникновения ионов через липидный бислой мембраны либо через области белок-липидного контакта.

Определение функционального состояния клеточных мембран

Функциональное состояние клеточных мембран оценивали по максимальной скорости Na -Іл+-противотранспорта в мембране эритроцита по методу М. Canessa(1980). Определение скорости НЛП заключается в измерении обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации. Для этого Na+ замещали в эритроцитах на Li+ путем прединкубации (в течение 3-х часов) в среде, содержащей изоосмотическую концентрацию LiCl при блокированой уабаином Ыа+-К+-АТФазе. О скорости Na+-Li+ -обмена судили по разности выхода Li+ (через 60 минут инкубации) в среду, содержащую изоосмотическую концентрацию NaCl, и среду, содержащую изоосмотическую смесь MgCb и сахарозы. Кинетику выхода из клеток лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектро-фотометрии в эмиссионном режиме.

Ход определения: 3 мл гепаринизированной венозной крови забирали в пластиковые пробирки и немедленно помещали в контейнер с тающим льдом. Эритроциты осаждали путем центрифугирования при 3000 g в течение 5 минут при 0-2 С. Плазму и лейкоциты удаляли путем отсасывания. Эритроциты дважды промывали при температуре тающего льда средой А (среда промывки) следующего состава (мМ): 75 - MgCl2, 85 - сахароза, 10 -глюкоза, 10 - HEPES-трис (рН 7,4) при тех же условиях осаждения. Нагрузку эритроцитов литием производили помещением 0,25 мл упакованных эритроцитов в 1,25 мл среды Г следующего состава (мМ): 150 - LiCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис (рН 7,4) при 37С и прединкубировали 3 часа при той же температуре с периодическим встряхиванием (автоматически каждые 15 минут по 15 секунд). После этого суспензию осаждали и эритроциты промывали (для удаления наружного лития) 4 раза 4-х кратным объемом среды А при 0-2 С. Далее отмытые, упакованные эритроциты (по 0,1 мл) переносили в среду Б (1 мл) и в среду В (1 мл) на 60 минут при температуре 37 G с периодическим встряхиванием. Среда Б это фактически среда А, содержащая изоосмотическую смесь MgCl2 и сахарозы, но с добавлением 0,1 мМ уабаина. Среда В богата Na и содержит (мМ) 150 - NaCl, 10 - глюкозы, 10 - HEPES-трис (рН 7,4), 0,1 - уабаина. На 60-й минуте инкубации отбирали 0,45 мл суспензии эритроцитов из обеих сред, центрифугировали при 3000 g в тече 42 ниє 2 минут, а затем надосадочную жидкость (супернатант) в количестве 0,3 мл осторожно отбирали и разбавляли в 3 раза тридистиллированной водой. Измерение содержания лития в средах Б и В проводили методом атомной абсорбционной спектроскопии в режиме эмиссии на спектрофотометре СА-455 (ПО КОМЗ, г.Казань) в лаборатории спектрофотометрии на кафедре медицинской и биологической физики Казанского государственного медицинского университета (зав. кафедрой - член-корреспондент РАН, профессор Е.Е. Никольский). Использовались параметры аппаратуры: длина волны 670,6 нм, состав пламени: ацетилен-воздух, стехиометрия пламени - окисляющая, чув-ствительность 1x10" моль. Программа измерения концентрации элемента в исследуемом растворе состояла в сравнении интенсивности светового потока эталонного раствора известной концентрации с интенсивностью потока исследуемого раствора.

Максимальная скорость Na+-Li+ - противотранспорта (V) в мкмоль Li на 1 литр клеток (эритроцитов) в час определялась как разность между концентрациями лития в среде, богатой натрием (ANa), и в среде, свободной от натрия (AMg), через 60 минут инкубации по формуле: V = (ANa - AMg) х k , где к (коэффициент) = 33 Все растворы готовили на тридистиллированной воде, калибровочные растворы готовили на средах инкубации с учетом разведения пробы. Были использованы рефрижераторная центрифуга и лабораторный комплекс «Labsystems» (Финляндия), реактивы фирм «Serva», «Sigma, «BDH».

Генетический полиморфизму больных гипертонической болезнью в квартилях скорости Na+-Ы+-противотранспорта в мембране эритроцита

В соответствии с индивидуальной величиной скорости НЛП в мембране эритроцита больные ГБ были распределены по 4 квартилям скорости Na+-Li+-противотранспорта. В I квартиль (скорость НЛП до 203 мкмоль Li/л кл. в час) вошли 28 больных, во II квартиль (скорость НЛП 204-271 мкмоль Li/л кл. в час) - 39 больных, в III квартиль (скорость НЛП 272-345 мкмоль Li/л кл. в час) - 36 больных и в IV квартиль (скорость НЛП более 345 мкмоль Li/л кл. в час) - 47 пациентов.

Сравнение распределения частот аллелей и генотипов среди больных ГБ, относящихся к различным квартилям скорости НЛП (табл. 5-8), выявило наличие достоверных ассоциаций некоторых генотипов с диапазонами скорости НЛП. Так, частота генотипа R2197R в гене АВСА1 у больных I квартиля была вдвое ниже, чем во II квартиле (0,42 и 0,81 соответственно, р 0,05, ОР=0,16, ДИ=0,07-0,46), а генотипа R2197K в IV квартиле более чем втрое выше, чем у больных II квартиля (0,46 и 0,13 соответственно, р 0,05, ОР=4,0, ДИ=1,43-10,2). Кроме того, выявилась тенденция к отличию частоты встречаемости генотипа AG в гене CASP9 во II и IV квартилях, но не достигшая уровня высокой достоверности (р=0,056). Интересным оказалось различие между больными ГБ II и III квартилей по A/G rs7141 полиморфизму в гене EFNB3. Так, частота генотипа GG была выше в III квартиле (0,39 и 0,06, р 0,05, ОР=11,8, ДИ=3,6-25,9), а генотипа AG - во II квартиле (0,75 и 0,33, р=0,02, ОР=5,8, ДИ=2,1-14,7). У больных в III квартиле частота генотипа АА rs 1052576 в гене CASP9 была выше, чем в IV квартиле (р-0,023, ОР=28,3 при ДИ=10,6-75,2) (табл. 9).

Обращает внимание сложившийся «набор» генов, продемонстрировавших межквартильные отличия распределения полиморфных маркеров у больных ГБ. Это и гены, белковые продукты которых осуществляют свою функцию в структуре клеточной мембраны, как ген АТФ-связывающего мембранного кассетного транспортера холестерина АВСА1, так и гены-регуляторы апоптоза - ген мембранного лиганда рецептора тирозинкиназы EFNB3 и ген CASP9, кодирующий фермент каспазу 9, играющий роль медиатора митохондриального пути апоптозного сигналинга в клетке.

В исследование было включено 74 больных ГБ (группа пробандов) и 75 их родственников (группа сибсов), среди которых 9 человек страдали ГБ. Всех обследованных из состава сибсовых пар можно рассматривать как лиц с семейной, т.е. наследственной, отягощенностью по ГБ. В первую очередь было оценено возможное сцепление между изучавшимися генами и ГБ (тест STDT). Непараметрический тест на неравновесие по сцеплению основан на совместном анализе распределения в сибсовых парах аллелей исследуемых генов и соответствующих фенотипов (наличие или отсутствие ГБ). Проведенный анализ выявил статистически значимое сцепление генотипа М235М в гене AGT с ГБ (р=0,045) (табл. 10). Сравнение частот аллельных вариантов полиморфных локусов у пробандов - больных ГБ и у здоровых сибсов показал большую частоту встречаемости генотипа М235М гена AGT среди больных ГБ (0,23 и 0,09 соответственно, р=0,045, ОР=2,43, ДИ=1,07-5,51) (табл. 11).

Далее был проведен корреляционный анализ (Gamma-корреляция), позволяющий оценить вклад каждого из кандидатных генов в развитие ГБ. Были определены достоверные корреляции М235Т полиморфизма гена AGT (у=0,28, р=0,009), G603A полиморфизма гена ЕААТ2 (у=-0,26, р=0,008), G/A rs545098 полиморфизма гена GluRl(y=-0,35, р=0,01) и IVS9-675 С А полиморфизма гена HIF-1A (у=-0,29, р=0,01) с наличием ГБ среди обследованных лиц.

Таким образом, в результате анализа тремя методами - STDT тестом, корреляционным анализом и сравнением распределения частот генотипов кандидатных генов среди пробандов и сибсов, не страдающих ГБ, выявлена связь заболевания с носительством генотипа М235М в гене AGT, повышающим риск развития ГБ более чем в 2 раза.

Корреляция полиморфизмов в генах нейронального транспортера глута-мата (ЕААТ2) и индуцируемого гипоксией фактора (HIF-1A) с развитием ГБ может отражать участие глутаматовой системы и звеньев апоптоза в регуляции АД и формировании ГБ.

Предикторы эффективности антигипертензивной терапии

Подбор антигипертензивной терапии у больных ГБ, как правило, проходит через несколько этапов. Учитывается исходный уровень АД,- наличие модифицируемых и немодифицируемых факторов риска, поражение органов-мишеней и ассоциированных клинических состояний. При отсутствии эффекта или недостаточном снижении АД при монотерапии (если монотерапия допустима) больные ГБ переводятся на комбинированную терапию двумя или более гипотензивными препаратами [23]. Эффективность антигипертензивной терапии во многом обусловлена индивидуальной чувствительностью пациентов к назначенным антигипертензивным лекарственным препаратам. На индивидуальную эффективность лечения оказывают влияние целый ряд физиологических факторов и генетически обусловленные особенности функционирования систем регуляции АД. Важнейшей задачей современной кардиологии является определение генетических факторов индивидуальной чувствительности к различным классам антигипертензивных препаратов [50, 85]. Ее решение позволит сократить период подбора терапии и обеспечить максимальное снижение риска развития сердечно-сосудистых осложнений и смерти больных ГБ.

Полученные нами данные свидетельствуют о практически равной эффективности применявшихся в качестве монотерапии гипотензивных препаратов, что полностью согласуется с результатами проведенных популяцион-ных исследований и метаанализов, посвященных антигипертензивной терапии [153, 248, 262]. Уровня АД 140/90 мм рт. ст. удалось добиться у 51% больных ГБ, получавших нифедипин, у 52% больных ГБ, лечившихся энала-прилом, и у 58%) больных, получавших метопролол, в целом - у 53%) больных ГБ. Снижение САД оказалось более выраженным у мужчин, чем у женщин. У 16%) больных ГБ снижение САД и у 24% снижение ДАД не достигло величин 140/90 мм рт. ст. Обращает внимание, что у этих пациентов значительное снижение АД через 1 месяц антигипертензивного лечения наблюдалось на фоне наибольшего исходного среднего САД и ДАД. Данная закономерность прослеживалась и в каждой отдельно взятой группе больных ГБ, находившихся на соответствующей гипотензивной терапии, что, вероятно, послужило у них причиной недостаточной эффективности монотерапии. Вместе с тем, у ряда пациентов снижения АД не наблюдалось, хотя исходный уровень среднего САД и среднего ДАД не отличался от больных ГБ, достигших целевого АД. Таким образом, закономерно предположить наличие у данной группы пациентов каких-либо индивидуальных особенностей чувствительности к проводимой гипотензивной терапии.

Проведенный анализ частоты встречаемости изучавшихся аллелей и генотипов в группах больных ГБ с различным ответом на антигипертензивное лечение показал наличие существенных особенностей. Так, среди резистентных к монотерапии больных наблюдалась достоверно большая частота генотипа ID в гене АСЕ и меньшая частота генотипа СТ в гене GluR2 и аллеля G в гене EFNB3. Кроме того, выявлены различия в частоте полиморфных маркеров генов [3-адренорецептора ADRB1 и каспазы 9 CASP9. При сравнении всех больных ГБ со снижением АД с больными, резистентными к терапии, выявлена большая частота генотипов II в гене АСЕ и RK в гене АВСА1 у больных ГБ со снижением САД и большая частота генотипов ID в гене АСЕ и GG в гене ЕААТ2 у больных, не продемонстрировавших снижения САД через 1 месяц антигипертензивной терапии. В группе больных со снижением ДАД, в сравнении с больными без снижения ДАД, наблюдалась большая частота генотипа СТ в гене GluR2 и меньшая частота генотипов ID в гене АСЕ и GA в гене CASP9. Характерной общей закономерностью явилась ассоциация генотипа ID в гене АСЕ с отсутствием снижения САД и ДАД у больных ГБ на фоне проводившейся антигипертензивной терапии. Существенный интерес представляют результаты анализа снижения САД у носителей полиморфных маркеров гена АВСА1. Достоверно меньшая величина среднего снижения САД выявлена у гомозигот по аллелю R2197 в гене АВСА1 по сравнению с носителями аллеля 2197К (гетерозиготами и монозиготами по аллелю 2197К). Таким образом, генотип R2197R в гене АВСА1 ассоциирован с худшей эффективностью гипотензивной терапии в отношении САД. Полученные данные свидетельствуют о заинтересованности полиморфизмов генов ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), (3-адренорецептора (ADRB1), АТФ-связывающего транспортера холестерина (АВСА1), каспазы 9 (CASP9), белка эфрина ВЗ (EFNB3), субъединицы GluR2 ионотропного рецептора глутамата (АМРА2) и нейронального транспортёра глутамата (ЕААТ2) в механизмах регуляции АД и ответа на антигипертен-зивную терапию.

В группе больных ГБ, получавших нифедипин и достигших уровня АД 140/90 мм рт. ст., наблюдалась достоверно большая частота аллеля D в гене АСЕ, а у пациентов без снижения ДАД была большая частота генотипа ID гена АСЕ по сравнению с больными ГБ, достигшими ДАД 90 мм рт. ст., и больными ГБ со снижением ДАД, не достигшим величин 90 мм рт. ст. Кроме того, среди больных с разным ответом на лечение были выявлены различия в частоте встречаемости полиморфных маркеров генов EFNB3 и GluR2. При дальнейшем изучении величины среднего снижения АД на фоне терапии было установлено большее и достоверное снижение САД и ДАД у носителей генотипов DD и II в гене АСЕ, ТС в гене GluR2, GG в гене EFNB3 и АА в гене CASP9. В группе больных ГБ со снижением САД, не достигшим значений 140 мм рт. ст, на антигипертензивной терапии эналаприлом наблюдалась достоверно большая частота аллеля С в гене AIF, чем у больных без снижения САД, а среди пациентов без снижения ДАД определялась большая частота генотипа ТТ в гене GluR2 по сравнению с остальными больными данной группы. Наибольшее снижение САД и ДАД на фоне лечения эналаприлом было выявлено у носителей генотипов II в гене АСЕ, ТС в гене GluR2, СС в гене HIF-1A и АА в гене CASP9. Весьма примечательным является достоверное снижение САД также у носителей генотипа GG в гене CASP9 и противоположное действие проводившейся терапии в отношении ДАД, проявившееся в его достоверном повышении через 1 месяц лечения у немногочисленных носителей генотипа ТТ в гене GluR2 (п=5), ассоциированного с более высоким тонусом ВНС. В группе больных ГБ, получавших монотерапию метопрололом, не было выявлено различий в частоте аллелей и генотипов изучавшихся генов среди пациентов с различным «ответом» на лечение. Анализ величины среднего снижения АД позволил определить как общие с другими группами лечения закономерности, так и определенные отличия.

Похожие диссертации на Генетические аспекты гипертонической болезни и подходов к антигипертензивной терапии

Дифференцированный подход к респираторной терапии больных хронической обструктивной болезнью легких в сочетании синдромом обструктивного апноэ сна и ночной гипоксемиейПридаткина Наталия Григорьевна

Особенности сосудистой реактивности, гормональных и метаболических реакций в семьях пробандов с ишемической болезнью сердца и артериальной гипертонией. Подходы к дифференцированной терапииЛифшиц Галина Израилевна

Конституциональный подход к выбору терапии у мужчин с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с HELICOBACTER PYLORIГрищенко, Елена Георгиевна

Многофакторный подход к достижению оптимальной терапии после хирургического лечения ишемической болезни сердцаБенделиани, Нана Георгиевна

Современные подходы к диагностике и терапии легочной гипертензии у младенцев с бронхолегочной дисплазией в аспекте профилактики легочного сердцаЗайцева, Наталья Олеговна

Клинико-экономические аспекты антигипертензивной терапии гипертонической болезни [Электронный ресурс]Серов Валерий Анатольевич

Клинико-патогенетические аспекты гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и ее дифференцированная терапияМохаммед Абдулазиз Омер

Хронобиологические аспекты повышения эффективности терапии в клинике внутренних болезнейЗлыднева Марина Алексеевна

Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь: медико-социальные и психовегетативные аспекты выбора поддерживающей терапииТурукин Сергей Васильевич

Фармакогенетические аспекты терапии ингибиторами протонной помпы у больных гастроэзофагеальной рефлюксной болезньюКонекава Элеонора Гильеновна