Гематологические механизмы адаптации к гипоксии и их фармакокоррекция Зюзьков Глеб Николаевич

Содержание к диссертации

Введение 13

Глава 1. Обзор литературы 26

1.1. Гипоксия как типовой патологический процесс. Основные
повреждающие механизмы гипоксии. Постгипоксическая
энцефалопатия 26

1.2. Современные представления о роли гемопоэзиндуцирующего
микроокружения в регуляции кроветворения

при экстремальных воздействиях 34

1.3. Роль центральной нервной системы в регуляции гемопоэза

в норме и при экстремальных воздействиях 49

1.4. Реакции системы крови и механизмы их развития в условиях
кислородной недостаточности различного генеза 63

1.4.1. Особенности формирования гематологических сдвигов

при гипоксии, вызванной введением фенилгидразина 71

1.4.2. Кровопотеря как модель гипоксического воздействия.
Особенности картины крови при гипоксии, вызванной потерей
циркулирующей крови 75

1.5. Основные принципы и перспективы регенерационной терапии
стволовыми клетками (краткое описание) 79

1. Фармакологические свойства оксибутирата натрия 88

2. Заключение 91

Глава 2. Материалы и методы 93

Глава 3. Результаты собственньїхїисследований 122

3.1. Исследование психоневрологического статуса животных

при гипоксии различного генеза и степени тяжести 122

3.2. Реакции системы крови и механизмы их развития при гипоксии
различного генеза 134

- Л -

3.2.1. Механизмы регуляции гемопоэза при гипоксической гипоксии,

не вызывающей повреждение головного мозга 134

1. Картина периферической крови 134

2. Картина костномозгового кроветворения 136

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 138

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 138

5. Пролиферативная активность 138

6. Дифференцировка 138

3.2.1.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах

клеток костного мозга 140

5. Структурно-функциональная организация костного мозга 142

6. Содержание Тпу-1,2⁺-клеток в костном мозге 144

7. Влияние костномозговых ТЬу-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 144

3.2.2. Механизмы регуляции гемопоэза при гипоксической гипоксии,
сопровождающейся развитием энцефалопатии 146

1. Картина периферической крови 146

2. Картина костномозгового кроветворения 147

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 149

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 149

5. Пролиферативная активность 149

6. Дифференцировка 150

3.2.2.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 150

5. Структурно-функциональная организация костного мозга 153

6. Содержание Тпу-1,2⁺-клетокв костном мозге 153

Ъ.2.2.1. Влияние костномозговых Т1гу-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 155

3. 2. 3. Влияние оксибутирата натрия на процессы кроветворения

при гипоксической гипоксии высокой степени тяжести 156

1. Картина периферической крови 156

2. Картина костномозгового кроветворения 156

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 163

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 163

5. Пролиферативная активность 167

6. Дифференцировка 167

3.2.3.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 167

5. Содержание Тпу-1,2⁺-клеток в костном мозге 170

6. Влияние костномозговых Thy-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 173

3.2.4. Влияние пропранолола на формирование гематологических

сдвигов при гипоксической гипоксии высокой степени тяжести 173

1. Картина периферической крови 173

2. Картина костномозгового кроветворения 176

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 180

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 180

5. Пролиферативная активность 180

6. Дифференцировка 180

3.2.4.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 181

3.2.5. Механизмы регуляции гемопоэза при гемолитической анемии,

не вызывающей повреждение головного мозга 182

/

7. Картина периферической крови 182

8. Картина костномозгового кроветворения 184

9. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 184

10. Содержание кроветворных клеток-предшественников 184

11. Пролиферативная активность 184

12. Дифференцировка 185

3.2.5.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах

клеток костного мозга 185

5. Структурно-функциональная организация костного мозга 188

6. Содержание Thy-1,2^-клеток в костном мозге 190

7. Влияние костномозговых Тпу-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 190

3.2.6. Механизмы регуляции гемопоэза при гемолитической анемии,

сопровождающейся развитием энцефалопатии 192

1. Картина периферической крови 192

2. Картина костномозгового кроветворения 194

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 194

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 194

5. Пролиферативная активность 195

6. Дифференцировка 195

3.2.6.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 196

5. Структурно-функциональная организация костного мозга 198

6. Содержание Thy-1,2⁺-клеток в костном мозге 200

7. Влияние костномозговых Thy-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 200

3. 2. 7. Влияние оксибутирата натрия на показатели системы крови при

введении высокой дозы фенилгидразина 201

1. Картина периферической крови 201

2. Картина костномозгового кроветворения 208

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 208

83.2.7.3.1. Содержание кроветворных клеток-предшественников 208

2. Пролиферативная активность 212

3. Дифференцировка 212

3.2.7.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 212

5. Содержание Тпу-1,2⁺-клеток в костном мозге 215

6. Влияние костномозговых Thy-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 218

3. 2. 8. Влияние пропранолола на показатели системы крови при

введении высокой дозы солянокислого фенилгидразина 218

1. Картина периферической крови 218

2. Картина костномозгового кроветворения 221

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 221

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 221

5. Пролиферативная активность 225

6. Дифференцировка 225

3.2.8.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 225

3.2.9. Механизмы регуляции гемопоэза при кровопотере,

не вызывающей повреждение головного мозга 226

7. Картина периферической крови 226

8. Картина костномозгового кроветворения 228

3.2.9.3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 230

9. Содержание кроветворных клеток-предшественников 230

10. Пролиферативная активность 230

11. Дифференцировка 230

3.2.9.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах

клеток костного мозга 232

5. Структурно-функциональная организация костного мозга 234

6. Содержание Thy-1,2 -клеток в костном мозге 236

7. Влияние костномозговых Т1гу-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 236

3.2.10. Механизмы регуляции гемопоэзапри кровопотере, сопровож
дающейся развитием энцефалопатии 238

1. Картина периферической крови 238

2. Картина костномозгового кроветворения 239

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 239

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 239

5. Пролиферативная активность 241

6. Дифференцировка 241

3.2.10.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 243

5. Структурно-функциональная организация костного мозга 244

6. Содержание Тпу-1,2⁺-клеток в костном мозге 245

7. Влияние костномозговых ТТіу-1,2⁺-клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 245

3. 2.11. Влияние оксибутирата натрия на процессы кроветворения

при массивной кровопотере 246

3.2.11.1. Картина периферической крови 246

2. Картина костномозгового кроветворения 253

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 253

1. Содержание кроветворных клеток-предшественников 253

2. Пролиферативная активность 257

3. Дифференцировка 257

3.2.11.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 257

5. Содержание Thy-1,2 -клеток в костном мозге 260

6. Влияние костномозговых Thy-1,2 -клеток

на колониеобразующую способность костного мозга 263

3. 2. 12. Влияние пропранолола на формирование гематологических

сдвигов после массивной кровопотере 263

1. Картина периферической крови 263

2. Картина костномозгового кроветворения 266

3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 267

4. Содержание кроветворных клеток-предшественников 267

5. Пролиферативная активность 267

6. Дифференцировка 267

3.2.12.4. Уровни колониестимулирующей и эритропоэтической
активностей в сыворотке крови и кондиционных средах клеток

костного мозга 271

3.3. Влияние гипоксии различного генеза и степени тяжести на состояние

пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге 272

3.3.1. Влияние гипоксии различного генеза, не вызывающей нарушение психоневрологического статуса, на состояние

пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге 272

3. 3. 2. Влияние гипоксии различного генеза, сопровождающейся развитием энцефалопатии, на состояние

пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге 272

3.4. Влияние гипоксии различного генеза и степени тяжести
на содержание мезенхимальных стволовых клеток
в периферической крови 274

3.4. 1. Влияние гипоксии различного генеза, не вызывающей
нарушение психоневрологического статуса,

на содержание мезенхимальных стволовых клеток

в периферической крови 274

3. 4. 2. Влияние гипоксии различного генеза, сопровождающейся развитием энцефалопатии, на содержание мезенхимальных стволовых клеток

в периферической крови 274

3.5. Влияние гипоксии различного генеза и степени тяжести на
содержание нейральных клеток-предшественников

в головном мозге 275

3. 5. 1. Влияние гипоксии различного генеза, не вызывающей поражение мозговых структур, на содержание

нейральных клеток-предшественников в головном мозге 275

3.5.2. Влияние гипоксии различного генеза,

сопровождающейся поражением мозговых структур,

на содержание нейральных клеток-предшественников

в головном мозге 275

3.6. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
на психоневрологический статус при гипоксии

различного генеза высокой степени и степени тяжести 277

!

3. 6. 1. Влияние гранул оцитарного колониестимулирующего фактора на психоневрологический статус

при гипоксической гипоксии высокой степени тяжести 277

3. 6. 2. Влияние гранул оцитарного колониестимулирующего фактора на психоневрологический статус при гемолитической

анемии высокой степени тяжести 280

3. 6. 3. Влияние гранул оцитарного колониестимулирующего фактора

на психоневрологический статус при кровопотере

высокой степени тяжести 280

3.7. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
на показатели системы крови при гипоксии различного генеза

высокой степени тяжести 282

3. 7. 1. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

на показатели периферической крови 282

3.7.2. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

на показатели костномозгового кроветворения 284

3. 7. 3. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

на содержание кроветворных клеток-предшественников

в костном мозге 286

3.8. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
на состояние пула мезенхимальных стволовых клеток

в костном мозге при гипоксии высокой степени тяжести 286

3.9. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
на содержание мезенхимальных стволовых клеток в периферической

крови при гипоксии высокой степени тяжести 288

3. 10. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

на содержание неиральных клеток-предшественников в головном мозге

при гипоксии высокой степени тяжести 288

3. 11. Исследование влияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на уровень нейросферообразования в культуре клеток

головного мозга in vitro 290

3. 11. 1. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на уровень нейросферообразования в культуре клеток головного

мозга интактных мышей in vitro 290

3. 11. 2. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на уровень нейросферообразования в культуре клеток головного

мозга мышей с постгеморрагической энцефалопатией in vitro 290

Глава 4. Обсуждение собственных результатов 291

Выводы 322

Список литературы 326

Приложение 378-

Введение к работе

Актуальность проблемы. Гипоксия как типовой патологический процесс, сопровождает практически все известные заболевания. Дефицит кислорода, нарушая энергетический обмен, вызывает повреждение, в первую очередь структур ЦНС, определяемое спецификой функционирования ее клеточных элементов. Основной особенностью последних является сочетание высокого уровня метаболической активности, сопряженной с интенсивным потреблением кислорода и большой скоростью обновления фонда макроэр-гических веществ [Girotti A.W., 1985; Рябов Г.А., 1988; Алексеева А.В., Гур-вич А.М., Семченко В.В., 2003; Лукьянова Л.Д., 2002; 2004; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2004]. Угнетение аэробного окисления в тканях головного мозга существенно реорганизует центральную нервную систему, изменяет интегративно-пусковую деятельность нейронов и приводит к формированию качественно нового паттерна взаимодействия отдельных мозговых структур, а в случае декомпенсации механизмов адаптации, запускает цепь патологических процессов, приводящих как к прогрессирующим неврологическим нарушениям (развитию энцефалопатии), так и расстройствам деятельности многих внутренних органов [Неговский В.А., Гурвич A.M., Золотокрылина Е.С., 1987; Krause G.S., White B.C., Aust S.D. e.a., 1988; Неговский B.A., 1991; Мороз B.B., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева А.В., Гурвич А.М., Семченко В.В., 2003]. В то же время при гипоксии мозг сам становится объектом патогенных влияний органной патологии: нарушений гемодинамики, иммунного статуса, гемостаза и пр. [Неговский В.А., 1991; Negovsky V., 1995; Шевченко Ю.Л., 2000; Мороз В.В., 2002; Алексеева А.В., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании го-меостаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при экстремальных воздействиях [Гольдберг Е.Д., 1992; Hasan M.M., 1996; Ястребов А.П., 1999]. С другой стороны, согласно имеющимся представлениям регуляция кроветворения осуществляется тесным взаимодействием локальных и дистантных контролирующих механизмов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999; Юшков Б.Г., Климин В.Г., Северин М.В., 1999; Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002]. При этом координирующая функция в развитии ответа гемопоэтической ткани на воздействия неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды принадлежит именно центральному (нейроэндокринному) звену регуляции [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Провалова Н.В. и др., 2004].

Вместе с тем до настоящего времени во многом остается не изучена роль как локальных, так и дальноранговых механизмов регуляции гемопоэза в формировании гематологических сдвигов при гипоксии различного генеза и степени тяжести. В частности, не существует данных о секреторной активности отдельных компонентов ГИМ при гипоксии, а также о роли межклеточной кооперации различных элементов микроокружения с кроветворными прекурсорами. К настоящему времени не решены многие вопросы, связанные со значимостью различных гуморальных факторов сыворотки крови в регуляции гемопоэза при гипоксических состояниях. Остается абсолютно не исследованным влияние энцефалопатии на формирование реакций системы крови при окислительной недостаточности, хотя считается доказанным важное значение нарушения деятельности ЦНС в развитии постреанимационной патологии других органов и систем, обеспечивающих постоянство внутренней среды [Krause G.S., White B.C., Aust S.D. e.a., 1988; Неговский B.A., 1991; Мороз B.B., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева А.В., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003; Лукьянова Л.Д., 2004].

Развитие биомедицинской науки в области клеточных технологий в XX веке привело к обнаружению в костном мозге не только кроветворных полипотентных клеток [Maximow А.А., 1924; Хлопин Н.Г., 1927; Till J.E., McCulIough E.A., 1961; Чертков И.Л., Гуревич О.А., 1984], являющихся родоначальниками всех элементов крови, но и истинных (мезенхимальных) стволовых клеток [Friendenstein A.J., 1973; Owen М., Friedenstein A.J., 1988; Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G., 1999; Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000; Reading L., Still K., Bishop N. e.a., 2000], обладающих уникальной способностью к самоподдержанию, а в случае необходимости к миграции и хомингу в отдаленные органы и дифференцировке во многие специализированные клеточные типы. При этом назначением данных элементов является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток либо их гибель, вызванную повреждающим фактором [Holtzer Н., 1978; Kuznetsov S.A., Friendenstein A.J., Robey P.G., 1997; Сухих Г.Т., Малайцев В.В., 2001; 2002]. В то же время на сегодняшний день не вызывает сомнения факт существования стволовых клеток в головном мозге взрослого организма [Gussoni Е., Soneoka Y., Strickland CD. e.a., 1999; Александрова M.A., Полтавцева P.А., Марей М.В. и др., 2001; Gritti A., Luca Bonfanti, Doetsch F. e.a., 2002; Сосунов A.A., Челышев Ю.А., 2002], во многом, по современным представлениям, обеспечивающих пластичность ЦНС при различного рода повреждающих воздействиях [Lindval О., 1991; Kondziolka D., Wechler L., Goldstein S. e.a., 2000; Сухих Г.Т., Малайцев B.B., 2001; Степанов Г.А., Карпенко Д.О., Александрова М.А. и др., 2003; Корочкин Л.И., Ревищин А.В., Охотин В.Е., 2005].

Тем не менее, в мировой литературе не существует данных об участии компенсаторно-приспосабительных механизмов «глубокого резерва» -мезенхимальных стволовых клеток - в развитии ответа гемопоэтической ткани на гипоксию, а также в восстановлении нарушений функций ЦНС, вызванных дефицитом кислорода.

Вместе с тем полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток- предшественников организма открыли возможность развития нового направления в лечении многих заболеваний с помощью стволовых клеток [Ema Н., Takano H., Sudo К., Nacauchi К, 2000; Cossu G., Mavilio F., 2000; Horwitz E.M., Prockoo DJ., Gordon P.L., 2001; in t'Anker P.S., Noort W.A., Kruisselbrmk A.B., 2002]. Однако отсутствие надежных клеточных технологий на сегодняшний день делает введение в организм недифференцированных и низко-очищенных клеточных элементов далеко не безопасным делом [Damjanov I., 1993; Almqvist P.M., 2002; Pallera A.M., Schwartzberg L.S., 2004; Serakinci N., 2004; Uchida K., 2004]. В то же время, существует другая стратегия клеточной терапии, основанная на возможности мобилизации эндогенных стволовых клеток с помощью фармакологических агентов [Yano Т., Katayama Y., Sunami К., Deguchi S. е.а., 1997; Scagni P., Saracco P., Timeus F., 1998], одним из которых, по мнению ряда исследователей, может выступать гранулоци-тарный колониестимулирующий фактор [Haas R., Murea S., 1996; Norol F., Bonin P., Charpentier F., 1998; Kavvada H., Sasao Т., Yonekura S., Hotta Т., 1998; Orlic D., Kajstura J.,Chiraenti S e.a..,2001].

Гипоксическое поражение головного мозга и, как следствие, развитие энцефалопатии в постреанимационном периоде является одним из наиболее опасных и часто встречаемых осложнений в реаниматологической практике [Мороз В.В., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева А.В., Гур-вич А.М., Семченко В.В., 2003]. Тем не менее, несмотря на имеющийся для лечения данной патологии широкий арсенал медикаментозных средств с разнонаправленными механизмами действия, зачастую все же не удается добиться не только «полного» излечения пациентов, перенесших критическое состояние, но и достичь даже частичного восстановления утерянных функций. При этом к настоящему времени не предпринималась попытка фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификации функциональной активности эндогенных стволовых клеток.

В связи с вышеизложенным весьма актуальным является исследование механизмов регуляции и дизадаптации системы крови при кислородной недостаточности. Кроме того, несомненный интерес представляет поиск новых патогенетически обоснованных методов фармакологической коррекции нарушений кроветворения при гипоксии, а также способов терапии болезней реанимированного организма, в том числе, энцефалопатии, основанных на изменении пролиферативно-дифференцировочного баланса стволовых клеток in situ, детерминировании их миграционных свойств и включении определенной заданной программы дифференцировки.

Цель исследования: изучить механизмы регуляции и дизадаптации системы крови при кислородной недостаточности различного генеза. Разработать патогенетически обоснованные методы фармакологической коррекции гематологических нарушений при гипоксии.

Задачи исследования:

Выявить закономерности развития изменений показателей периферической крови, костномозгового кроветворения и структурно-функциональной организации костного мозга при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере различных степеней тяжести.

Оценить процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных прекурсоров при различного рода гипоксических воздействиях.

Изучить роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности различного генеза и степени тяжести.

Выявить изменения гемопоэза, сопутствующие развитию энцефалопатии при гипоксии различной этиологии, и показать возможность их фармакологической коррекции.

Вскрыть роль адренергических механизмов регуляции кроветворения при гипоксических воздействиях высокой степени тяжести.

Исследовать состояние пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и их содерлсание в периферической крови при гипоксическои гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере разных степеней тяжести.

Изучить динамику содержания нейральных клеток-предшественников в головном мозге при кислородной недостаточности различного генеза.

Исследовать влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на психоневрологический статус, содержание мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и периферической крови, а также на содерлсание нейральных клеток-предшественников в головном мозге при кислородной недостаточности высокой степени тяжести.

Положения, выносимые на защиту:

В основе адаптивного ответа кроветворной ткани на гипоксию различного генеза, заключающегося в развитии гиперплазии эритроидного, и в меньшей мере грануломоноцитарного ростков миелопоэза, лежит повышение функциональной активности коммитированных клеток-предшественников, являющееся следствием миграции Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперации со стромальными элементами, повышение фидерной активности клеточных компонентов гемопоэзиндуци-рующего микроокружения, образование de novo гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, и увеличение содержания гемопоэти-чески активных субстанций в сыворотке крови.

Существенную роль в формировании суммарной эритропоэтиче-ской активности сыворотки крови in vivo при кислородной недостаточности, помимо эритропоэтина, играют иные гуморальные факторы. При этом возрастание эритропоэтической активности сыворотки крови на фоне отсутст- вия выраженных изменений концентрации в ней эритропоэтина по срокам совпадает с увеличением уровня гемолиза.

Развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях сопровождается дизадаптациеи кроветворной ткани, проявляющейся в снижении уровня гиперплазии костномозгового эритропоэза, падении содержания ком-митированных клеток-предшественников и повышении продукции патологических форм эритроцитов. При этом указанные нарушения эритропоэза развиваются несмотря на увеличение количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, возрастание фидерных свойств Т-клеток-регуляторов в отношении кроветворных прекурсоров во взаимодействии их с адгезирую-щими компонентами ГИМ и повышение функциональной активности прилипающих элементов костного мозга. Осуществление фармакологической «защиты» мозга при гипоксии высокой степени тяжести с помощью оксибути-рата натрия предотвращает развитие дизадаптации гемопоэтической ткани, практически не влияя на Т-лимфоцитарные механизмы регуляции кроветворения.

Негативное влияние гипоксического повреждения ЦНС на кроветворение реализуется через изменение активности симпатоадреналовой системы организма. Введение неселективного антагониста бета-адренорецепторов (пропранолола) после воздействия повышает содержание клеток-предшественников эритропоэза в костном мозге, нивелирует снижение уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения, увеличивает количество эритроцитов в периферической крови и уменьшает продукцию их патологических форм.

Гипоксия, сопровождающаяся развитием энцефалопатии, приводит к ускорению созревания предшественников грануломоноцитопоэза и развитию нейтрофильного лейкоцитоза в результате повышения секреторной функции прилипающих миелокариоцитов, увеличения как прямых, так и опосредованных через взаимодействие с адгезирующими элементами гемо- поэзиндуцирующего микроокружения фидерных свойств Thy-1,2 -клеток в отношении КОЕ-ГМ, повышения продукции гемопоэтически активных факторов неприлипающими компонентами ГИМ и возрастания колониестимули-рующей активности сыворотки крови.

Гипоксические воздействия различного генеза приводят к активации механизмов адаптации «глубокого резерва»: увеличению содержания ме-зенхимальных стволовых клеток в костном мозге и повышению количества регионарных нейральных клеток-предшественников в головном мозге, которые, однако, на фоне отсутствия мобилизации МСК в периферическую кровь оказываются недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге проявляется в развитии энцефалопатии и дизадаптации гемопоэтической ткани.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор обладает выраженным нейропротективным эффектом при гипоксии различного генеза. При этом механизмами специфического действия Г-КСФ являются: стимуляция, мобилизация и миграция мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, сопровождающаяся увеличением содержания нейральных клеток-предшественников в ЦНС, а также активация эритропоэза, способствующая оптимизации газового гомеостаза в организме.

Научная новизна. В работе впервые на современном методическом уровне охарактеризовано состояние системы крови при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере различных степеней тяжести. Выявлена значительная гиперплазия эритроидного, и в меньшей мере грану-ломоноцитарного ростков миелопоэза при кислородной недостаточности разной этиологии, не вызывающей «грубых» нарушений психоневрологического статуса. Показано, что в основе данных изменений во всех случаях лежит повышение функциональной активности коммитированных клеток- предшественников гемопоэза, связанное с миграцией Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперацией со стромальными элементами, увеличением продукции гуморальных регуляторов клеточными компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, стимуляцией образования de novo гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, и возрастанием содержания гемопоэтически активных субстанций в сыворотке крови. При этом на разных моделях гипоксии выявлено несоответствие динамики эритропоэтической активности сыворотки крови с содержанием в ней эритропоэтина. Впервые показана существенная роль гемолиза в формировании in vivo суммарной эритропоэтической активности сыворотки крови при гипоксии.

Впервые выявлена возможность развития дизадаптации гемопоэти-ческой ткани при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и крово-потери высоких степеней тяжести. Обнаружено негативное влияние энцефалопатии различного происхождения на формирование гематологических сдвигов. Установлено, что поражение мозговых структур при гипоксии любой этиологии сопровождается падением содержания коммитированных клеток-предшественников в костном мозге, в первую очередь, прекурсоров эри-тропоэза, снижением уровня гиперплазии эритроидного ростка и продукцией патологических форм эритроцитов, а таюке развитием нейтрофильного лейкоцитоза.

Впервые показано отрицательное влияние адренергических механизмов регуляции кроветворения на гемопоэз при тяжелых гипоксических воздействиях. Выявлено, что чрезмерная активация симпатоадреналовой системы организма, являющаяся следствием гипоксического поражения ЦНС, представляет собой непосредственную причину возникновения нарушений кроветворения при гипоксической и гемической окислительной недостаточности высокой степени тяжести. На разных моделях гипоксии показана возможность коррекции нарушений в системе крови с помощью фармакологи- ческой «зашиты» мозга, предотвращающей развитие энцефалопатии, и при введении неселективного антагониста бета-адренорецепторов после воздействия.

Впервые показано, что при гипоксии различного генеза высокой степени тяжести, сопровождающейся развитием энцефалопатии, происходит нарушение миграции ТЬу-1,2^т-клеток регуляторов-гемопоэза в костный мозг. В то же время при этом наблюдается повышение их фидерных свойств в отношении эритроидных прекурсоров исключительно во взаимодействии с элементами адгезирующей фракции костного мозга, и увеличение как опосредованной, так и прямой их стимулирующей активности в отношении грануло-моноцитарных клеток-предшественников. Установлено, что описанные изменения со стороны Т-клеточных механизмов регуляции гемопоэза при развитии энцефалопатии оказываются связанными непосредственно с тяжестью кислородной недостаточности и не зависят от повреждения структур ЦНС (практически не коррегируются при осуществлении фармакологической «защиты» мозга). Тем не менее, в случаях гипоксической гипоксии и гемолитической анемии высоких степеней тяжести показана возможность непродолжительной активации прямого стимулирующего эффекта Тпу-1,2⁺-клеток в отношении эритроидных прекурсоров с помощью антигипоксанта - оксибу-тирата натрия.

Впервые исследовано состояние пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, их содержание в периферической крови и динамика содержания нейтральных клеток-предшественников в головном мозге при гипоксии различного генеза и степени тяжести. Показано участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности, особенно ее тяжелых формах. Выявлено увеличение количества регионарных стволовых клеток в головном мозге при гипоксии, связанное со стимуляцией непосредственно регионарных нейральных клеток-предшественников в условиях дефицита ки- слорода, и не зависящее от состояния пула костномозговых МСК. Полученные результаты показали, что гипоксические воздействия различной этиологии приводят к активации механизмов «глубокого резерва» (стволовых клеток), которые, однако оказываются недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге, проявляется в развитии энцефалопатии и дизадаптации кроветворной ткани.

Установлена принципиальная возможность фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификатора функциональной активности эндогенных стволовых клеток - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Показан высокий нейропротективный эффект данного цитокина при кислородной недостаточности различного генеза, связанный с мобилизацией мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь, сопровождающийся повышением содержания регионарных нейральных клеток предшественников в ЦНС, а также с активацией эритропоэза, способствующей оптимизации газового гомеостаза в организме.

Практическая значимость. В ходе исследований разработано три новых способа моделирования патологии головного мозга: способ моделирования постгипоксической энцефалопатии, способ моделирования гипоксиче-ской энцефалопатии и способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии (получены 3 патента на изобретение). Кроме того, разработан новый патогенетически обоснованный метод фармакологической коррекции нарушений эритропоэза, возникающих при кислородной недостаточности высокой степени тяжести, способ экспериментальной терапии энцефалопатии и способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии (поданы 3 заявки на изобретение). При этом выявленная нейропро-тективная активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при гипоксии высокой степени тяжести характеризует препарат как эффективный и позволяет рекомендовать проведение клинических испытаний его в качестве средства для лечения и профилактики развития энцефалопатии.

Полученные новые теоретические знания могут быть использованы в педагогическом процессе, а также явиться базой для дальнейшего развития подхода к лечению болезней реанимированного организма, основанного на стимуляции гематологических механизмов адаптации к гипоксии «глубокого резерва» - мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV конференции молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2002), на Ш Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002), на II конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002), на конференции, посвященной 20-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004), на Ш Российском конгрессе по патофизиологии (с международным участием) (Москва, 2004), на IV Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), на Ш конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на региональной конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, из них 18 в центральных журналах, 1 из которых за рубежом; получены 3 патента на изобретения: патент (RU) № 2240604 «Способ моделирования по-стгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови» (опубл. 20.11.2004г., Бюл. № 32), патент (RU) № 2253152 «Способ моделирования гипоксической энцефалопатии» (опубл. 27.05.2005г., Бюл. № 15), патент (RU) № 2257620 «Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии» (опубл. 27.06.2005г., Бюл. № 21); и поданы 3 заявки на изобретения (RU): «Способ экспериментальной терапии энцефалопатии» (заявка № 2004139157, приоритет от 31.12.2004 г.), «Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной гипоксии» (заявка № 2005102549, приоритет от 2.02.2005 г.), «Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии» (заявка № 2005130286, приоритет от 28.09.2005 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 451 страницы машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 99 таблицами. Библиографический указатель включает 552 источника, из них 283 отечественных и 269 иностранных.

Похожие диссертации на Гематологические механизмы адаптации к гипоксии и их фармакокоррекция

Аденогипофиз, щитовидная железа и надпочечники в механизмах адаптации организма к условиям гипоксии высокогорьяКалюжная, Лидия Ивановна

Закономерности и механизмы развития асептического воспаления при стрессе и адаптации к высотной гипоксии (экспериментальное исследование)Белогоров, Сергей борисович

Роль свободнорадикального окисления и индукции белков семейства HSP в защитном эффекте адаптации к гипоксии и гипероксии при физических нагрузкахАнчишкина Наталья Александровна

Динамика нейрофизиологических и вегетативных процессов адаптации организма к гипоксии в различных экологических условияхБашкиров, Александр Алексеевич

Изменение состояния фагоцитоза при адаптации к острой гипоксии в условиях измененной газовой среды и охлажденияКуправа, Марина Владимировна

Перекисное окисление липидов в тканях животных при адаптации к острой гипоксии в условиях измененной газовой среды и охлажденияЛьвов, Сергей Николаевич

Ганглиозиды головного мозга крыс при адаптации к острой гипоксии в условиях измененной газовой среды и охлажденияВасильева, Ирина Валентиновна

Влияние адаптации к периодической барокамерной гипоксии на липидный спектр сыворотки крови и состояние процессов перекисной модификации липидов и белков у больных инфарктом миокарда на амбулаторно-полЯковлев, Дмитрий Игоревич

Повышение эффективности реабилитации больных инфарктом миокарда на амбулаторно-поликлиническом этапе с использованием метода адаптации к периодической барокамерной гипоксииПрокофьев Алексей Борисович

Влияние адаптации к периодической барокамерной гипоксии на электрическую активность миокарда у больных с ранними стадиями хронической сердечной недостаточности ишемического генеза.Дмитриева, Марина Константиновна