Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 8
1.1 Васкулогенез, артериогенез и ангиогенез. 8
1.2 Механизмы ангиогенеза 8
1.3 Ангиогенные факторы роста 11
1.4 Коллатеральная циркуляция в сердце 14
1.5 Стимулы для развития коллатералей 15
1.6 Роль воспаления в ангиогенезе 16
1.7 Роль факторов, подавляющих ангиогенез 19
1.8 Механизм действия ангиогенных факторов роста 21
1.9 Перспективы и проблемы применения терапевтического ангиогенеза 22
Глава 2 Материалы и методы 26
Результаты исследования и обсуждение
Глава 3 Содержание регулирующих ангиогенез факторов в плазме крови больных ИБС 31
Глава 4 Иммуноморфологическое исследование экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним в миокарде у больных ИБС 44
Глава 5 Получение плазмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста для последующего геннотерапевтического применения 50
Заключение 59
Выводы и практические рекомендации 65
Список литературы 67
- Ангиогенные факторы роста
- Содержание регулирующих ангиогенез факторов в плазме крови больных ИБС
- Иммуноморфологическое исследование экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним в миокарде у больных ИБС
- Получение плазмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста для последующего геннотерапевтического применения
Ангиогенные факторы роста
Многочисленный ряд естественных факторов роста и цитокинов могут индуцировать ангиогенез путем стимуляции роста и миграции ЭК. Одним из наиболее мощных эндотелиальных митогенов является VEGF (от англ. vascular endothelial growth factor) - эндотелиальный фактор сосудистого роста, или фактор сосудистой проницаемости - VPF (от англ. vascular permeability factor) (Dvorak и соавт., 1995). Исследования последних лет показали, что VEGF - это семейство нескольких факторов роста, которые, взаимодействуя с соответствующими рецепторами, способны индуцировать эндотелиальный митогенез (Olofsson и соавт., 1996; Joukov и соавт., 1996). К семейству VEGF относится несколько изоформ белка: VEGF-A ( варианты из 165, 121, 189 или 201 аминокислотного остатка), -В, -С, -D и -Е, отличающихся своими биологическими функциями. Так, VEGF-B преимущественно экспрессирован в тканях сердца, и его отсутствие влияет на сердечную функцию после окклюзии коронарной артерии (Olofsson и соавт., 1996), a VEGF-C играет ведущую роль в формировании и поддержании функции лимфатических сосудов и обладает ангиогенной активностью при патологии у взрослых (FerraraN, Alitalo К, 1999). Рецептор для VEGF-C - VEGFR3 - участвует в процессе эмбрионального ангиогенеза и экспрессируется в процессе патологического ангиогенеза (Dumont DJ и соавт., 1998). В отсутствие других факторов роста VEGFno индуцирует ангиогенез, но не достаточен для завершения процесса (Carmeliet Р соавт., 1999). Ключевая роль VEGF в первичном образовании сосудов подчеркивается тем фактом, что удаление гена VEGF у животных, гетерозиготных по данной мутации приводит к смерти в раннем эмбриогенезе (Ferrara и соавт., 1996; Carmeliet и соавт., 1996).
Другую группу активно исследуемых в настоящее время ангиогенных факторов представляет семейство факторов роста фибробластов - FGF ( от англ. fibroblast growth factor). Основную роль при ишемической болезни сердца играют два представителя этого многочисленного семейства - aFGF (кислый или FGF-1) и bFGF (щелочной или FGF-2) (Slavin, 1995; Folkman & Scing, 1992). Также как и представители семейства VEGF, факторы роста фибробластов являются гепарин-связывающими для компонентов внеклеточного матрикса (гепаран сульфаты, в частности) на поверхности эндотелиальных и гладкомышечных клеток, усиливая тем самым взаимодействие этих факторов роста с их высоко аффинными рецепторами. Наряду с митогенным действием, представители семейства FGF стимулируют продукцию эндотелием различных протеаз, в том числе активатора плазминогена и коллагеназы, способных к ферментативному перевариванию внеклеточного матрикса.
Кроме этих наиболее мощных семейств известны другие факторы роста, присутствующие внутри или вблизи сосудистой стенки и способные индуцировать пролиферацию эндотелия: трансформирующий фактор роста (TGF-a; от англ. transforming growth factor), фактор роста гепатоцитов (HGF; от англ. hepatocyte growth factor), интерлейкин-8 (IL-8), тромбоцитарный фактор роста (PDGF; от англ. platelet-derived growth factor), ангиопоэтины-1 и 2 (Ang-1, Ang-2), каждый из которых взаимодействует со своими специфическими рецепторами на эндотелиальной поверхности(таблица 1) .
В дополнение к их особой роли в инициации образования сосудов, VEGF, FGF и их рецепторы экспрессируются эндотелиальными клетками вновь образованной сети капилляров, ответвляющейся от существующих сосудов, в ответ на патологические условия. Экспрессия рецепторов к VEGF и FGF варьирует в зависимости от состояния сосудистого русла: она незначительна или отсутствует в нормальном миокарде и может возрастать при ишемии. Уменьшение кислородного напряжения приводит к усилению не только экспрессии таких ангиогенных факторов как FGF, PDGF (Kuwabara и соавт., 1995) и VEGF (Shweiki и соавт., 1992) и их рецепторов (Tuder и соавт.,1995; Li и соавт., 1996; Sellke и соавт., 1996), но и стимулирует рост эндотелиальных клеток (Nomura и соавт., 1995). Ангиогенез может наблюдаться и в участках с нормальным напряжением кислорода как альтернативный механизм, инициирующий развитие кровеносных сосудов.
Содержание регулирующих ангиогенез факторов в плазме крови больных ИБС
Как было установлено в результате проведенных исследований, уровень ангиогенных факторов в группе контроля (VEGF - 12+5 pg/ml; bFGF - 0,06±0,03 ng/ml) значительно уступает таковому в плазме у больных ИБС до оперативного вмешательства (VEGF - 130,0+25,1 pg/ml; bFGF - 3,3+0,9 ng/ml, таблицы 4 и 6). По-видимому, ишемизированные ткани миокарда вырабатывают стимулы, запускающие компенсаторные механизмы организма. В частности. продукция стимулирующих ангиогенез факторов и активируемый ими процесс формирования новых капилляров и роста уже имеющихся сосудов сердца один из вариантов такой компенсации.
Исходный уровень VEGF в плазме больных с более тяжелым исходным состоянием (IV ФК NYHA) несколько выше,чем у больных с ШФК (табл.4). В то время, как содержание bFGF до операции доставерно выше ( в 5 раз) в группе больных, отнесенных к III ФК.(табл.б). Дооперационный уровень и VEGF, и bFGF был незначительно выше у больных с большим поражением коронарных артерий и соответственно, с последующим большим объемом оперативного вмешательства (табл.4 и 6). У больных с менее сохранной сократительной функцией ЛЖ (ФВ 50%) содержание в плазме ангиогенных факторов ЕОР и bFGF) ниже, чем в группе больных с ФВ 50%.(табл.4 и 6).
Зависимость дооперационного уровня ангиогенных факторов от наличия аневризмы ЛЖ была выявлена только для VEGF. Так более высокие значения VEGF в плазме были получены у больных, имеющих аневризму ЛЖ. (табл.4), при этом содержание bFGF практически неизменно(табл.б). Таким образом, анализ дооперационного уровня ангиогенных факторов в плазме показал, что содержание ангиогенных факторов (VEGF и bFGF) достоверно выше у больных ИБС по сравнению с группой здоровых доноров; содержание VEGF прямо, a bFGF обратно коррелируют с исходной тяжестью состояния больного (ФК); при более выраженом нарушении сократительной способности ЛЖ (ФВ 50%) эндогенный выброс VEGF и bFGF значительно снижен; наличие аневризмы ЛЖ , по-видимому, имеет значение в активации синтеза VEGF, но не оказывает влияния на уровень bFGF.
Как можно заключить из результатов, представленных в таблице 4, через 15-20 дней после операции КШ содержание свободного VEGF возрастает. При этом выраженность изменений этого ангиогенного фактора коррелирует с объемом хирургического вмешательства и тяжестью дооперационного состояния больного. Так при более низкой фракции выброса ЛЖ 50% значение своб. VEGF возрастает в 4 раза, при ФВ ЛЖ 50% - только в 2,2, что может свидетельствовать о более сильной активации компенсаторных возможностей миокарда в первом случае. При наличии аневризмы значение свободного VEGF исходно ниже, чем у больных без аневризмы, но после операции КШ и резекции аневризмы уровень определяемого фактора увеличевается существенно сильнее, чем у прооперированных больных в отсутствие аневризмы ЛЖ.(табл.4)
Наиболее выраженное увеличение свободного VEGF в плазме наблюдается при длительности искуственного кровообращения (ИК) в интервале от 100 до 150 минут. Это можно объяснить повреждающим действием ИК, вызывающим каскад реактивных изменений в различных системах организма, в том числе активацию системы комплемента и образование свободных радикалов и протеиназ, что проявляется обычно в виде ишемии и отека миокарда, отека легких. При более длительном пережатии аорты, 90 минут, регистрируется более мощный выброс свободного ангиогенного фактора, чем при длительности пережатия аорты 60 минут, хотя в обеих группах уровень возрастает (Табл.4).
В отличие от свободного, уровень общего (суммарного) VEGF практически не изменяется после операции КШ (табл. 5), что позволяет предположить, что в результате проведенного лечения происходит перераспределение собственно VEGF в пользу свободного. Возможно, в исследуемом временном интервале после хирургичекой реваскуляризации возросшая экспрессия VEGF опережает его связывание с соответствующими рецепторами. Интересно, что уровень общего VEGF у больных с аневризмой ЛЖ (7,2±1,3 нг/мл) исходно существенно выше, чем у больных без аневризмы (3,0+1,0 нг/мл), а спустя 15-20 дней после операции КШ и резекции аневризмы, в результате снижения почти в 2 раза, содержание общего VEGF становится чуть ниже послеоперационного уровня у больных, не имеющих аневризмы ЛЖ, хотя и у них этот показатель по сравнению с их исходным возрастает. Вероятно, в результате резекции аневризмы ЛЖ, участка ишемизированного и часто фиброзноизмененого миокарда, продукция соответствующих рецепторов (в частности к VEGF) может снижаться, либо нарушается их функциональная активность. В результате уровень общего VEGF в плазме снижается после операции КШ в сочетании с резекцией аневризмы ЛЖ., несмотря на явное увеличение свободного VEGF.
Содержание другого ангиогенного фактора - общего bFGF, также достоверно возрастает в плазме больных ИБС, перенесших операцию КШ. Причем, как видно из полученных нами данных (таблица 6), содержание bFGF до операции в плазме больных ИБС IV ФК существенно ниже, чем в группе больных III ФК. Послеоперационный уровень bFGF сохраняяет почти такое же соотношение (значительно ниже в плазме больных ИБС IV ФК), так как в сраниваемых группах выраженность изменений аналогична. При большем объеме поражения коронарных артерий (КШ 3) несколько более высокий дооперационный уровень bFGF возрастает после операции в большей степени, чем у больных с шунтированием 1-2 сосудов. Сравнивая группы больных с фракцией выброса ЛЖ меньше 50% и больше 50%, мы видим, что в обеих группах экспрессия bFGF усиливается после КШ. В отличие от изменений свободного VEGF в результате операции КШ в сочетании с резекцией аневризмы ЛЖ(табл.4), уровень bFGF практически не меняется, в то время как в отсутствие аневризмы ЛЖ послеоперационный уровень достоверно возрастает почти в 3 раза.(табл.6). Это может свидетельствовать об отличиях в механизмах стимуляции эндогенной выработки анализируемых нами ангиогенных факторов. Более выраженные изменения bFGF в плазме после хирургической реваскуляризации миокарда наблюдаются при более длительном пережатии аорты, что аналогично динамике уровня VEGF. Экспрессия ангиогенных факторов, как видно из наших данных (таблица 4 и 6), коррелирует и с длительностью искусственного кровообращения, в результате которого активируется целый ряд факторов (внеклеточный матрикс, макрофаги, эндотелий), обеспечивающих запуск эндогенного ангиогенеза.
Иммуноморфологическое исследование экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним в миокарде у больных ИБС
Результаты иммуноморфологического исследования полученных интраоперационно тканей миокарда больных ИБС хорошо коррелируют с данными о содержании стимулирующих ангиогенез факторов в плазме этих же больных.
Так на рис. 4 представлена картина, полученная при окрашивании ишемизированного участка миокарда антителами к VEGF. Наблюдается диффузное окрашивание саркоплазмы кардиомиоцитов, усиливающееся местами в районе сарколеммы. Также хорошо окрашен эндотелий сосудов. Такая интенсивная окраска свидетельствует об активации продукции VEGF в ишемизированном миокарде.
Аналогичным образом на рис.5 можно наблюдать выраженное окрашивание саркоплазмы кардиомиоцитов антителами к рецептору для VEGF - flt-1. При этом в некоторых участках миокарда выявляется характерная для мышечной ткани поперечная исчерченность.
Распределение в тканях сердца еще одного рецептора для VEGF - flk-1 представлено на рис. 6. При этом наиболее ярко окрашена цитоплазма эндотелиальных клеток.
Окраска -антитела к flk-l+ гематоксилин; ув.: ок.хЮ, об.х20.
Кроме того наблюдается диффузное окрашивание части кардиомиоцитов. Тем самым в ишемизированнои ткани имеет место не только усиление синтеза стимулирующих ангиогенез факторов, но также активизируются клетки, способные адекватно отреагировать на полученный сигнал. На рис. 7 показано диффузное окрашивание большинства кардиомиоцитов антителами к Вс1-2 (антиапоптотический фактор). При этом окраска в эндотелиальных клетках и фибробластах отсутствует. Это согласуется с данными о том, что VEGF может способствовать выживанию клеток, в нашем случае кардиомиоцитов, препятствуя апоптозу, индуцируя экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2 (Nor J.E. et al., 1999).
Слабо выражена окраска сердечной ткани антителами к мембранным белкам -маркерам апоптоза - CD95 и лиганду для данного рецептора - CD95L (рис. 8 и 9). Редкие вкрапления окраски встречаются в клетках эндотелия капилляров и более крупных кровеносных сосудов.
Также слабо выражена окраска кардиомиоцитов антителами к антиангиогенному фактору - тромбоспондину ( рис. 10). Окрашены далеко не все кардиомиоциты, при этом окраска локализуется мелкими очагами и имеет тенденцию к концентрированию вокруг ядра клетки.
Тем самым в процессе индуцированного VEGF ангиогенеза происходит параллельная стимуляция синтеза факторов, подавляющих ангиогенез, что препятствует неконтролируемому росту сосудов. В то же время очевидная разница в интенсивности окрашивания свидетельствует о значительном преобладании процессов стимуляции ангиогенеза над механизмами его подавления.
Полученная нами картина иммуногистологического окрашивания тканей ишемизированного миокарда больных ИБС свидетельствует о том, что активизация продукции стимулирующих ангиогенез факторов (в частности VEGF) у этих больных сопровождается повышением экспрессии соответствующих рецепторов на отвечающих клетках, а также блокировкой механизмов апоптоза в сосудах миокарда. Другими словами, складывается ситуация, способствующая формированию новых кровеносных сосудов, предназначенных для компенсации недостаточного кровотока и ишемии в пораженных тканях.
Получение плазмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста для последующего геннотерапевтического применения
Последовательность человеческого гена VEGF была получена из базы данных Genome Database с помощью программы Entrez(NM003376). Для получения гена к его последовательности были синтезированы праймеры: к 5 концу гена TCG GGC CGA ААС CAT GA и CGG СТС АСС GCC TCG GCT Т к 3 концу гена. Праймер к 5 концу гена был выбран с учетом последовательности Козак, обеспечивающей эффективное начало трансляции. Для обеспечения возможности проверки экзогенного белкового продукта гена VEGF, был также синтезирован праймер на 3 конец гена, который помимо последовательности гена, содержал эпитоп распознавания антителами полигистидиновой последовательности, необходимой для последующей очистки белка. Для удобства клонирования и анализа праймеры также включали сайты узнавания уникальными рестриктазами, не содержащимися в последовательности гена. Сайт EcoRI для 5 концевого праймера и Smal сайт для 3 концевого праймера. Исходя из данных литературы для реакции RT-PCR (обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией) была использована мРНК, выделенная из человеческой плаценты с помощью набора для выделения РНК -RNAgents Total RNA Isoletion System (Promega, USA). Полученная РНК была обработана ДНКазой, свободной от РНКаз (Promega, USA) и очищена с помощью набора RNAid (BiolOl). 2 мкг тотальной РНК было использовано для реакции обратной транскрипции. Объем реакционной смеси составил 10 мкл. Реакционная смесь состояла из: 2 мкл 5-кратного буфера для ревертазы (Gibco BRL), 1 мкл 5mM смеси dNTP(Amersham-Pharmacia), 1 мкл фермента обратной транскрипции Superscript (Gibco BRL). Реакция проводилась 30 минут при температуре 40 С с последующим прогревом реакционной смеси 10 минут при 90 С. К реакции добавлялось 40 мкл реакции ПЦР, содержащей 8 мкл 5кратного буфера для ПЦР (Gibco BRL), 2 мкл 5mM смеси dNTP (Amersham-Pharmacia), по ЮОнг 5 и 3 концевых праймеров и 5 ед. Pfx полимеразы (Gibco BRL).
Для проведения реакции использовался прибор OMNI-Gene фирмы Hybaid. Условия проведения реакции ПЦР: денатурация 95 С 1 мин., отжиг 63 С 1 мин. достройка 72 С 1 мин. Всего было проведено 35 циклов амплификации. Результаты реакции анализировались в 0,7 % агарозном геле. Фрагменты ДНК, соответствующие по размерам VEGF 165 и VEGF 121, элюировались из геля после рестрикции и очищались с помощью набора фирмы Qiagen. Конструкция, содержащая ген VEGF 165 , была изготовлена на основе вектора pBK-CMVneo (Stratagene) (Рис. 11). Последовательность кДНК VEGF165 по рестрикционным сайтам EcoRI-Smal была клонирована в вектор, под контроль CMV (цитомегаловирусного промотора). Плазмида pBK-CMVneo имеет устойчивость к антибиотику канамицину. С целью уменьшения иммуногенности плазмиды из нее были удалены последовательности, кодирующие бактериальный ген lacZ. На 3 конце последовательности гена VEGF находится сигнал полиаденилирования вируса SV40. Место начала репликации плазмиды в эукариотических клетках использовано от вируса SV40, что обеспечивает возможность поддержания мультикопийности плазмиды в эукариотических клетках. На карте отмечены положения и направления транскрипции генов и некоторые сайты рестрикции. (Рис. 11.) Для клонирования использовался плазмидный вектор, резаный рестриктазами EcoRI-Xmal. Из полученных клонов выделялись плазмиды, несущие вставки для каждого из вариантов VEGF, для проведения секвенирования - определения точной нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов. Секвенирование проводилось с помощью плазмидных праймеров ТЗ и Т7, а также с помощью специфических синтезированных праймеров к последовательности VEGF: С AG ААТ CAT С АС GAA GTG GT GCT ТТС ТСС GCT CTG AGC А.
Проведенный анализ первичной последовательности показал, что вся последовательность обоих сплайс-вариантов гена совпадает с описанной ранее, кроме нуклеотидов в позиции 166, 167. Предположительно в этом районе произошла перестановка 2-х нуклеотидов. Это привело к замене аминокислоты серина на треонин. С биологической точки зрения такая замена возможна без изменения свойств полипептида. Более того, в базе данных были найдены варианты VEGF, в которых присутствовала подобная замена. Таким образом это может являться полиморфизмом гена, не отражающимся на его функции. В настоящее время полученные плазмиды встроены в соответствующий штамм Escherichia coli с целью наработки белка в процессе ферментации с последующей очисткой препарата из клеточного лизата на аффинных колонках с антителами, специфичными к гистидиновому хвосту молекулы.
С целью получения препарата плазмидной ДНК для генной терапии отдельную колонию клеток E.coli, содержащую плазмидную ДНК, засевали в 100 мл среды LB, содержащей ЮОмкг/мл ампициллина и растили в течение ночи на качалке при 250 об/мин и температуре +37 С. 25 мл ночной среды использовали для инокулирования 500 мл свежей среды LB с ампицилином и растили в течение ночи при тех же условиях. Клетки осаждали центрифугированием (Beckman J2-21) 6000об/мин, 15мин, надосадочную среду удаляли. Клеточный осадок ресуспендировали в 25 мл раствора глюкозы (50мМ) и ЭДТА (10 мМ) на трис-буфере (рН 8,0) при +4 С. Добавляли RNAse (DNAse free, Promega) до конечной концентрации 50 мкг/мл. Инкубировали 20 мин при +4иС при перемешивании. Затем добавляли 25 мл раствора лизоцима, перемешивали, инкубировали 20 мин при +4 С. После этого добавляли 100 мл 1% раствора додецилсульфата натрия в 0,2 М NaOH и аккуратно перемешивали, не взбалтывая. Образовавшуюся вязкую массу инкубировали 20 мин. при +4 С. После инкубации добавляли 75 мл З М раствора ацетата калия рН 4,8 и аккуратно премешивали до исчезновения вязкости. Инкубировали 40 мин при +4 С. Выпавший осадок осаждали центрифугированием (Beckman J2-21) при 20000 об/мин 1 час, +4 С. Водную фазу фильтровали на установке Costar Тор Filter 0,45 мкм на отсасывающем насосе. К профильтрованной водной фазе добавляли 0.6 объема изопропилового спирта. Инкубировали при +4 С на протяжении 4 часов. Центрифугировали 15 мин (Beckman J2-21) при 5000 об/мин. Осадок промывали 75% раствором этилового спирта в 0.1 М NaCl, после чего осадок высушивали в вакуумном испарителе 30 мин. К осадку ДНК в пробирке добавляли 3 мл буфера STE, инкубировали в течение ночи при +4 С. После этого осадок растворяли пипетированием. К раствору добавляли 7.5 мл 7,5 М ацетата аммония, рН 7,5, перемешивали и инкубировали при 20 С 40 мин. Центрифугировали (Beckman J2-21) 10000 об/мин 30 мин при +4 С. Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли 4 мл изопропилового спирта, перемешивали и центрифугировали (Beckman J2-21) 5000 об/мин 15 мин при 4 С. Осадок промывали 75% спиртом и растворяли в 10 мл STE. К раствору ДНК добавляли 10 мл \\% полиэтиленгликоля на 0.5М NaCl. Перемешивали, инкубировали при +4 С в течение ночи. Центрифугировали (Beckman J2-21) 15000 об/мин 60 мин при +4 С. Супернатант переносили в другую пробирку и к нему добавляли 10 мл 11% полиэтиленгликоля на 0.5 М NaCl. Центрифугировали (Beckman J2-21) 8000 об/мин 60 мин при +4 С. Осадок 4 раза промывали 75% этиловым спиртом и растворяли в 5 мл STE. Полученный раствор наносили на гель-фильтрационную колонку (2.5смх70см). Сбор фракций осуществлялся в коллектор фракций (Pharmacia-LKB), при скорости потока 0.5 мл/мин. Мониторинг хроматографии проводили с помощью Uvikord II (Pharmacia-LKB). Концентрацию препарата в собранных фракциях определяли на спектрофотометре (Beckman) при длине волн 240 нм, 260нм, 280нм. Те фракции, в которых соотношение 260:240= 1,75, а 260:280=1,88, объединялись и концентрировались осаждением спиртом с последующей промывкой и растворением как описано выше. Растворение производили в 1 М NaCl. Окончательную очистку производили с помощью набора фирмы Promega PureFection Plasmid DNA purification system в соответсвии с рекомндациями фирмы. Концентрацию ДНК в полученном растворе определяли на спектрофотометре (Beckman) при длине волны 260 нм. Необходимой концентрации ДНК добивались последующим переосаждением и растворением в необходимом количестве буфера STE. Выход очищенной плазмидной ДНК по описанному нами протоколу составляет 1.5 мг/л исходной среды LB.
![Особенности факторов риска ишемической болезни сердца и гипертонической болезни среди коренного и некоренного населения г. Улан-Удэ [Электронный ресурс]](/i/i/4457/200638.png "Особенности факторов риска ишемической болезни сердца и гипертонической болезни среди коренного и некоренного населения г. Улан-Удэ [Электронный ресурс] Шедоева Марина Николаевна")
