Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные оптико-спектральные методы и средства измерений, применяемые при исследовании жидких биоорганических сред 15
1.1 Атомная спектроскопия 17
1.2 Молекулярная абсорбционная спектрофотометрия 21
1.3 Флуоресцентная спектроскопия 27
1.4 Нефелометрия и турбидиметрия 32
1.5 Применение методов анализа многомерны/ данных в спектроскопии 42
1.6 Микропланшетные оптические анализаторы 57
1.7 Выводы к главе 1 66
Глава 2. Теоретические и экспериментальные исследования особенностей измерения абсорбции и флуоресценции микропланшетными анализаторами 69
2.1. Колебания поверхности жидкости в лунке из-за движения микропланшета 69
2.2 Искривление поверхности жидкости вследствие капиллярных эффектов 72
2.3. Влияние характеристик интерференционных светофильтров 79
2.4 Факторы, влияющие на флуоресцентный сигнал 83
2.5 Калибровка прибора в относительных единицах флуоресценции 88
2.6 Основные виды флуоресцентных образцов сравнения 89
2.7 Флуоресцентные образцы сравнения на основе цветных оптических стекол 94
Глава 3. Основы обеспечения единства измерений микропланшетными оптическими анализаторами (на примере разработки фотометра-флуориметра ФФМ-01) 101
3.1 Обоснование основных технических требований, предъявляемых к разрабатываемому МОА 101
3.2 Оптическая схема ФФМ-01 103
3.3 Электронная система и механизм перемещения микропланшета 112
3.4 Основные алгоритмы обработки сигналов для ФФМ-01 114
3.5 Программное обеспечение ФФМ-01 119
3.6 Контроль метрологических характеристик ФФМ-01 123
3.7 Выводы к главе 3 135
Глава 4. Опыт использования ФФМ-ОЇ при исследовании биологических жидкостей 136
4.1 О сравнительных испытаниях средств измерений медицинского назначения 136
4.2 Детекция продуктов ПЦР 138
4.3 Учет результатов ИФА 143
4.4 Разработка методических рекомендаций по применению прибора ФФМ-01 для ИФА и ПЦР 148
4.5 Флуоресцентный биохимический анализ 154
4.6 Микробиологический анализ 159
4.7 Выводы к главе 4 166
Глава 5. Разработка спектрофотометра УСФ-01 и методического обеспечения для него 168
5.1 Спектрофотометр УСФ-01 168
5.2 Методика измерения потока излучения слабых источников линейчатого спектра на отдельных спектральных линиях 188
5.3 Выводы к главе 5 201
Глава 6. Определение характеристик взвеси частиц по спектрам малоуглового рассеяния света 202
6.1 Теоретическое исследование зависимостей спектров рассеянного излучения от параметров взвеси частиц 203
6.2 Разработка методики измерения спектров малоуглового рассеяния для взвеси мелкодисперсных частиц 213
6.3 Результаты измерения спектров малоуглового рассеяния 219
6.4 Обработка экспериментальных данных по малоугловому рассеянию228
6.5 Выводы к главе 6 251
Заключение 252
Литература 256
Приложение 270
- Флуоресцентная спектроскопия
- Оптическая схема ФФМ-01
- Спектрофотометр УСФ-01
- Результаты измерения спектров малоуглового рассеяния
Флуоресцентная спектроскопия
Важная информация о свойствах биологических объектов может быть получена методами флуоресцентной и люминесцентной спектроскопии. Изучается флуоресценция либо самих биологических объектов, либо специальных флуоресцентных зондов (меток), молекулы которых связываются (гибридизуются) с определенными биологическими молекулами (например, молекулами ДНК). Использование зондов является предпочтительным с точки зрения обеспечения специфичности анализа. Собственная флуоресценция биологических молекул имеет место в относительно коротковолновой области - например, у белковых молекул при возбуждения флуоресценции максимум имеет место на длине волны 280 нм, а при регистрации - в интервале 340-350 нм [57,58]. Поэтому при исследовании биологических молекул флуоресцентными методами в качестве зондов используют, как правило, красители, у которых возбуждение флуоресценции имеет максимум при Х 350 нм, а излучение - при Х 450 нм. Все более активно применяются флуоресцентные и люминесцентные методы при анализе клеток и клеточных культур [59]. Одно из существенных преимуществ флуоресцентных и люминесцентных методов - возможность определения анализируемых веществ на уровье следов. Флуоресценция обеспечивает пределы обнаружения в 1000 раз меньшие, чем абсорбция, и позволяет определять флуоресцирующие вещества в пробе при содержаниях 10"b моль; измерения хеми- и биолюминесценции позволяют обнаруживать 10" моль. Традиционная схема измерений в флуоресцентной спектроскопии заключается в измерении интенсивности флуоресценции при определенных значениях длин волн возбуждения и эмиссии. Обеспечивая высокую чувствительность при определении одного известного аналита, такой подход не позволяет учесть мешающие влияния других веществ, с близкими значениями длин волн возбуждения и эмиссии флуоресценции.
Поэтому в последнее время для повышения селективности флуоресцентного анализа стали использовать двумерные спектры флуоресценции [60]. У таких спектров интенсивность флуоресценции F является функцией двух переменных - длины волны возбуждения Хъ и длины волны эмиссии Хх Для регистрации спектра при каждом значении А,в (всего к значений) производят сканирование по э (всего и значений). Полученный спектр представляется в виде прямоугольной матрицы (Exitation-Emission Matrix -ЕЕМ), имеющей размерность к п. Для обработки двумерных спектров флуоресценции используется математический аппарат анализа многомерных данных, который рассматривается в разделе 1.5 настоящей главы. Там же приведены примеры использования двумерных спектров флуоресценции в биомедицинских измерениях.
Основные биомедицинские приложения флуоресцентных анализаторов - определение фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации (размножения) при полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализ клеточных культур, иммуно-флуоресцентный анализ, некоторые виды биохимических анализов. Для анализа клеточных культур во многих случаях необходимо изучать изменение флуоресценции во времени, т.е. проводить кинетические измерения.
ПЦР, метод многократного искусственного копирования специфических фрагментов ДНК, является в настоящее время одним из самых эффективных технологий анализа ДНК [61-62]. При ПЦР происходит быстрое размножение (амплификация) характерных фрагментов молекулы ДНК, представляющей интерес для целей проводимого исследования. Процесс амплификации проводят циклами, каждый цикл длится 70- 140 с и состоит из трех стадий, причем каждой стадии должна соответствовать строго определенная температура. Для первой стадии (расплетение двойной спирали ДНК) необходима температура 93-95 С, для второй стадии (присоединение коротких, искусственно синтезированных фрагментов-праймеров) - 50-65С и для третьей стадии (достраивание цепей ДНК) -72С. Поэтому ПЦР проводят в специальных устройствах - термоцикл ерах, обеспечивающих требуемые температурные режимы. Обычно проводят 30-40 циклов амплификации, причем в каждом цикле количество ампликонов удваивается. Таким образом, появляется возможность обнаружения очень малых количеств ДНК (вплоть до единичной молекулы), имеющей искомый фрагмент. Для анализа продуктов амплификаиии наиболее эффективным является метод, основанный на их гибридизации со специфическим зондом, меченным флуоресцентной меткой, с флуорометрическим детектированием полученного гибридизационного комплекса. Такое детектирование может производиться как по завершении процесса амплификации (ПЦР по конечной точке), так и в каждом цикле этого процесса (ПНР в реальном времени -real time PCR). На зависимости интенсивности флуоресценции от числа циклов имеются четко выраженные экспоненциальный и линейный участки, после чего кривая асимптотически выходит на насыщение («плато»). Основная причина выхода на «плато» -истощение исходных реагентов.
При измерении в реальном времени регистрация флуоресцентного сигнала производится в процессе амплификации, при этом измеряемыми параметрами являются номер N{ цикла, при котором начинается загиб кривой, и соответствующая этому загибу интенсивность флуоресценции Fj. Показано, что Ft пропорционально числу молекул ДНК до начала амплификации, что дает возможность прямого количественного ПНР анализа. Для регистрации ПНР в реальном времени необходимы достаточно сложные системы, в которых термоциклер совмещен с оптическим модулем, осуществляющим измерение флуоресценции.
При анализе по конечной точке гибридизационная смесь, в которой уже завершился процесс амплификации, помещается в лунки непрозрачного микропланшета; чаще всего используются 96 — луночные микропланшеты, при этом в лунку дозируется порядка 100 мкл пробы. Измеряется интенсивность флуоресценции, которая соответствует количеству продуктов амплификации после окончания всех циклов ПНР, т.е. области «плато». Такой подход используется, в частности, в тест-системах серии ПЛАТАН, разработанных научно-производственной фирмой «ЛИТЕХ» [62]. Пропорциональность флуоресценции в области «плато» числу молекул ДНК до амплификации отсутствует, поэтому при проведении количественного ПЦР анализа приходится включать в состав соответствующих тест-систем внутренние образцы сравнения (так называемые внутренние стандарты) и предусматривать для них несколько лунок в каждом анализируемом планшете. Флуоресцентная детекция продуктов ПЦР по конечной точке возможна и при использовании пробирок вместо лунок микропланшета. На этом основана методика FLASH (Fluorescent Amplification based Specific Hybridization - специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе амплификации), которую развивает фирма ДНК-технология. Флуоресцентные методы применяются при биохимическом анализе, особенно в случаях, когда требуется повышенная чувствительность. Они используются, в частности, для анализа субстратов, гормонов, витаминов, определения активности ферментов [58]. Особенно эффективны флуоресцентные методы в тех видах биохимических анализов, где требуется минимальный расход пробы, например, пли контроле (скрининге) новорожденных на ФКУ1.
При иммуно-флуоресцентном анализе для обнаружения комплекса антиген-антитела, образовавшегося в результате иммунной реакции, один из компонентов помечается флуоресцентной меткой.
Потенциальная чувствительность флуоресцентных методов очень высока, но на практике она лимитируется сигналом фона, который может возникать из-за присутствия в растворе других флуорофоров. Для уменьшения влияния фона и улучшения специфичности анализа были предложены специальные разновидности иммуно флуоресцентного анализа. При поляризационном флуоресцентном иммуноанализе (ПФИА) измеряемой величиной (аналитическим сигналом) является поляризация флуоресценции P=(III-I±)/(III+LJ. (1.1)
Принцип ПФИА заключается в конкуренции определяемого и специального вещества, меченного флуоресцентной меткой, за связывание с ограниченным количеством антител. Метод основан на возрастании поляризации флуоресценции меченного флуоресцеином антигена при его специфическом связывании с антителами [63].
Оптическая схема ФФМ-01
При выборе оптической схемы прибора исследовалась возможность использования волоконной оптики для освещения образца. Такая схема позволяет обеспечить компактность прибора, дает возможность заменить перемещение планшета по одной или даже двум координатам перемещением оптической головки. Если бы прибор работал только в режиме абсорбции, то волоконная схема была бы предпочтительнее. Однако при регистрации флуоресценции основное значение имеет светосила при сборе излучения. Возможности волоконного световода по сбору излучения флуоресценции характеризуются его входной числовой апертурой sin(n eKp), где п -показатель преломления сердцевины световода, 6кр. - предельный угол падения луча на его торец. Числовая апертур і многомодового световода находится в пределах 0,3-0,55, одномодового - менее 0.3, показатель преломления сердцевины можно принять равным 1,5, отсюда 0кр=11 - 22} [139]. Таким образом, волоконный световод позволяет собирать излучение флуоресценции в сравнительно малом угле. Применение линзовых схем позволяет использовать плоский угол сбора излучения 45 и более, таким образом, выигрыш по светосиле получается в 4 и более раз.
Для фокусировки возбуждающего излучения и сбора излучения флуоресценции целесообразно использовать одну и ту же линзу, а разделение соответствующих световых пучков осуществлять с помощью светоделительной пластины. Подобная схема используется, в частности, в флуоресцентной микроскопии, в этом случае ее называют схемой регистрации эпи-флуоресценции [140].
С учетом заданного спектрального диапазона прибора в качестве основного источника излучения целесообразно использовать галогенную лампу; при необходимости работы в УФ диапазоне в качестве дополнительного источника излучения может быть использована дейтериевая лампа.
Для обеспечения независимости результатов от дрейфа интенсивности источника излучения необходима двухлучевая оптическая схема - в каждом из режимов (флуоресценции или абсорбции) часть излучения источника отводится в опорный канал, который используется для учета этого дрейфа.
В качестве фотоприемников в опорном канале и в канале измерения абсорбции могут быть использованы кремниевые фотодиоды. Для исключения темнового тока для этих приемников предпочтительна фотовентильная, а не фотодиодная схема включения (см., например, [141], раздел .4.3.2)]. В то же время при использовании фотовентильной схемы возможны отклонения от линейности при малых световых потоках за счет тока смещения фотодиода. Эти отклонения приходится корректировать программным путем: разработанный для этого алгоритм описан в разделе 3.4.4 диссертации.
В режиме флуоресценции в качестве фотоприемников необходимо использовать фотоэлектронные умножители (ФЭУ).
Для выделения требуемых спектральных интервалов в режимах флуоресценции и абсорбции в разрабатываемом приборе можно использовать либо монохроматоры, либо ИС. Достоинствами варианта с использованием монохроматоров являются:
- возможность задавать любые (в пределах спектрального диапазона прибора) значения длин волн в каналах флуоресценции и абсорбции;
- лучшее, по сравнению с ИС, подавление спектрального фона.
Однако оптические схемы с монохроматорами при сборе излучения флуоресценции являются менее светосильными по сравнению со схемами, использующими ИС. Кроме того, использование двух монохроматоров с дифракционными решетками существенно усложняет прибор, повышает его габариты и стоимость. Поскольку прибор предназначается для использования в клинических лабораториях, такое усложнение нежелательно. Поэтому выбран вариант с ИС.
Перед началом измерений исследуемые пробы помещаются в лунки микропланшета, после чего он вдвигается внутрь прибора. В процессе сканирования микропланшет перемещается таким образом, что его лунки последовательно оказываются в фокальной области светового пучка, сформированного осветительной системой.
В зависимости от режима измерений (абсорбция или флуоресценция), оптическая схема должна обеспечить разную фокусировку светового пучка, направляемого на лунку (см. рис.3.1).
В главе 2 было показано, что:
- в режиме измерения флуоресценции для получения максимального сигнала фокальное пятно должно быть в верхней части столба жидкости в лунке;
- в режиме абсорбции для минимизации эффекта мениска световой пучок, проходящий через лунку, должен быть сходящимся; следовательно, фокальное пятно должно располагаться под планшетом.
Оптическая схема прибора, разработанная на основе принятых технических решений, приведена на рис. 3.2.
Элементы оптической схемы входят в состав двух блоков прибора - блока осветителя и блока регистрации сигналов.
Рассмотрим работу этой схемы в режимах абсорбции и флуоресценции.
Галогенная лампа 1 находится в фокусе коллиматорной линзы. В качестве коллиматорной в пучке может находиться одна из линз 2 или 3, в зависимости от требуемого размера фокального пятна в плоскости планшета (линза 2 обеспечивает диаметр фокального пятна около 4 мм, а линза 3 порядка 2 мм). Для работы с планшетами, содержащими до 96 лунок включительно, рекомендуется диаметр фокального пятна 4 мм, для планшетов с 192 или 384 лунками - 2 мм. Выходящий из коллиматорной линзы параллельный пучок проходит через один из интерференционных светофильтров, закрепленных в гнездах турели 4. Смена фильтров производится путём поворота турели 4 с помощью шагового двигателя.
Прошедший через светофильтр пучок светоделительной пластиной 5 делится на две части. Прошедшее через пластину 5 излучение линзой 6 фокусируется на фотоприемник 7 опорного сигнала. Отраженное излучение направляется на лунку планшета. Как было показано в главе 2, в режиме флуоресценции точка фокусировки должна быть внутри жидкости, находящейся в лунке, а в режиме абсорбции - ниже дна лунки. Обеспечить такие различия можно, устанавливая для режимов флуоресценции и абсорбции коллиматорные линзы 2 или 3 с разными фокусными расстояниями. Другой способ, предложенный Б.С. Широковым, предусматривает помещение в контакте с каждым интерференционным светофильтром, предназначенным для работы в режиме абсорбции, дополнительной линзы 4а.
Спектрофотометр УСФ-01
Спектрофотометр УСФ-01 был разработан во ВНИИОФИ в 2002 - 2004 г.г. Диссертанту принадлежит разработка оптической схемы прибора, идеологии и алгоритмов программного обеспечения, методики испытаний и поверки. В настоящем разделе будут рассмотрены особенности этого прибора. 5.1.1 Оптическая схема спектрофотометра
Оптическая схема, приведена на рис. 5.1 -5.2. Прибор рассчитан на спектральный диапазон от 190 до 1100 нм, поэтому в нем используются два источника излучения - деитериевая лампа с полым катодом для интервала 190-350 нм и вольфрамовая галогеновая лампа для диапазона 350 - 1100 нм. В спектрофотометре выбрана схема монохроматора с простым вращением вогнутой дифракционной решетки, т.е. при сканировании спектра решетка вращается относительно оси, проходящей через ее вершину параллельно штрихам, а щели прибора остаются неподвижными, в результате, угол между падающим и дифрагированным лучами постоянен. Для таких схем важен выбор угла а между щелями прибора [152]. При малых значениях этого угла уменьшаются поперечные аберрации решетки, но возрастает дефокусировка. Большие значения угла а позволяют практически исключить дефокусировку, но при этом возрастают поперечные аберрации, даже при их коррекции с помощью искривленных штрихов и переменного шага решетки. В связи с тем, что от разрабатываемого прибора не требуется спектральное разрешение лучше 1 нм, небольшая дефокусировка спектральных линий является приемлемой. В то же время большие поперечные аберрации приводят к потере светосилы, что нежелательно. Исходя из этого для угла между щелями, т.е. для угла отклонения лучей монохроматором, было выбрано значение 20.
Особенностью оптической схемы спектрофотометра является отсутствие вращающегося зеркала, осуществляющего коммутацию светового пучка между опорным и измерительным каналами; подобное устройство (прерыватель, или chopper) обычно используется в двухлучвых спектрофотометрах. Разделение пучка между каналами осуществляется с помощью светоделителя МЗ.-Для уменьшения зависимости коэффициента деления от длины волны светоделитель выполнен в виде ячеистого зеркала с металлическим напылением . Отсутствие прерывателя повышает надежность системы и обеспечивает регистрацию сигналов в опорном и измерительном канале в один и тот же момент времени. При этом благодаря аналоговой и цифровой фильтрации сигнала удалось и в отсутствие прерывателя обеспечит стабильность линии 100 % пропускания в пределах 1 %.
В качестве рабочего используется -4-й порядок дифракции. Для подавления других дифракционных порядков применяются светофильтры из различных марок цветного стекла, помещенные в гнездах турели Т (рис.5.2). В одно из гнезд этой турели помещено отражающее зеркало М5. В зависимости от спектрального интервала одно из гнезд турели автоматически устанавливается в рабочее положение в соответствии с табл. 5.1.
Как отмечалось в п. 5.1.1, в спектрофотометре используется схема монохроматора с вогнутой дифракционной решеткой (ДР), причем ось вращения решетки проходит через ее центр, а угол между падающим и дифрагированным лучами остается постоянным. Подобная схема используется в современных спектральных приборах. Использована голографическая дифракционная решетка, имеющая 800 штр/мм. Применение голографической решетки, адаптированной к конкретной оптической схеме, позволило свести к минимуму аберрации, свойственные сферической ДР.
На рис.5.3 показана схема механизма, осуществляющего поворот дифракционной решетки. Шаговый двигатель (ШД) вращает винт 1, вращение которого приводит к поступательному перемещению толкателя 2 вдоль оси винта. Толкатель через шарик 3 воздействует на рычаг 4, жестко связанный с ДР. При перемещении толкателя и повороте рычага шарик перемещается по поверхности толкателя.
Этот привод не содержит классического синусного механизма с клином, используемого часто в дифракционных монохрг маторах [153], например, в монохроматорах типа МУМ. Привод проще в изготовлении, чем синусный механизм и не нуждается в какой-либо настройке. Управление шаговым двигателем (ШД), вращающим привод, осуществляется от ПК через микроконтроллер (МК). Для заданного значения длины волны А. ПК вычисляет соответствующее число шагов ШД - N и передает его в МК. Это дает возможность свести настройку (калибровку) по шкале длин волн к подбору параметров зависимости ЩХ) и вводу этих параметров в МК монохроматора. Такая «математическая» настройка значительно проще механической настройки синусного механизма, .сроме того, математическую настройку можно в случае необходимости быстро корректировать, не открывая прибора.
Найдем зависимость N(X). Учтем, что при включении монохроматора привод автоматически устанавливается в начальное положение, соответствующее нулевому порядку дифракцгй. Пусть у угол между нормалью к оси винта и начальным положением рычага, 0 - угол поворота дифракционной решетки из начального положения в положение, соответствующее длине волны X, Н - смещение толкателя при этом повороте, L - длина рычага (см. рис.5.3). Из рисунка следует, что AB=2L sin6/2; {3=в/2+у; H AB cosp. Число шагов ШД связано с шагом винта h и перемещением толкателя очевидным соотношением N=b H/h, где Ъ - число шагов ШД, соответствующих одному полному обороту. Из приведенных формул следует N=2Lb/h sin&2 cos(6/2+y)
Из формулы (5.4) следует, что зависимость N(X) линейна только при у=0. Угол у определяется первоначальной установкой рычага механизма поворота, для обеспечения минимальных габаритов монохроматора целесообразно выбирать для у значение, соответствующее длине волны, близкой к началу спектрального диапазона.
Для математической калибровки монохроматора точная зависимость (5.4) была аппроксимирована двумя параболами, коэффициенты которых (так называемые константы монохроматора) подбирались по методу наименьших квадратов индивидуально для каждого экземпляра монохроматора и записывались в его микроконтроллер.
Для реализации описанного выше способа настройки монохроматора используются бальмеровские линии дейтериевой лампы (656,1 нм и 486,0 нм), а также линии ртути и неона, излучаемые ртутной ЛПК с неоном в качестве газа-наполнителя.
В монохроматоре используется голографическая дифракционная решетка типа 3 [122,154]. Параметры решетки подбирались таким образом, чтобы минимизировать аберрации и расфокусировку во всем спектральном диапазоне. В табл. 5.2-5.3 приведены результаты расчетов аберраций для монохроматора при двух значениях расстояния от выходной щели до вершины решетки, у, z — координаты пучка в то ІКЄ падения на поверхность дифракционной решетки в мм. Расчеты выполнены в отделе асферической и дифракционной оптики Государственного института прикладной оптики (ГИПО).
Из данных этих таблиц видно, что аберрации монохроматора значительно уменьшатся, если реализовать 2 положения выходной щели - для краев спектрального диапазона расстояние от выходной щели до вершины решетки 250 мм, а для центральных длин волн - 254 мм.
Результаты измерения спектров малоуглового рассеяния
По методике, изложенной в разделе 6.2, были произведены измерения спектров малоуглового рассеяния для ряда взвес ;й, содержащих дисперсные частицы. Измерения проводились для взвесей формазина, используемых в качестве стандартных образцов при измерении мутности, для суспензий, содержащих микросферы полистирольного латекса и для белковых суспензий. В этом разделе будут изложены полученные результаты; обработке этих результатов с целью извлечения информации о рассеивающих частицах посвящен раздел 6.4.
В качестве образцов для измерения использовались растворы, приготовленные из стандартных образцов мутности МСО 0400-2002. О стандартных. Значение измерений мутности в биомедицинских исследованиях и применяемые при этом стандартные образцы были рассмотрены в разделе 1.4. Мутность растворов варьировалась в интервале от 0,1 до 1000 ЕМФ (единиц мутности по формазину).
Измерения проводились в диапазоне длин волн от 190 до 900 нм, при спектральной ширине щели в 2 нм и шаге регистрации спектра в 1 нм. Для всех исследованных растворов наряду со спектрами малоуглового рассеяния были измерены также спектры поглощения.
Спектры рассеянного излучения, измеренные по описанной методике, приведены на рис.6.7, а на рис. 6.8 сопоставлены спектры поглощения и рассеяния для одной и той же взвеси.
На спектрах, приведенных на рис. 6.7, обращают на себя внимание максимумы в коротковолновой области. Видно, что коротковолновая часть спектра позволяет достичь лучшей, чем длинноволновая, чувствительности, что особенно существенно для взвесей с малой концентрацией рассеивающих частиц. В то же время при нефелометрическом анализе обычно измеряют светорассеяние на длинных волнах более 550 нм. Это связано с тем, что на более коротких длинах волн возможно поглощение света жидкостью, в которой находится взвесь рассеивающих частиц.
Были проведены измерения спектров рассеяния для взвесей монодисперсных частиц полистирольного латекса диаметрами 1,36 мкм, 2,5 мкм и 5 мкм, приготовленных из калибровочных образцов, синтезированных в Институте высокомолекулярных соединений РАН [174] .
На рис. 6.9 приведен спектр, полученный для взвеси частиц диаметром 1,36 мм, а на рис. 6.10 - тот же спектр после вычитания базовой -линии сопоставляется с результатами расчетов, проведенных с помощью математической модели, описанной в разделе 6.1.
На рис. 6.11 сопоставляются спектры рассеяния, полученные после вычитания базовой линии, для взвесей частиц с диаметрами 1,36 мкм и 2,5 мкм, соответственно. Видна четкая корреляция между диаметром частиц и числом колебаний. Вычитание базовой линии позволило более четко и наглядно наблюдать эти колебания.
Для оценки возможностей предлагаемого метода при анализе окрашенных (поглощающих) жидкостей исследовались взвеси как в воде, так и в растворах КМпС .На рис.6.12а приводится спектр рассеяния, зарегистрированный для одного из образцов, а на рис. 6.12 б - зависимость R(X)i найденная путем совместной обработки спектров рассеяния и пропускания, На этой зависимости четко видны колебания, характерные для взвесей монодисперсных частиц.
Использованные алгоритмы вычитания базовой линии и совместной обработки спектров рассеяния и пропускания приведены в разделе 6.4.
Сопоставления экспериментального спектра рассеяния частиц полистирольного латекса диаметром 1,36 мкм (красный) с рассчитанным по математической модели (синий). Для экспериментального спектра было предварительно произведено вычитание базовой линии.
Измерения проводились для суспензий фибриногена.
Фибриноген - растворимый белок плазмы крови, он относится к так называемым окислительно-модифицируемым белкам. Окисление фибриногена существенным образом влияет на процессы свертывания крови [175]. Исследование соотношения между растворенной и нерастворенной фазами позволяет контролировать этот процесс. На рис. 6.12 представлены спектры рассеяния, полученные в диапазоне 190 - 390 нм на образцах фибриногена с различной степенью окисления. Видно, что наибольшее рассеяние наблюдается для исходного (неокисленного) образца. Образцы были приготовлены в лаборатории биофизических основ патологии Научно-исследовательского института физико-химической медицины.
