Содержание к диссертации
Введение
2. Материал и методика 8
2.1. Объект исследования 8
2.2. Методы исследования 13
2.2.1, Световая микроскопия 15
2.2.2. Электронная микроскопия 17
2.2.3. Биологическое тестирование гонадотропной активности гипофиза 19
2.2.4. Иммунологическое определение активности гонадотропина в сыворотке крови 20
3. Закладка половых желез и гаметогенез
3.1, Данные литературы 23
3.2, Результаты исследований 27
3.2.1. Индифферентное состояние гонад и их дифференциация 28
3.2.2. Оогенез
3.2.3. Сперматогенез 34
3.3, Обсуждение 37
4. Изменения гипоталамуса в репродуктивном цикле
4.1. Данные литературы 41
4.2. Результаты исследований 55
4.2.1. Общая морфология 55
4.2.2. Динамика нейросекреторной активности клеток преоптического ядра 58
4.2.3. Динамика нейросекреторной активности клеток латерального ядра 76
4.3. Обсуждение 86
5. Изменения гонадотропоцйтов в репродуктишом цикле
5.1. Данные литературы 93
5.2. Результаты исследований 106
5.2.1. Общая морфология гипофиза 106
5.2.2. Динамика секреторной активности гонадотро-поцитов 110
5.2.3. Динамика общей гонадотропной активности гипофизов 128
5.2.4. Динамика гилофизарно мозгового индекса 128
5.2.5. Динамика общей гонадотропной активности в сыворотке крови 132
5.3. Обсуждение 133
6. Заключение 141
7. Выводы 150
8. Список литературы 153
- Иммунологическое определение активности гонадотропина в сыворотке крови
- Индифферентное состояние гонад и их дифференциация
- Динамика нейросекреторной активности клеток преоптического ядра
- Динамика секреторной активности гонадотро-поцитов
Иммунологическое определение активности гонадотропина в сыворотке крови
Исследованиям закладки половых желез у рыб, их дифферен-цировки и особенно вопросам гаметогенеза посвящено большое число публикаций. Эти исследования выполнены в значительной степени на объектах рыбоводства или рыболовства. В СССР изучение развития половых клеток было начато в 30-х годах и продолжено в 40-е годы Д.П.Филатовым и С.Н.Дуплаковым (1926; 1938), Интересные и важные исследования выполнил в эти же и более поздние годы В.А.Мейен (1927; 1939; 1944), работы которого, особенно по периодизации развития ооцитов, не потеряли своего значения до настоящего времени. Впоследствии периодизация, предложенная В.А.Сейеном (1939; 1944), была дополнена и уточнена В.Н.Казанским (1949) и другими исследователями (Сакун, Буцкая, 1963 и др.). Основополагающие работы по сперматогенезу рыб выполнены Б.С.Кулаевым (1927; 1928; 1939), В связи с тем, что сведения по гаметогенезу рыб весьма обширны нам придется ограничиться более узким кругом публикаций.
У карповых рыб половые железы закладываются вскоре после вылупления (Натали, Натали; 1947; Курдяева, 1972; Емельянова, 1976). Зачатки гонад представлены половыми валиками или складками, в которых первичные половые клетки располагаются на некотором расстоянии друг от друга. Отмечено, что у карпа в раннем онтогенезе наблюдается присутствие в гонадах как женских, так и мужских половых клеток, а позднее происходит редукция тех или других элементов и гонада развивается В Сторону СаМКИ ИЛИ самца (Davies, Takushima, 1980). Это явление, именуемое ювенильным гермафродитизмом, было отмечено ГЛ.Персовым (1965а, б, 1975) у вьюна
Misgurnus fossilis ( L. ) и ГОрбуШИ Onchorhynchus gorbu sha (Wai.)y рыб, как известно, половые железы сначала находятся в индифферентном состоянии, а позднее происходит их дифференциация в сторону того или иного пола. Различают анатомическую дифференцировку, связанную с изменением морфологии половой железы, и цитологическую, определяемую развитием клеток женского или мужского ряда. У одних рыб анатомическая дифференцировка предшествует цитологической, у других -цитологическая предшествует анатомической (Натали, Натали, 1947; Персов 1962; 1966а; б, в, 1975). У карповых рыб анатомическая дифференциация предшествует цитологической, что выражается в развитии у самок двух брыжеек, прикрепляющих удлиненную гонаду в верхней и нижней частях (Натали, Натали 1947; Емельянова 1976). У самцов половая железа на поперечных срезах имеет овальную форму, и укрепляется она в полости тела лишь одной брыжжейкой. Первичные половые клетки накапливаются в гонаде и через некоторое время начинают делиться,образуя новые генерации гониев. Имеются сведения, что дифференцировка половых желез у рыб и деления огониев и сперматого ( Yamazak і, 1965; Баранникова, 1975). Сведения о закладке и развитии гонад и их регуляции у чукучановых рыб, в том числе и большеротого буффало, в доступной литературе нами не обнаружены. Самки большеротого буффало в условиях Краснодарского края и Узбекистана достигают половой зрелости в возрасте трех лет, а самцы - двух (Ерохина и др., 1980; Макеева, 1980).
В Казахстане созревание происходит позже - самок в 5, самцов - в 3-годовалом возрасте (Батраева 1981; Батраева, Саурская, 1983). В южных районах Украины созревание половых желез у самок отмечено на 5-м году жизни, а самцов на 3-4-м. В более северных районах Украины развитие половых желез буффало задерживается на 2-3 года (Андрюшенко, Юркевич, 1983).
Развитие яичников большеротого буффало в условиях Краснодарского края протекает примерно по следующей схеме (Ерохина и др., 1976). Самки к концу первого лета жизни имеют гонады, в которых преобладают ооциты однослойного фолликула (начало її стадии зрелости), и на этой стадии рыбы зимуют. В течение второго лета по мере роста рыбы, происходит увеличение размеров гонад, ооциты фазы однослойного фолликула значительно увеличиваются. Осенью, в октябре, в яичниках многих 2-летних самок завершается период протоплазматического роста ооцитов и начинается переход ооцитов старшей генерации в период трофоплазматического роста: появляются ооциты в фазах вакуолизации и первоначального накопления желтка (начало Ш стадии зрелости). Летом третьего года жизни в яичниках протекают интенсивные процессы вителлогенеза, гонады резко увеличиваются в размере. Осенью у многих 3-летних самок в яичниках преобладают наполненные желтком ооциты, достигшие дефинитивного размера (ІУ стадия зрелости). Эти самки могут использоваться для воспроизводства следующей весной (Ерохина и др., 1976). Удлинение или сокращение полового цикла и сроков наступления полового созревания у одних и тех же видов рыб, обитающих в различных климатических условиях,происходит за счет I и П стадий зрелости (Мейен, 1944; Кошелев, 1978; 1984), что и наблюдается у большеротого буффало: длительность I и Л стадий зрелости в 2 раза больше в условиях Чиликского прудового хозяйства на юге Казахстана, чем в Краснодарском крае. Длительность Ш и ЗУ стадий зрелости половых желез в обеих зонах одинакова. У большеротого буффало отмечено асинхронное развитие ооцитов, что удлиняет сроки нереста самок и позволяет сохранить ооцитам способность к овуляции, начиная с середины апреля до первых чисел июня (Батрае-ва, 1981). Формирование очередной генерации икры в послене-рестовый период протекает интенсивно: повторно созревающие самки уходят на зимовку с гонадами уже на ЗУ стадии зрелости (Батраева, 1981).
Индифферентное состояние гонад и их дифференциация
В первой половине мая самок для анализа мы не имели. В последней же декаде мая в уловах встречались рыбы, имевшие гонады в разном состоянии: небольшое число самок - на ІУ стадии, у большего числа началась резорбция желтковых ооцитов, у некоторых особей наблюдалась УІ стадия.
Яичники самок, не принимавших участие в нересте, имели желтый цвет. ГСИ их составлял 25,69 + 3,73$. Практически вся гонада содержала наполненные желтком ооциты (рис.3.2,б). Наряду с ооцитами старшей генерации в гонадах присутствуют резервные ооциты цитоплазматического роста. Диаметр желтковых ооцитов составляет 820,05 І 8,25, а диаметр их ядер 222,37 ± 17,43 х 192,5 І 27,5 мкм. (Несколько меньший диаметр клеток у этих самок по сравнению с осенними объясняется меньшими размерами рыб). Контуры ядер извилисты, мембрана образует многочисленные вырости в цитоплазму. По мере приближения к созреванию ядрышки отходят от ядерной оболочки и постепенно перемещаются к центру ядра (рис.3.3,а).Среднее их число составляет 39,75 І 5,5 на срезе. Наблюдаются различные стадии смещения ядер из центрального положения к ани-мальному полюсу, где находится микропиле. Гранулы желтка заполняют всю цитоплазму. Размеры их колеблются от 5,95 до 17,85 мкм. Кортикальные альвеолы располагаются непосредственно под лучистой оболочкой в 4-5 рядов. Размеры их варьируют от 5,95 до 23,8 мкм. Толщина лучистой оболочки составляет примерно 6 мкм, а длина ворсинок хориона колеблется от 18 до 23 мкм (рис.3.3,б).
В конце мая у большинства самок буффало, не выметавших по какой-то причине икру или неиспользованных в рыбоводном процессе в желтковых ооцитах начинаются процессы резорбции. ГСИ таких самок еще высок и составляет в среднем 21,22 І 2,88$ при колебаниях от 14,29 до 24,47$. Резорбция ооцитов начинается с увеличения фолликулярных клеток, разбухания лучистой оболочки, появления в ней разрывов, исчезновения ядра (рис.3.4, а). Диаметр ооцитов в начале резорб-циорного процесса составляет 737,0 22,0 мкм, а толщина лучистой оболочки увеличивается до 8 мкм (рис.3.4,б).
В конце мая, но особенно в июне, у невыметавших икру самок в гонадах отмечаются процессы тотальной резорбции ооцитов (рис.3.4,в). Все вителлогенные ооциты подвергаются атрезии. ГСИ таких самок резко снижается и составляет 6,64 І 1,15$.
В это же время в уловах встречается значительное количество самок, имеющих гонады на УІ стадии зрелости. У этих самок ГСИ составляет 2,40 І 0,19$. В гонадах видны пустые фолликулы и резервные клетки (рис.3.5,а). Иногда встречаются отдельные резорбирующиеся остаточные ооциты. Постовуляторные фолликулы представлены пустыми мешочками, состоящими из сильно увеличившихся в размерах (до 10-12 мкм) фолликулярных клеток с округлыми ядрами и вакуолями в цитоплазме и менее изменившимся удлиненными клетками соединительно-тканной теки (рис.3.5,б). Диаметр наиболее крупных резервных ооцитов составляет 204,6 ±13,22, диаметр их ядер 82,2ІІ6,52x70,07 6,5 мкм. Ядра округлые, ядрышки расположены пристенно, их число составляет 54,1 І 5,84 на срезе. В клетках диаметром 118,75+ 5,17 мкм видны желточные ядра, диаметр ядер у таких клеток составляет 50,0 І 2,80 х 42,0 І 3,37 мкм число ядрышек на срезе 37,53 ± 2,05.
В середине июня у отдельных самок наблюдалось появление вакуолей не только по периферии ооцитов, но и в перинуклеар-ной зоне (рис.3.6). Это связано, видимо, с какими-то нарушениями в развитии ооцитов, поскольку при нормальном течении процесса вакуоли появляются в периферической зоне и постепенно распространяются в сторону ядра. В отмеченном случае этого не наблюдалось. Судьба этих ооцитов осталась не ясной.
Во второй половине июня - начале июля большинство самок имеет гонады П стадии зрелости. Процессы резорбции остаточных ооцитов почти завершились. В гонадах видны ооциты цито-ллазматического роста и атретические тела. Некоторое число ооцитов вступает в стадию начала вакуолизации (рис.3.7,а).
Диаметр этих клеток составляет 218,56 І 21,96, диаметр ядер 80,43 І 3,96 х 69,81 І 4,54 мкм. Ядра овальной формы, видны хромосомы в стадии диплотены ("ламповых щеток"), ядрышки многочисленные, расположены у ядреной мембраны число их на срезе составляет 48,9 + 10,1. Размеры вакуолей колебляются от 6 до II мкм, а толщина лучистой оболочки достигает 4,76 мкм. Основную массу генеративных элементов гонады составляют ооци-ты цитоплазматического роста, еще не вступившие в стадию вакуолизации. Наибольший их диаметр составляет 127,33 І 14,6, диаметр ядер 57,19 І 7,66 х 45,12 3,12 мкм, число ядрышек на срезе 37,7 + 4,1. У отдельных самок уже в начале июля гонады переходят на Ш стадию (рис,3.7,б).
К концу осени гонады самок большеротого буффало, как выметавших икру, так и не выметавших ее, снова переходят на ІУ стадию зрелости, на которой зимуют. Пропуска нерестовых сезонов у буффало мы не наблюдали. Изменение ГСИ на протяжение года и размеров ооцитов на разных стадиях зрелости представлены на рис.3.8.
Динамика нейросекреторной активности клеток преоптического ядра
У радужной форели некоторые авторы описывают иммунореактивные на анти-ЛГ-РГ сыворотку перикарионы и волокна в переднем и промежуточном мозге, в разных участках гипоталамуса ( Goos, Murthanogiu, 1978), в то время как другие исследователи этого не обнаружили ( Dubois et al; 1979; Nozaki, Kobayashi, ,1979).
Как известно, для перехода рыб в нерестовое состояние необходимо наличие комплекса внешних стимулов - температуры, фотопериоды, наличия субстрата, течения и т.д. Сигналы о наличии комплекса этих внешних факторов через органы чувств поступают в высшие отделы ВДС, анализируются и передаются в гипоталамус. Регулирующее влияние гипоталамуса распространяется на эндокринную систему с гипофизом в качестве центрального звена, передается в промежуточную и переднюю доли адено-гипофиза и индуцирует в них выделение тролных гормонов (Гер-бальский, 1966; Баранникова, 1975). дерикарионы реагирующие с антисывороткой на ЛГ-РГ. Положительная реакция на эту сыворотку наблюдается у золотой рыбки в более каудально лежащих перикарионах вентро-латеральной зоны преоптического ядра вдоль вентро-ллатеральной преолти-ческой бухты и в перикарионах латерального ядра feah et al; 1982; Peter , 1982a), В опытах по пересадке гипофизов в разные участки тела обнаружено, что выделение ГТГ может осуществляться соответствующими клетками вне контакта с нейро-секреторными элементами гипоталамуса, либо автономно, либо под гипоталамической стимуляцией по нейроваскудярным каналам ( Chamboiie et al ; 1978). При пересадке гипофиза в полость третьего мозгового желудочка уровень ГГГ в крови оказывается выше, чем при пересадке в другие места ( Peter et.ai;I982), что указывает на присутствие в цереброспинальной жидкости какого-то фактора, угнетающего спонтанный выброс ГТГ.
Для выяснения механизма гипоталамической регуляции репродуктивной функции костистых рыб интересны результаты,полученные с помощью иммуноцитохимических методов. Использование сыворотки против ЛГ-РГ млекопитающих показало возможность выявления иммунореактивных клеток в переднем и промежуточном мозге (в области воронки) радужной форели) ( Dubois et al., 1978). Иммунореактивные волокна и перикарионы обнаружены в ольфакторетинальном ядре цихлидовых и цент-рархидовых рыб ( Munz et al; 1982), у платипецилии Xiphophorus maculatus ( Gunther ) ВОЛОКНа И Перика рионы, реагирующие с антисывороткой на лТ-ЕГ, обнаружены в ольфакторетинальном, латеральном и преоптическом ядрах ГТ-РГ активность доказана в экстрактах гипоталамуса и переднего мозга некоторых видов костистых рыб ( Breton et al; 1971; Crim et al; 1976; Grim, Evans, 1980). У трески, Gadus morhua L. выделены 3 ( Barnet et a 1; 1982)-, а у американской камбаЛЫ, Pseudopleuronectes americanus Walb. 2 ЛГ-РГ- подобные фракции ( Idler, Grim, 1982). При помощи иммуноцитохимических методов у многих рыб определены участки мозга, содержащие реагирующие с антисыворотками на ЛТ-РГ млекопитающих элементы. Установлено, что экстракты гипоталамусов костистых рыб и млекопитающих, синтетический ЛТ-РГ и аналоги ЛГ-РГ стимулируют выброс ГТГ in vivo и in vitro (Ball, 1981; Peter, 1982, 1982 а). При этом оказывается, что, как правило,дробные инъекции ЛГ-РГ или его аналогов эффективнее стимулируют рост уровня ГТГ в крови нежели однократное введение в той же или большей дозировке ( Peter, 1980). Кроме того, ответ гипофиза на воздействие ЛТ-РГ существенно зависит о температуры, интервала между инъекциями и дозой ( Lin et al; 1982, Peter, 1982a). Сезонное различие в ответе гипофиза на введение ЛГ-РГ И ЄГО аналога Найдены у КуМЖИ Salmo trutta L. (Grim, Cluett, 1974), карпа ( Weil et al;I975), радужной форели ( Weil et al; 1978) И ЗОЛОТОЙ рыбКИ ( Lin et al; 1982). Bo всех случаях наибольший выброс ГТГ. Отмечается у рыб близких к нересту, когда развитие гонад завершено или близится к завершению. У незрелых рыб ответ гипофиза весьма слабый. С помощью ЛГ-РГ и его аналогов удается довольно успешно вызывать созревание и овуляцию у некоторых видов костистых рыб - у золотой рыбки ( Lam et al; 1975; Peter, 1982, 1982a), айю Plecoglossus altivelis Teram.et Schl.(Hirose, Ishida, 1974a) , КамбаЛЫ Limanda yokohamae ( Gunther ) И бычка Acanthogobius flavimanus ( Temm. et Schl. ) ( Aida et al; 1978), у белого амура Ctenopharyngodon idella (Val. ) , черНОГО aMypaMylopharyngodon piceus (Rich. ) белого Hypophthalmichthys molitrix ( Val. ) и пестрого толстолобиков ( Chinese scientists, I977;I977a, Jiang et al; 1980). Однако при введении этих нейро-пептидных гормонов рыбам для получения эффекта требуется гораздо более высокие дозы, чем при стимуляции половой функции у млекопитающих. Предполагается, что меньшая восприимчивость рыб к ЛГ-РГ может быть вызвана наличием контроля вывода гонадотропина со стороны ингибирующего фактора (ГТ-ИГ), вырабатывающиеся, 1980), или таксономической специфичностью ЛГ-РГ. Таким образом, вопросы о месте выработки ГТ-РГ в гипоталамусе костистых рыб, о путях контроля гонадотропной функции гипофиза со стороны гипоталамуса и количестве гормональных факторов, участвующих в этих процессах, до конца не решены, что подчеркивает актуальность всестороннего изучения физиологии гшюталамо-гипофизарной системы, и большую практическую значимость этих работ.
Динамика секреторной активности гонадотро-поцитов
Стадии зрелости состояние нейросекреторных клеток преолтического ядра характеризуется усилением интенсивности окраски в перикарионах крупноклеточной части (рис. 4.10,6). Клетки мелкоклеточной части ядра дегранулированы и практически не воспринимают окраску Ш.Ф, за исключением наиболее крупных клеток. Расположение секреторных клеток в ядре самок становится рыхлым, по-видимому, в результате быстрого уменьшения их размеров. Количество экстрацеллюляр-но расположенных Гомори-положительных гранул меняется незначительно (2-6 на срезе). В отростках секреторных клеток мелкоклеточной части и по ходу преоптико-гипофизарного тракта видны многочисленные гранулы и глыбки нейросекреторного вещества. Средняя площадь клеток снижается в крупноклеточной части в 1,24 раза, а в мелкоклеточной - в 1,23 раза, ядерно-плазматическое отношение при этом несколько увеличивается в 1,11 и в 1,16 раз, соответственно (табл. 4.1). В размерном составе клеток происходят изменения, выражающиеся в увеличении числа мелких клеток. Наиболее ярко эта тенденция выражена в крупноклеточной части. Здесь полностью исчезают крупные клетки площадью 660-770 мгаиг, появляется группа мелких клеток площадью 60-110 мга/г, в то время как количество клеток площадью 120-170 мкиг увеличивается в 28,7 раз (рис. 4.8,е, 4.9.е). Выявленные различия в размерных распределениях клеток преоптического ядра самок с гонадами У и Л стадий зрелости оказались недостоверными.
Не принимавших участие в нересте и не использованных в искусственном воспроизводстве в конце июня наблюдается тотальная резорбция вителлогенных ооцитов. У таких рыб наблюдаются определенные сдвиги и в морфо-функционалъ-ном состоянии клеток преоптического ядра, Нейросекреторные клетки находятся на различных этапах секреторного цикла и, хотя функциональное состояние их различно у разных особей в зависимости от протекания процессов резорбции, в целом в ядре преобладают светлые, слабо окрашивающиеся ПА.Ф, клетки. Наблюдается перемещение глыбок нейросекрета в аксоны и в дальнейшем в преоптико-гипофизарный тракт. У некоторых особей в зоне ядра выявляются гигантские тела Герринга. Количество Гомори-положительных экстрацеллюлярно расположенных гранул возрастает (3-5 на срезе). Средняя площадь клеток крупноклеточной части практически не меняется, в то время как площадь клеток мелкоклеточной части уменьшается в 1,22 раза (Р 0,05), (табл. 4.1). Ядерно-плазматическое отношение возрастает в клетках мелкоклеточной части в 1,15 раз, а в крупно-клеточной оно остается на уровне такого отношения у самок с гонадами на ІУ стадии зрелости. Распределение клеток по размерным группам в крупноклеточной части почти не отличается от такого у самок с гонадами на ІУ стадии зрелости, в то время как в мелкоклеточной части наблюдается исчезнование крупных клеток площадью 360-470 мкм и резкое уменьшение (в 3,25 раз) доли клеток с площадью 300-350 мкм2 (рис.4.8,ж; 4.9,ж). Распределение клеток по размерным группам в мелкоклеточной части ядра у самок, в гонадах которых происходит тотальная резорбция вителлогенных ооцитов, достоверно отличается (Р 0,01) от такового у рыб с гонадами на 17 стадии зрелости.
В конце июня-начале июля большинство самок имеет гонады, находящиеся на П стадии зрелости. У таких самок в крупноклеточной части ядра преобладают процессы накопления нейросекрета. Клетки обнаруживают умеренную активность, перикарионы их интенсивно воспринимают окраску ЇЇА.Ф. В мелкоклеточной части окраска клеток слабая и преобладают процессы выведения - из клеток довольно активно выводится нейросекреторный материал в аксоны и далее в преоптико-гшюфизарный тракт (рис.4.II). По сравнению с состоянием нейросекреторных клеток у самок с гонадами на УІ стадии зрелости, несколько изменяется распределение клеток по размерным группам в крупноклеточной части (Р 0,05). Резко уменьшается доля мелких клеток площадью 60-170 мгамг, увеличивается доля клеток площадью 180-290 мгаиг и немного уменьшается процент клеток наиболее крупных размерных групп (рис.4.8,з). Средняя площадь элементов крупноклеточной части, а также их ядерно-плазматическое отношение незначительно отличаются от таковых самок с гонадами на УІ стадии зрелости. Средняя площадь клеток мелкоклеточной части, а также их ядерно-плазматическое отношение уменьшается в 1,1 раз. Распределение элементов мелкоклеточной части по размерным группам незначительно отличается от такового у самок УІ стадии зрелости (рис.4.9,з).
Уосенних самцов, гонады которых находятся на Ш-ІУ и ІУетадиях зрелости состояние преоптического ядра сходно в обеих его частях и близко к состоянию этого ядра у самок с гонадами Ш-ІУ стадии зрелости. В ядре доминируют слабо окрашенные ПА.Ф клетки (рис.4.12). В зоне преоптического ядра не видно Гомори-положителъного, расположенного экстрацеллюляр-но секреторного материала. Состояние преоптического ядра в целом соответствует состоянию повышенной активности. Средняя площадь клеток крупноклеточной части у самцов ІП-ІУ стадии зрелости составляет 230,54 мга/г, а в мелкоклеточной части - 119,08 тшг Ядерно-плазматическое отношение в это время достигает наибольшего значения в обеих частях ядра (табл. 4,2). Основная масса клеток в мелкоклеточной части ядра сос-редоточена в размерных группах 60-110 мкм (56,0%) и 120-170 мкм2 (27,95%), а в крупноклеточной части в размерных группах 180-230 мкм2 (32,97%) и 240-290 мкм2 (24,21%)
