Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор Бактериальная геморрагическая септицемия (аоромопоз) рыб и методы сё профилактики 8
2. Выбор направления исследований л
3. Теоретические и экспериментальные исследования 51
3.1. Материалы и методы исследований 51
3.1.1. Методы эпизоотических, клинических и патолого-апатомических исследований 51
3.1.2. Методы экспериментального испытания протсктивпого эффекта бактсрина 53
3.1.3. Микробиологические методы исследования
3.1.4. Иммунологические методы исследования
3.1.5. Математические и статистические методы 67
3.2, Исследование эффективности применения пробиотика субалина для профилактики бактериальной геморрагической септицемии карпа 69
3.2.1. Проверка протекивпого эффекта субалина в экспериментальных условиях 69
3.2.2. Производственные испытания протсктивпого действия субалина в тсплоподиом садковом хозяйстве 70
3.2.3. Производственные испытания иротектишюго действия субалииа в условиях прудового карпового хозяйства 73
3.2.4. Способ изготовления гранулированного комбикорма с субалином 76
3.2.5. Контроль качества препарата субалииа, выпускаемого различными производителями 78
3.2.6. Исследование иммуностимулирующего действия субалииа 80
3.2.7. Испытания субалииа в условиях прудовых карповых хозяйств в 2001 г 82
3.3. Исследование протективного действия и иммуногенного эффекта бактсрипа из Aeromonas sobria штамма 77-18 92
3.3.1. Испытания бактсрипа в экспериментальных условиях
3.3.2. Испытания бактсрипа в условиях интенсивного прудового рыбоводства 98
3.3.3. Испытания бактерина в условиях тепловодного садкового хозяйства 111
3.4. Обобщение и оценка результатов исследования 118
Выводы 124
Заключение I2,f»
Список использованной литературы 127
- Методы эпизоотических, клинических и патолого-апатомических исследований
- Производственные испытания протсктивпого действия субалина в тсплоподиом садковом хозяйстве
- Контроль качества препарата субалииа, выпускаемого различными производителями
- Испытания бактерина в условиях тепловодного садкового хозяйства
Введение к работе
Развитие аквакультуры, в целом, и прудового рыбоводства, в частности,
обеспечивается интенсификацией биотехнологий культивирования
гидробиоптов. Это предусматривает использование высоких плотностей посадки рыбы, что влечет за собой значительное загрязнение окружающей водной среды органическими веществами.
В условиях высокой антропогенной нагрузки на прудовую экосистему естественные механизмы регуляции численности популяций паразита и хозяина не срабатывают. Одним из важнейших биологических факторов, нарушающих нормальное течение рыбоводного процесса, становятся инфекционные заболевания культивируемых рыб.
Для прудовых хозяйств центральных и южных регионов Российской Федерации, выращивающих товарного карпа по интенсивной технолог*,.'., наиболее актуальной является проблема бактериозов рыб, обусловленных грам негативны ми бактериями, среди которых лидирующее место занимают подвижные аэромонады. Вызываемый ими язвенно-геморрагический синдром характеризуется терминами: бактериальная геморрагическая септицемия (ЕГС), аэромоноз, краснуха или краснухоподобное заболевание.
По данным за 1997 год 124 предприятия Росрыбхоза являлись неблагополучными по аэромонозу рыб, а согласно информации ветеринарной службы на территории Российской Федерации заболевание аэромонозом зарегистрировано в 28 регионах, 87 пунктах (Афанасьев, 1996; Катичева, 19^/; Стрелков и др., 1997; Яременко и др. 1997). В 1999 году неблагополучных/!! признаны 39 пунктов, и 37 - к началу 2003 гола (Яременко, Мачнсв, 2000; Яременко, Селиверстов, 2003). По тем же данным заболевания рыб бактериальной этиологии по своему распространению уступают некоторым паразитарным заболеваниям, но значительно превосходят их по наносимому
ушсрбу, складывающемуся из прямой гибели рыб и снижению темпа роста инфицированных особей, которое имеет место, даже при отсутствии клинических проявлений.
Микроорганизмы - этиологические агенты БГС являются условг--патогепными для рыб и находятся с ними в постоянном контакте. Представители родов Aeromonas и Pscudomonas входят в состав нормофлоры воды. Одни бактерии семейства Enterobactericeac - нормальные обитатели кишечника рыб, другие - в значительном количестве вносятся в прудовую экосистему с обсеменёнными гранулированными комбикормами.
Реализация потенциала иатогенности данных микроорганизмов обусловливается, с одной стороны, тем, что эвтрофировашшя водная среда интенсивно эксплуатируемого рыбоводного пруда благоприятна для наращивания их численности и ферментативной активности. С другой сторо;м - наличием переуплотненной популяции рыб, чья антибактериальна1! резистентность значительно снижена нахождением в неблагоприятных условиях окружающей среды, возникающих из - за несовершенства существующих биотехнологий культивирования рыб. Сюда можно отнести неблагоприятный гидрохимический режим, токсичные, богатые условио-патогепными микроорганизмами комбикорма, большое количество ручных манипуляций (хендлинг) и т.д.
Помимо растущей интенсификации, современная ситуация по заболеваемости прудового карпа БГС обусловлена недостаточным объемом и. и полным отсутствием мероприятий, призванных снижать органически ;о нагрузку на экосистему рыбоводного пруда и сдерживать размножение условно-патогенных микроорганизмов.
Традиционным, прочно вошедшим в практику рыбоводства методом борьбы с болезнями рыб бактериальной этиологии, является их химиотерапия. Но в настоящее время применение антибиотиков и антибактериальных препаратов сильно ограничено из-за формирования среди бактериальных
патогенов антибиотикорсзистентных штаммов, развития под действием
препарата иммунодефицита у рыб, возникновения еще более глубок. <
изменений в экосистеме пруда. Все это создает благоприятные условия для
формирования суперинфекции. Немаловажным является и загрязнение
медикаментами конечной пищевой продукции, что значительно ограничивает
возможности ее реализации. В условиях растущего насыщения
потребительского рынка продукцией аквакультуры наиболее
конкурентоспособной окажется экологически чистая, выращенная без применения антибиотиков рыба.
В данной ситуации альтернативой химиотерапии может стать
иммунопрофилактика БГС рыб. В мировой практике накоплен значитслып. л
опыт по повышению антибактериальной резистентности рыб, сохранению їй:
поголовья и поддержанию высоких темпов роста при помощи пробиотиков и
вакцин. Как в нашей стране, так и за рубежом ведутся работы по адаптации в
аквакультуре пробиотических препаратов, созданных первоначально для
теплокровных животных. К таким препаратам относится пробиотик субалии
(Vetosubalinum), действующим началом которого является сенная палочка
Bacillus subtilis, штамма 2335, успевший хорошо зарекомендовать себя не
только в ветеринарной практике, но и в индустриальном рыбоводстве при
терапии заболеваний осетровых и лососевых рыб преимущественно смешанной
этиологии. '''
Получение вакцинного препарата против подвижных аэромонад, эффективного при заражении не только гомологичным, но и гетерологичными штаммами, длительное время наталкивалось на трудности, обусловленные их высокой антигенной гетерогенностью. Создание в 1987 году группой специалистов ВІІИИПРХ и Карельского филиала РАН биохимической вакцины ВЮС-2 для инъекционного способа введения продемонстрировало принципиальную преодолимость этих трудностей. Продолжением практических разработок в области специфической иммунопрофилактики БГС
рыб стало создание на основе того же штамма - Acromonas sobria 77-!8 бактерина с иммерсионным способом ішсдспия, для вакцинации больших групп товарных карпов.
Целью работы было продолжение разработки экологически чистых методов профилактики бактериальной геморрагической септицемии (аэромоноза) рыб. При этом предусматривалось решение следующих задач.
1. Изучение эффективности применения иробиотика - субалина на основе
Вас. subtilis штамма 2335 при профилактике и терапии БГС (аэромоноза) карпа
в условиях интенсивного прудового рыбоводства.
2. Проведение в экспериментальных условиях испыташп
разрабатываемого бактерина из штамма A. sobria 77-18. Исследовать защитный
эффект бактерина против гомологичного и гетерологичных штаммов
подвижных аэромонад. Проследить динамику развития иммунного ответа
карпов на вакцинацию.
3. Провести испытания протсктивного действия и иммуногешюго
эффекта, оказываемых.бактерипом в опытно-производственных условиях.
Автор принимал личное участие в проведении теоретических и экспериментальных исследований, результаты которых представлены в диссертации. Материалы по первичным экспериментальным испытаниям пробиотика и вакцины любезно предоставлены моим научным руководителем Л.II. Юхимеико. Все микробиологические исследования проведены совместно со старшим научным сотрудником лаборатории ихтиопатологоии ФГУП "ВНИИПРХ" к.б.п. Л.Н. Юхименко и научным сотрудником той же лаборатории, к.б.п. Л.И. Бычковой. Значительную помощь в сборе первичного материала в опытно-производственных условиях оказали трудовые коллективы ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" и экспериментально-производственного отдела ФГУП "ВНИИПРХ" "Якоть".
Методы эпизоотических, клинических и патолого-апатомических исследований
Все работы проведены в лаборатории ихтиоиатологии ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства" в период с 1999 г. по 2003 г. Иммуногенные и протективныс свойства бактсрина исследовались в аквариальных и опытно-производственных условиях - на прудах экспериментально-производственного отдела ВНИИПРХ "Якоть". Дополнительное испытание в производственных условиях проведено на тепловодном садковом хозяйстве "Нептун" НТЦ "Селекцентр". Первые испытания профилактического и терапевтического эффекта применения комбикорма, содержащего пробиотик субапин (ОАО "Днеирофарм"), проведены в Чсрспецком садковом хозяйстве Тульской области. На базе ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" проходили систематические исследования профилактического и терапевтического действия пробиотика в производственных условиях. Дополнительный материал собирали в Лотошинском рыбхозе. Объектом исследования служили разновозрастные карпы, вода рыбоводных прудов и пробы лечебного комбикорма с субалином, Эффективность разрабатываемых иммунопрофилактических мероприятий напрямую характеризуется благополучием рыбоводного пруда, в котором проводятся исследования по бактериальной геморрагической септицемии культивируемого карпа. При сборе данных, необходимых для оценки эпизоотической ситуации на водоёме, был использован комплекс взаимосвязанных методов, включающий в себя: клинический осмотр рыбы, се патолого-анатомическое вскрытие, исследование микробиоцепоза рыбы и среды ее выращивания - прудовой воды, оценку ряда иммунологических показателей культивируемого гидробионта.
При клиническом осмотре обращали внимание па уровень двигательной активности рыб, общий внешний вид, упитанность, состояние и цвет кожных покровов, глазного яблока, ротовой полости, наличие экто- и эндопаразитов. Регистрировали геморрагии или петехии на поверхности тела, наличие некротических участков, язв, рубцов, участков уплотнённой слизи или сухость покровов тела, кровоизлияния в плавники, ерошение чешуи, экзофтальмиго и другие клинические признаки, характерные для септицемии, вызванной грамм стати вны ми бактериями. После просмотра не менее 100 экземпляров отловленной рыбы определяли процент особей, имеющих клинические признаки. Для дальнейшего изучения отбирали по несколько карпов различного клинического статуса таким образом, чтобы общая численность выборки была не менее 10-ти экз. Патолого-анатомическое исследование проводили параллельно с отбором материала для микробиологических и иммунологических исследований. Осмотр начинали с брюшной полости, определяли положение и внешний вид органов, состояние брюшины, наличие экссудата. При извлечении и обследовании внутренних органов обращали внимание на наличие спаек и сращений, характерных признаков перенесённого воспалительного процесса.
Осматривая органы, регистрировали их форму, величину, цвет, консистенцию, гиперемию или, наоборот, анемию наличие кровоизлияний, гнойных или некротизированных участков. Во время вскрытия кишечника отмечали состояние его слизистой оболочки, цвет, отёчность, истончение, кровоизлияния, изъязвления. К анализу эпизоотической ситуации привлекались сведения по основным гидрологическим и гидрохимическим показателям рыбоводных водоёмов, наличию стрессируюших факторов, как естественного, так и антропогенного происхождения, изменениям в биотехнологиии культивирования рыбы. Эпизоотологическос исследование завершали рассмотрением полученных данных в комплексе с микробиологическими и иммунологическими показателями. Перспективность разрабатываемых вакцин в значительной степени определяется её защитным эффектом, который исследуется Б экспериментальных условиях. Для узучения протсктивных свойств использовали гомологичный штамм Л. sobria 77-18 и два высоковирулентиых гетсрологичпых штамма Л. sobria 70-23 и Л. sobria 70-24, выделенных от карпов при обследовании одного из рыбхозов Московской области. Вышеуказанные.штаммы пассировали через сеголетков карпа массой 35-40 г, содержавшихся в 90-литровых пластиковых аквариумах при температуре воды 20 С. Для их заражения использовали смыв суточной агаровой культуры изотоническим раствором хлорида натрия . Идентичность рсизолированных штаммов первоначально подтверждали исследованием их аптибиограмм. Заражение сеголетков с последующей реизолянией культуры проводили восьмикратно. Каждая из 3-х опытных (вакцинированных) и соответствующие им контрольные группы рыб были заражены определённым штаммом аэромонад. Биологические свойства пассированных штаммов использованных в биопробе представлены в таблице 7. Количество жизнеспособных бактериальных клеток в суспензии определяли путём высева ряда десятикратных разведений на поверхность о т эритрит-агара и составила 4,7 х 10 ± 2,1 х 10 кл/экз. Полученные по окончанию испытания бактсрина результаты представлены в виде индекса зашиты. Одними из основных параметров, учитываемых при выяснении эпизоотической обстановки на экспериментальном рыбоводном водоёме, является микробиоценоз выращиваемых рыб и среды их обитания прудовой воды.
Проведение подобных исследований диктуется необходимостью учёта уровня контаминации карпов грамнегативными условно-патогенными бактериями и обусловливающих его микробиологических параметров окружающей среды. Это весьма важно для опенки физиологического состояния рыб и уровня их резистентности. Для первичного выделения микроорганизмов использовали плотные пластинчатые питательные среды позволяющие определить количество микроорганизмов в исследуемом материале и получить объективную картину видового состава микробиоценоза. Для отбора материала от рыбы се асептически вскрывали. Затем стерильно иссечённые образцы ткани печени и почек растирали по поверхности элективной среды Эндо {ГНЦ прикладной микробиологии, РФ), предназначенной для выделения аэромонад (p. Acromonas), псевдомонад (р. Pscudomonas), неферментирующих щёлочеобразователей (pp. Moraxella и Acinetopbacter) и бактерий группы кишечной палочки (сем. Enterobacteriaceae). Пробы воды отбирали в стерильный флакон в фиксированной точке пруда, удалённой от кормовых точек и тоневого участка. Посев производили параллельно на среду
Эндо и эритрит-агар (НПО «Питательные среды», РФ) - среду универсального назначения, для определения общего микробного числа (ОМЧ) воды. На каждую чашку Петри со средой наносили 0,05 мл исследуемой воды и тщательно растирали стеклянным шпателем. Все посевы инкубировали в термостате при 25-37 С в течение 72 часов с ежесуточным учётом выросших колоний. По завершении подсчитывали общее количество выросших колоний, полученный результат выражали в КОЕ/мл (колониеобразующие единицы, содержащиеся в одном мл исследуемой воды). В посевах материала, взятого от рыбы, оценивали массивность роста от единичного до сливного. При просмотре выросших колоний из каждого исследуемого образца отдельно регистрировали каждый представленный культурально-морфологический тип. Для дальнейшей идентификации отбирали по несколько изолированных колоний каждого типа. Исследуемые штаммы засевали на дифференциально-диагностическую среду Клиглера (ГНЦ прикладной микробиологии, РФ). После 24-х часовой инкубации культуру подвергали тесту на наличие фермента цитохромоксидазы по методу Эрлиха
Производственные испытания протсктивпого действия субалина в тсплоподиом садковом хозяйстве
Первое испытание субалина в производственных условиях было проведено в 1999 г. на базе Чсрспецкого тепловодного садкового хозяйства Тульской области. В воде садков количество микроорганизмов доходило до 2,7 х 10 КОЕ/мл. В, микробном пейзаже доминировали грамнегативпые условнопатогенпые бактерии - представители сем. Entcrobactcriaceae, НФЩ, капсулообразуюшие псевдомонады и единичные аэромонады. Преобладание эитер о бактерий над аэромонадами свидетельствовало о чрезвычайно высоком уровне органического загрязнения водной среды. При данных условиях у культивируемых карпов наблюдали обширные геморрагии и изъязвления поверхности тела, экзофтальмия и кровоизлияния в глазном яблоке, участки локального ерошсиия чешуи. При патолого-анатомическом вскрытии в брюшной полости обнаруживали экссудат, регистрировали анемию печени, её мраморную окраску и рыхлую консистенцию, селезенка была отечная, с закругленными краями, сероватого цвета. Из паренхиматозных органов рыб, подвергнутых микробиологическому исследованию, выделяли нсендомопады, НФЩ, бактерии группы кишечной палочки (ВГКП) и авирулситные и умеренно вирулентные штаммы аэромонад Л. hydrophila и A. veronii.
На основании проведенных исследований был поставлен диагноз - бактериальная v геморрагическая септицемия. Пестрота микробных ассоциаций, высеваемых от рыб, и наличие в них авирулентных аоромопад свидетельствовало о сильном снижении иммуно-физиологического статуса культивируемых карпов. После изучения антибиограмм основных этиологических агентов заболевания был проведён курс химиотерапии. После кратковременного улучшения гибель карпов возобновилась, а в микробиоценозах рыбы и воды доминирующее место заняли вирулентные и вьісоковирулсі гшые аэромонады, относящиеся к видам A. hydrophila, A. caviac и A. sobria. На этом неблагоприятном фоне было решено провести испытание субалина, который вводился в основной рацион из расчета 105 спор в 1 г корма. Исследование продемонстрировало высокую активность субалина в комбикорме и его равномерное перемешивание с основными компонентами. По микробиологическим параметрам качество корма признано удовлетворительным.
Опытному кормлению с пробиотиком подвергли товарных карпов, содержавшихся одном из садков. Рыбы были дважды отсортированы но клиническим признакам, т.е. у всех были с ярко выраженные поражения. Комбикорм с субалином давали двумя курсами - по 3 дня каждый с перерывом в 4 дня. Контролем служил садок, где карпы получали стандартный рацион. За время наблюдения (21 день) в опытной группе погибло 8 особей, а в котролыюй - 20. Индекс защиты применённого медикамента составил 60%. Было проведено подробное исследование рыб из каждой группы, взятых по методу случайной выборки. Сравнительный анализ уровня бактериальной обссмспённости паренхиматозных органов, клинической и иатолого По характеру клинических, патолого-апатомических признаков и уровню бактериальной контаминации внутренних органов отмечены положительные сдвиги а состоянии рыб, получавших корм с пробиотиком, который привел к исчезновению клинических признаков и нормализации состояния внутренних органов. В посевах соскобов со слизистой кишечника карпов опытной группы колонии Вас. subtilis обнаруживали спустя 10 дней после окончания применения препарата, что свидетельствовало о высокой колонизирующей активности пробиотика.
Необходимо подчеркнуть, что эксперимент проведён в чрезвычайно жестких условиях: заболевание протекало в острой форме и рыба была сильно поражена, а вода содержала большие количества условнопатогенных микроорганизмов, находящихся в условиях, благоприятных для наращивания вирулентности. ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" Московской области считается неблагополучным но аэромопозу карпа. Для поддержания эпизоотической ситуации на приемлемом уровне с профилактической и терапевтической целью па хозяйстве постоянно использовали фуразолидон и левомицетин (по несколько курсов за сезон). Ко второй половине 90-х годов эффективность от применения химиопрепаратов резко снизилась, а из воды рыбоводных прудов и паренхиматозных органов карпов выделяли аэромонады слабочувствительные и резистентные к фуразолидону и левомицетину. Первое комплексное обследование прудов Центрального участка, проведенное в 1999 г., выявило крайне неблагоприятные для выращивания рыбы микробиологические параметры водной среды. При значительной обшей бактериальной обссмсненности от 5 х 1 Г до 4,1 х 10" КОЕ/мл, наблюдалось доминирование аэромонад, энтсробактсрий (в том числе Escherichia coli с высокой ферментативной активностью) и псевдомонад. Микробный пейзаж воды указывал на сё сильное органическое и имевшее место свежее фекальное загрязнение. Ситуация осложнялась использованием tic совсем доброкачественного корма, способствовавшего снижению антибактериальной резистентности рыбы.
Действие на рыбу комплекса стрессоров и наличие в воде большого количества грамнегативных патогенов, приводило к бактериальной контаминации внутренних органов. Инфекционный процесс был клинически выраженным. При осмотре рыб отмечали: сухость и изъязвление поверхности тела, наличие островков плотной сероватой слизи. При иатолого-апатомическо.м вскрытии обнаружен отек слизистой оболочки кишечника и ее гиперемия, стенки кишечника рвались при малейшем нажатии, в паренхиматозных органах отмечали значительные патологические изменения. На основании проведённых исследований поставлен диагноз - БГС. Проведенный курс лечебного кормления с левомицетином привёл лишь к кратковременному улучшению эпизоотической ситуации, затем обстановка на хозяйстве снова резко ухудшилась. В этих условиях в одном из прудов впервые был проведен 6-ти дневный курс кормления рыбы с субалином. Препарат вносился в комбикорм из расчета 8 г/ тонну комбикорма 1 г. Предварительный анализ продемонстрировал высокую активность субалина во всех пробах комбикорма и его равномерное распределение по гранулам. По основным микробиологическим параметрам качество корма признано удовлетворительным. Данные по эпизоотческой ситуации в опытном пруду до и после курса кормления приведены в таблице 12.
Контроль качества препарата субалииа, выпускаемого различными производителями
Параллельно с субалином, выпускаемым ОАО "Дпенрофарм", хорошо зарекомендовавшим себя в ходе экспериментальных и производственных испытаний, аналогичный препарат начало выпускать , Новосибирское предприятие МИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор". Нами были проведены сравнительные исследования различных партий этих препаратов (табл. 14). Данные, полученные в результате проведённых исследований, позволили сделать вывод о предпочтительности использования пробиотика производства ОАО "Днспрофарм". Препарат хорошо растворим в воде, что немаловажно для его успешного введения в корм. Количество жизнеспособных спор действующего начала превосходит минимально допустимые количества, указанные в документации, а пробиотичсскис микроорганизмы обладают высокой антагонистической активностью по отношению к основным группам условнопатогенпых для рыб м и кроорганизм ам. Содержание спор в субалине, изготовляемом ГНЦ ВБ "Вектор", в несколько раз ниже нормативного, помимо этого активность пробиотика была значительно снижена присутствием посторонних микроорганизмов. В одном случае это были бактерии, идентифицированные как Bacillus sp., не обладающие антагонистической активностью и присутствующие в количестве, сопоставимом с количеством действующего начала препарата (1,49 х 109). При анализе партии субалипа 040800 обнаружена его контаминация высокоактивным бактериофагом, который в процессе инкубации оказывал лизирующее действие на колонии Вас. subtilis.
Для более полной характеристики биологического действия субалипа в 2000 г. нами было предпринято изучение его влияния на уровень специфических антител сыворотки крови карпов, которое могло быть достигнуто за счёт нормализации физиологических процессов, протекающих в организме рыбы. На Центральном участке ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" сыворотки отбирали у 4-х групп карпов; 1-2 - из пруда №3, где рыба получала корм с субалином - мелкие (250-ЗООг) и крупные (500-600г). 3 - из пруда -Nbla, где средняя масса рыбы составляла 450 г и она так же получала корм с субалином, но содержалась при более высоких плотностях посадки. 4 - из так называемого "министерского" пруда, где сидела крупная (до 1 кг) рыба дли спортивного рыболовства, не получавшая субанин. Группы 5 и 6 - двухлетки карпа того же возраста чешуйчатые и зеркальные из единственного пруда Образцовского участка ОАО "Бисеровский рыбокомбинат", получавшие комбикорм с субалином. рыбхозе "Лотошинский" исследовались одноразмерные сеголетки, которые в группе 7 получали комбикорм с субалипом, а в группе 8 -стандартный рацион. Результаты исследований приведены в таблице 15. В результате исследований было установлено положительное влияние иробиотика на уровень антитслообразования, которое играет важную роль в защите организма рыбы от бактериальных патогенов. Статистически достоверные различия между средними титрами специфических антител установлены между одноразмерными рыбами цеіпрального участка ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" (группы 2 и 4) Р 0,01. У более мелких или находящихся в более неблагоприятных условиях (повышенные плотности посадки), но получавших субалип рыб также обнаружены циркулирующие антитела в достаточно высоких титрах. 82 Различий между уровнями аптителообразования в группах разнопородных карпов с Образцовского участка не обнаружено. При исследовании интенсивности аптителообразования у сеголетков рыбхоза "Лотошинский" устаповлдсно, что средний титр циркулирующих ангглютининов в группе карпов получавших субалии статистически достоверно больше (Р 0,05), чем в контроле, получавшем стандартный рацион. Положительные результаты, полученные в ходе предварительных испытаний 1999 г., и иммунологических исследований, проведённых в 2000 г., позволили приступить в 2001 г. к более маштабным производственным испытаниям субалина. В ОАО "Бисеровский рыбокомбинат" кормом с препаратом кормили карпов товарных групп, а и Лотошинском рыбхозе- сеголетков. Рыбхоз Лотошинский считается неблагополучным по аэромонозу с 1989 г., но, благодаря комплексу проводимых ветсрипарно-саиитарных мероприятий, заболевание товарных рыб в острой форме не наблюдалось с 1995 года. Основной проблемой хозяйства являлась выживаемость сеголетков в летний период. При обследовании рыб выявлялись патологические изменения во внутренних органах и их контаминация подвижными аэромонадами. С целью оценки эффективности применения субалина, для улучшения иммупо-физиологического статуса сеголеток карпа и стабилизации эпизоотической ситуации по бактериальным заболеваниям в выростных прудах хозяйства в течение рабоводпого сезона 2001 года проводилось кормление рыб комбикормом с пробиотиком. опытных прудах $&\2 и №13 с 30.07. по 4.08. был проведён курс кормления карпов с субалином. Пруд №14 оставлен в качестве контроля.
Посадка сеголетков осуществлялась согласно принятым нормативам и была одинаковой, как в опытных так и в контрольном прудах. Полученные результаты представлены в таблицах 16, 17 и18. Полученные результаты продемонстрировали высокую эффективность применения испытываемого нробиотика, для декоитамипации и нормализации состояния внутренних органов сеголетков. Необходимо отметить, что препарат оказывал выраженное положительное действие даже при крайне высоком уровне бактериального прессинга в условиях выростного пруда № 13 (от 2,4 х 10 до 3,8 х 10 КОЕ/мл при наличии в
Испытания бактерина в условиях тепловодного садкового хозяйства
Испытание бактерина было проведено так же в условиях садкового тепловодного хозяйства. По предварительным данным на хозяйстве во время второго года выращивания товарного карпа регулярно регистрировали язвенные поражения более, чем у 20% особей. Па рыбоводном участке из равноразмерных годовиков карпа без клинических признаков было сформировано две группы по 500 экз. в каждой, одна из которых подверглась вакцинации, при температуре 15 С, а другая оставлена в качестве контроля. Опытные и контрольные рыбы содержались в отдельных садках, при постоянном контроле за их клиническим состоянием. Для оценки эпизоотической ситуации на рыбоводном участке от годовиков без клинических признаков и двухгодовиков, имеющих язвы на поверхности тел, были взяты пробы патматериала и 5 проб воды для бактериологического исследования. При вскрытии годовиков у 8-ми экз. отмечена ненормальная окраска печени (от светло - песочной до оливковой) у всех обследованных рыб наблюдали отёк и рыхлую консистенцию почек. Селезенка была отёчная, гипертрофированная с закруглёнными, "оплавленными" краями. В брюшной полости обнаружено большое количество жира. Двухгодовики имели гипотрофированную рыхлую печень с массивными жировыми прослойками, в почках отмечали застойную гиперемию, и рыхлую консистенцию их ткани. Данные, полученные при микробиологическом исследовании материала от рыб, представлены в таблице 36, а воды - в таблице 37. В начале июля сотрудниками хозяйства было отмечено язвообразоваиие у рыб как в опытной, так и в контрольной группах, В середине июля 15.07. был произведён осмотр всех карпов из групи В и К. При осмотре рыб опытной группы у 13,4% отмечены язвенные поражения на поверхности тела и изредка - на жаберных крышках (1 - 2 язвы на рыбу), не сопровождавшиеся проявлением каких-либо других болезненных симптомов. В контрольной группе карпов с аналогичной клинической картиной было 19,4 %. Но гибель рыб ни в одной группе за время наблюдения не отмечена.
После внешнего осмотра было произведено патолого-аі [атомическое вскрытие и отбор материала паренхиматозных органов (печени и почек) для микробиологического исследования рыб каждой группы. Патолого-анатомическос вскрытие установило сходные патологические изменения во внутренних органах у всех карпов. Печень была бледная с массивными жировыми прожилками, гипертрофированная. Почки увеличенные, а их ткань - рыхлая. Селезёнка увеличена, с "оплавленными" краями. Микробиологические характеристики карпов групп В и К и окружающей их водной среды представлены в таблицах 38 и 39. Анализ данных, полученных в ходе проведённых исследований, позволил однозначно отклонить предположение об эпизоотическом неблагополучии хозяйства по бактериальной геморрагической септицемии.
О небактериальной этиологии язвенного синдрома у рыб однозначно говорили результаты микробиологических исследований, а клиническая картина была нехарактерной для септицемии, вызванной грам не гати він,] ми бактериями. В то время, как патолого-апатомическая картина могла свидетельствовать с наличии токсического фона в воде. О нетипичное гидрохимических процессов, происходящих в водоёме, говорили высокие значения рН 8,7 - 9, при достаточно высокой прозрачности воды. Тем не менее, более низкий процент поражения рыб в опытной группе и более высокий темп се роста заставили нас продлить время наблюдения.
Окончательный учёт результатов опыта произведён 18.09. Помимо ранее учитывавшихся параметров, исследовали: завершенный фагоцитоз, БЛСК и титры антител к гомологичному штамму Л. sobria 77-18 и гетерологичному, выделенному непосредственно от рыбы, культивируемой па участке - Л. sobria 48-12п. При осмотре 20 экз. карпов опытной группы клинических признаков не обнаружено, в то время как 3 рыбы из 20-ти, взятых из контроля, имели незначительные изъязвления на поверхности тела, а у 6-ти отмечали гиперемию брюшка. Средняя масса рыб в опытной группе составляла 1540 г, а в контрольной - 1305 г. При вскрытии помимо больших количеств полостного жира и гипотрофии печени значительных патологических отклонений во внутренних органах не обнаружено. Из паренхиматозных органов карпов опытной группы у 20% выделены единичные аэромоиады, ацинстобактсры и представители сем. Enterobacteriaceae. В контрольной группе коптаминированными оказались внутренние органы 40% обследованных рыб. От них выделяли единичные аэромоиады и НФІД. Результаты исследования микробиоценоза водной среды представлены в таблице 40.
