Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10-45
1.1 Рациональное использование отходов зернового производства 10-15
1.2 Биологически активные вещества гречихи 15-26
1.3 Биологически активные вещества серпухи венценосной 26-31
1.4 Методы выделения и идентификации флавоноидов растений 31-45
2 Экспериментальная часть 46-65
2.1 Объекты исследования 46-51
2.1.1 Гречиха посевная - Fagopyrum sagittatum Gilib. 46-49
2.1.2 Серпуха венценосная - Serratula coronata L.s.l. 49-51
2.2 Аппаратура и условия анализа 52-53
2.3 Очистка растворителей и приготовление растворов 53
2.3.1 Реактивы 53-54
2.3.2 Очистка растворителей и приготовление диагностических растворов 54
2.3.3 Приготовление стандартных растворов (рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина) и построение градуировачных графиков 55
2.3.4 Приготовление рабочих растворов (витексина, 3-метилкверцетина,
апигенина и изокемпферида), выделенных из исследуемого растительного сырья
2.3.5 Приготовление рабочего раствора ситостеролина 56
2.4 Определение влажности образцов растительного сырья 56
2.5 Выбор оптимальных условий выделения флавоноидов из исходных растительных объектов 56-57
2.6 Количественное определение суммы флавоноидов в полученных экстрактов 57
2.7 Статистическая обработка данных 59-60
2.8 Приготовление и разделение экстрактов флавоноидов 60
2.8.1 Приготовление экстракта шелухи гречихи посевной 60
2.8.2 Приготовление экстракта соцветий серпухи венценосной 60-61
2.8.3 Приготовление экстракта стеблей серпухи венценосной
2.8.4 Приготовление экстракта листьев серпухи венценосной 62
2.9 Идентификация флавоноидов и ситостеролина 62-64
2.10 Идентификация флавоноидов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 64
2.11 Количественное определение флавоноидов методом обращенно фазовой ВЭЖХ 64-65
3 Обсуждение результатов 66-106
3.1 Выбор оптимальных условий выделения флавоноидов из исходных растительных объектов 66-74
3.2 Очистка экстрактов и разделение смеси флавоноидов 74-75
3.3 Ситостеролин и флавоноиды из гречихи посевной 75-92
3.3.1 Идентификация фитостерола Р-ситостерол-З-О-Р-О-глюкопиранозида (ситостеролина) 77-80
3.3.2 Идентификация флавоноида апигенин-З-О-Р-Б-глюкопиранозида (витексина) 80-85
3.3.3 Разделение и идентификация флавоноидов из шелухи гречихи посевной методом обращенно - фазовой ВЭЖХ 85-90
3.3.4 Определение ситостеролина в шелухе и траве гречихи посевной методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 90-92
3.4 Флавоноиды серпухи венценосной 92-106
3.4.1 Идентификация флавоноида 5,7,4 -тригидрокси-3-метоксифлавона (изокемпферида) 93-96
3.4.2 Идентификация флавоноида 5,7,4 - тригидроксифлавона (апигенина) 96-97
3.4.3 Идентификация флавоноида 5,7,3 ,4 -тригидрокси-3-метоксифлавона (3-метилкверцетина) 97-100
3.4.4 Разделение и идентификация флавоноидов, выделенных из надземной части серпухи венценосной методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 100-106
Выводы 107-108
Список сокращений и условных обозначений 109
Список литературы
- Биологически активные вещества гречихи
- Приготовление стандартных растворов (рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина) и построение градуировачных графиков
- Очистка экстрактов и разделение смеси флавоноидов
- Разделение и идентификация флавоноидов, выделенных из надземной части серпухи венценосной методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
Биологически активные вещества гречихи
В настоящее время актуальной задачей, стоящей перед промышленностью и сельским хозяйством является разработка технологий комплексной переработки отходов производства в целевые продукты, которые позволяют безотходно использовать исходное сырье, избегая при этом накопления их в окружающей среде. Перспективным сырьем для получения различных функциональных продуктов являются отходы сельскохозяйственного производства.
При выращивании и переработке зерна злаковых культур (риса, проса, овса), образуется отходы в виде соломы, шелухи, лузги, мучки (или отрубей), которые до сих пор не находят эффективного применения. Из многочисленных отходов наиболее полно используют отходы рисового производства (шелуха, лузга, солома).
При переработке отходов риса (шелухи, лузги) получают ряд неорганических веществ: фосфат кальция, силикаты, легковесный уголь, высокоуглеродистую золу (в зависимости от способа переработки). Высокоуглеродистую золу используют для покрытия только что отлитых стальных слитков и для изготовления различных строительных изделий, добавляя ее в бетонные блоки, кирпичи, черепицу, шифер [Возобновляемые источники химического сырья , 2004].
Из органических веществ, получаемых при переработке шелухи, лузги, а также рисовой соломы, большая часть приходится на метанол, этанол, уксусную, левулиновую, фитиновую кислоты, ацетон, фурфурол, полисахариды, ксилозу, лигнин, который является сырьем для получения ванилина [Возобновляемые источники химического сырья , 2004].
Измельченную смесь мучки с рисовой лузгой используют в качестве добавки в комбикорм для сельскохозяйственных животных [Возобновляемые источники химического сырья , 2004]. Рисовая мучка является ценным сырьем, из которого экстрагируют до 14 % столового масла, а обезжиренный шрот представляет собой высокобелковый экстракт, используемый в хлебопекарном производстве [Никогда, 2012].
Отходы (лузга), получаемые при переработке злаковых культур (овса и ячменя), богаты клетчаткой и минеральными веществами. Их используют в основном виде брикетов в комбикормовой промышленности. При переработке зерна проса получают отходы в виде лузги. Основными компонентами лузги проса является клетчатка (50 %), пентозаны (28 %), минеральные вещества (13 %). Используют лузгу проса как удобрение, а также для получения моносахаридов при кислотном гидролизе, для утепления различных хозяйственных построек, как сырье для изготовления строительного материала (керамзита) [Отходы производства, электронный ресурс].
В начале XXI века в России возрос интерес к отходам гречихи. Гречиха посевная (Fagopyrum sagittatum Gilib.) - важная пищевая культура, обладающая высокой экологической адаптивной способностью.
В процессе производства гречневой крупы ежегодно образуются многотонные отходы в виде соломы, шелухи, мелкого щуплого зерна, мучки (отрубей). Часть соломы в общей надземной массе растения зависит от сорта и составляет 42 - 62 %. В результате очистки зерна образуется около 67 % крупы ядрицы, 7 % продела, 6 % отруби (мучка) и 20 % лузги [Возобновляемые источники химического сырья..., 2004; Лоскутова, Кленышева, электронный ресурс].
В настоящее время основными потребляемыми продуктами из гречихи являются гречневая крупа, мука, чай. Отруби и щуплое зерно гречихи используется в качестве концентрированного корма для сельскохозяйственных животных в составе комбикорма [Ванг, Чен, Фенг, 2010].
Крайне нерационально используется солома, причем количество растительных отходов несколько раз превосходит долю целевой выращенной продукции. Непосредственное внесение в землю, в качестве органического удобрения приводит к тому, что азот в почве используется не для питания корневых систем, а для процессов разложения органических остатков.
Особенностью химического состава соломы гречихи является то, что ее органическое вещество на 80 % состоит из клетчатки, соединенной в прочный лигноцеллюлозный комплекс, который мало поддается воздействию микроорганизмов и ферментов желудочно-кишечного тракта животных, вследствие чего перевариваемость ее низкая [Лоскутова, Кленышева, электронный ресурс]. При сжигании соломы образуется зола, содержащая: Са -6,8 %, К - 11,66 %, Р - 2,1 %. Высокое содержания калия делает солому гречихи уникальным источником для получения поташа [Шкорина, 2007].
В литературе имеются сведения, по использованию соломы в сельском хозяйстве в качестве мульчи для борьбы с водой и ветровой эрозией на землепахотных полях. Мульчирование создает благоприятные условия для впитывания воды в почву, уменьшает опасность поверхностного стока, ослабляет испарение влаги. При оставлении стерни и соломы в случае замены обычной обработки почвы поверхностной, на 40 - 60 % уменьшается скорость ветра над поверхностью почвы, вследствие этого угроза ветровой эрозии становится менее опасной [Использование соломы ...., 2011].
Издавна для обеспечения чистоты в животноводческих помещениях и накопления качественных органических удобрений, используют солому гречихи в качестве подстилки. Солома отвечает большинству требований, предъявляемых к подстилке: мягкая, сухая, влагоемкая, немаркая, без запаха и плесени, способна поглощать газы, убивать многие микроорганизмы и обладает ценностью как удобрение [Применение соломы , 2004]. Большая часть публикаций по использованию отходов производства гречихи посвящена получению рутина из зеленой массы растения (чаще цветков и листьев) для фармацевтической промышленности [Возобновляемые источники химического сырья , 2004].
Наибольший интерес среди отходов производства гречихи вызывает ее шелуха, объемы которой при производстве продукта (крупы) составляет около 20 % от массы зерна. Следовательно, ежегодно возобновляется огромное количество растительного сырья, которое до сих пор не находит эффективного использования. В литературе немногочисленны и технические предложения по ее использованию [Возобновляемые источники химического сырья , 2004].
Сведения, полученные от предприятий по очистке зерна, также свидетельствуют о том, что шелуха гречихи используется в основном в качестве топлива, наполнителя для подушек, упаковки фруктов и хрупких товаров [Каминский, Карунский, Бабич, 2000; Возобновляемые источники химического сырья...., 2004]. Для создания комплексной схемы переработки этих отходов необходимы данные о химическом составе сырья разных сортов. Из отходов гречихи получают полисахариды, целлюлозу, красители, пищевые добавки, фурфурол, лекарственные препараты [Возобновляемые источники химического сырья , 2004].
Гречневая шелуха представляет большой интерес с точки зрения получения флавоноидов, целлюлозы, коричневого пигмента и полисахаридов. В работах Ванг Инг и др. [2010], Ю.Л. Жеребина и др. [Фармакологические свойства..., 1984] описано использование шелухи гречихи как исходного материала для выделения и рафинирования коричневого пигмента гречихи, проведено исследование его физических и химических свойств. Результаты показали, что коричневый пигмент гречихи устойчив к свету, теплу, ионам металла и является потенциальным источником для получения натуральных красителей. Коричневый пигмент применяется в производстве безалкогольных напитков, вина, сладостей, тортов, соевого соуса и уксуса [Ванг, Чен, Фенг, 2010].
Приготовление стандартных растворов (рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина) и построение градуировачных графиков
Наличие фрагмента «а» с массой 167 или 153 указывает на присутствие в кольце А флавоноида метокси- или гидроксигруппы соответственно. Существование метокси- или гидроксигруппы в кольце В устанавливается по фрагменту «Ь». Массовый пик 135 на спектре указывает на наличие в структуре кольца В флавонола метоксигруппы, а пик 121 - гидроксигруппы. Пик 151 свидетельствует о присоединении в кольце В метокси- и гидроксигруппы одновременно в положениях 3 и 4. Помимо 7, 3, 4 положений, метоксигруппа может находится при атоме С-3 кольца С. Известно, что в масс-спектре флавоноидов с двумя гидроксигруппами при С-3 или С-5 сигналы иона «d» имеют низкую интенсивность (18-20 %), а введение метоксигруппы в положение С-3 приводит к резкому возрастанию интенсивности пика рассматриваемого иона до 50 % [Ведерников, Рощин, 2011].
Использование инфракрасной спектроскопии при установлении строения флавоноидов является, в большинстве случаев, чисто эмпирическим. С помощью ИК - спектра можно получить предварительные данные о наличии в молекуле той или иной функциональной группы. Высокая полоса 3200 - 3500 см"1 обусловлена фенольными гидроксильными группами, полоса 1660 см"1 принадлежит карбонильной группе, ароматические С=С-связи дают полосы при 1610, 1580, 1510, 1460 см"1. Важной для идентификации флавоноидов является так называемая область «отпечатков пальцев» 800 - 1200 см"1. Совпадение полос указанных группами области «отпечатки пальцев» служит надежным признаком идентичности веществ [Глинкевич, Софрович, 1983; Дренин, 2008].
При проверке растительного сырья на присутствие флавоноидов используют качественные реакции. Общей реакцией на флавоноидные соединения является реакция восстановления атомарным водородом в кислой среде в присутствии магния по Шиноду (появление вишнево-красной окраски) или ее модификация с цинком [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963; Федосеева, Мирович, Горячкина, 2009].
Флавоноиды, благодаря наличию карбонильных и фенольных оксигрупп, способны образовывать комплексы с солями металлов, которые различаются по устойчивости в зависимости от природы металла, рН среды и других факторов. Наиболее специфической и универсальной пробой на флавоноиды является возникновение зеленой, коричневой, черной или синей окраски комплексной соли в присутствии хлорида железа [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963; Федосеева, Мирович, Горячкина, 2009].
Флавоноиды с диоксифенольнымн группами дают осадки с раствором основного ацетата свинца, образуют окрашенные соединения с хлоридом сурьмы (III) и (V). Многие флавоноиды дают окрашенные комплексы с хлоридом алюминия (III), с солями циркония и другими металлами [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963; Федосеева, Мирович, Горячкина, 2009].
Флавоноиды со свободной 7-оксигруппой легко образуют азокрасители с диазотированной сульфаниловой кислотой и другими производными ароматических аминов [Васильев, Вичутинский, Черкасов, 1963].
Для количественного определения суммарного содержания флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико-химические методы, прежде всего фотоколориметрия, спектрофотометрия, флуориметрия, потенциометрия и полярография.
Фотоколориметрический метод основан: - на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (циркония, галлия, кобальта) [Георгиевский, Комиссаренко, Дмитрук, 1990]; - на реакции с лимонно-борным реактивом [Государственная фармакопея СССР, 1990]; - на реакции восстановления флавоноидов магнием в присутствии соляной кислоты в спиртовом растворе и последующем фотометрировании полученного раствора [Лукьянчикова, Тираспольская, 1985].
Спектрофотометрические методы основаны на измерении поглощения комплекса флавоноидов со спиртовым раствором хлорида алюминия в интервале длинах волн от 408 до 435 нм [Андреева, Калинкина, 2000; Лобанова, Будаева, Сакович, 2000; Дудкин, Девяткина, Бурова, 2005; Бубенчикова, Кондратова, 2006; Зиэп Т.Т. Нго, Жохова, 2007; Ломбоева, Танхаева, Олейников, 2008; Мещерякова, Пупыкина, Закиева, 2008; Методика количественного определения..., 2008; Правдивцева, Куркин, 2008; Чириков, Олейников, Танхаева, 2009; Исследование качественного и количественного....,2009; Анисимова, Куркин, Ежков, 2010; Куркина, 2011].
В работах Chatchawan Chotimarkorn et al. [2008], J. Boateng et al. [Effect of processing...,2008], J.Yang, R.H.Liu, L.Halim [2009] предложена модифицированная методика, основанная на поглощении комплекса флавоноидов с хлоридом алюминия в присутствии нитрита натрия в щелочной среде при длине волны 510 нм. В.А. Кудринская и др. [2010] предлагают определять флавоноиды по реакции азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазонилом (4-НФД). В щелочной среде 4-НФД вступает реакцию азосочетания с кверцетином, нарингенином, хризином, морином, рутином и нарингином с образованием окрашенных соединений с максимумом поглощения при длине волны 425 - 435 нм. Предел обнаружения методики составляет (1,5-3,9) 10" М. Методика отработана для модельных смесей флавоноидов [Кудринская, Дмитриенко, Золотов, 2010]. он о он о
Предложена флуориметрическая методика определения кверцетина, основанная на регистрации интенсивности люминесценции комплекса кверцетина с алюминием, с пределом обнаружения 2 10 6моль/л [Lin, Chun - xia, 2001]. А.А. Мальцевой и др. [Пат. 2475724 Российская Федерация...., 2013] предложили методику количественного определения содержания индивидуальных флавоноидов (рутина, кверцетина) в различных видах лекарственного сырья без их предварительного разделения. Методика основана на регистрации интенсивности флуоресценции комплекса флавоноида с хлоридам алюминия, при длинах волн испускания, которая индивидуальна для конкретного флавоноида.
Учитывая проявление флавоноидными соединениями слабо выраженных кислотных свойств (что обусловлено наличием в молекуле фенольных гидроксилов), используют кислотно-основное титрование в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне [Коноплева, 2002]. О.В. Малахова и др. [2004] проводили потенциометрическое титрование соединения 6-бромкверцетина в изопропиловом спирте. Это вещество в амфипропном растворителе проявляет себя как двухосновная кислота.
Методика потенциометрического определения гидролизуемых флавоноидов [Сравнительное исследование мелиссы..., 2009], в траве мелиссы лекарственной -Melissa officinalis и шалфея лекарственного - Salvia officinaleis предусматривает титрование водных извлечений флавоноидов 0,02 н. раствором перманганата калия в диапазоне потенциалов от -50 мВ до + 250 мВ. 5. Полярографические методы
Основаны на способности молекул флавоноидов окисляться как в растворе, так и на поверхности электродов из материалов различной природы. Предложено вольтамперометрическое определение флавонолов в фармпрепаратах, основанное на регистрации высоты волны окисления кверцетина на платиновом электроде на фоне 0,1М H2S04 , либо на фоне 0,1М НС1 [Зиятдинова, Будников, 2005; Слепченко, Анисимова, Слепченко, 2005].
Л.С. Анисимова и др. [Пат. 2215288 Российская Федерация..., 2003] предложили способ определения следовых количеств флавоноидов как в чистых растворах, так и растворах растительных экстрактов методом дифференциальной вольтамперометрии. Вольтамперометрическое определение проводили на стеклоуглеродном электроде по пикам восстановления при потенциалах от +0,41 до -0,63 В относительно насыщенного хлоридсеребренного электрода или по пикам окисления при потенциалах от -0,36 до +0,46 В на фоне 0,2 н Na2HP04 или 0,2 н двухзамещенного лимоннокислого аммония, регистрацию пиков проводили при линейной скорости развертки потенциала 20-30 мВ/с в дифференциальном режиме съемки вольтамперограммы.
Очистка экстрактов и разделение смеси флавоноидов
В качестве ионизирующих и комплексообразующих регентов для установления структуры флавоноидов использовали: 1 % спиртовой раствор ацетата натрия. Растворяли 1,66 г CH3COONa ЗН20 в 100 мл 96 % раствора этанола; 5 % спиртовой раствор хлорида алюминия. Растворяли 27,12 г А1С13-6Н20 в 300 мл 96 % раствора этанола.
Приготовление 1 % спиртового раствора этилата натрия В химическом стакане на 150 мл небольшими порциями растворяли 0,68 г металлического натрия в 50 мл 96 % раствора этанола. По окончанию реакции полученный раствор разбавляли до 100 мл 96 % раствором этанола. 2.3.3 Приготовление стандартных растворов (рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина) и построение градуировочных графиков
Для построения градуировочных графиков точные навески стандартных веществ (25мг) количественно переносили в мерные колбы вместимостью 25 мл, прибавляли 15 мл 95 % спирта, нагревали на водяной бане при 50 - 60С до полного растворения вещества, охлаждали до комнатной температуры и доводили до метки 96 % спиртом. 2,5 мл исходных растворов стандартных веществ помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, и доводили до метки 96 % этанолом. Концентрации рутина, лютеолина, ориентина и кверцетина в растворах составила 0,1 мг/мл. Градуировочные графики зависимости оптической плотности от массы введенного в хроматограф флавоноида представлены в приложении (Б2, Б4, Б5, Б6).
Точные навески выделенных флавоноидов (5 мг) переносили в мерные колбы на 25 мл, прибавляли 15 мл 96 % этилового спирта, нагревали на водяной бане при 50 - 60 С до полного растворения вещества, охлаждали до комнатной температуры и доводили до метки 96 % спиртом. Концентрация витексина, 3-метилкверцетина, апигенина и изокемпферида в растворах составляла 0,2 мг/мл. Градуировочные графики зависимости оптической плотности от массы введенного в хроматограф флавоноида представлены в приложении (БЗ, Б7, Б8, Б9).
2.3.5Приготовление рабочего раствора ситостеролина
Точную навеску ситостеролина 10 мг переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70 % этилового спирта, нагревали на кипящей водяной бане до полного растворения ситостеролина, охлаждали до комнатной температуры и доводили до метки 96 % спиртом. Концентрация ситостеролина в растворе составила 0,1 мг/мл.
Определение влажности образцов растительного сырья На аналитических весах брали точные навески исследуемых растительных образцов (0,5-1 г), и помещали в стеклянных бюксах в сушильный шкаф. Сушили до постоянного веса, при температуре 105 С и определяли влажность по разности масс образцов до и после высушивания.
Влажность (W, %) рассчитывали по формуле: где ті - масса образца до высушивания, г; т2 - масса образца после высушивания, г. оптимальных условий выделения флавоноидов из исходных растительных объектов Выбор соотношения этанол - вода, сырье - экстрагент, времени, температуры и кратности экстракции проводился следующим образом: а) соотношение этанол : вода. Навески по 5,00 г исходных растительных образцов экстрагировали 100 мл водного раствора этанола с массовой долей спирта 0; 20; 40; 60; 80; 96 % при постоянном перемешивании на перемешивающем устройстве при температуре 70 С в течение 4 часов; б) соотношение сырье : экстрагент. Навески по 5,00 г растительных образцов экстрагировали 40 - 70 % этанола (таблица 8) в соотношении сырье : экстрагент: 1:10; 1:30; 1:50; 1:70; 1:100 при постоянном перемешивании при температуре 70 С в течение 4 ч; в) время экстракции. Навески по 5,00 г образцов экстрагировали 150 - 250 мл 40 - 70 % этанола (таблица 8) при постоянном перемешивании и температуре 70 С в течение: 30; 60; 90; 120; 240 минут; г) температура процесса. Навески по 5,00 г растительных образцов экстрагировали 150 - 250 мл 40 -70 % этанола при различных температурных режимах : 20 С; 40 С; 55 С; 65 С; 100 С; 130 С; д) кратность экстракции. Навески по 5,00 г растительных образцов помещали в колбы вместимостью 500 мл, приливали 150 - 250 мл 40 - 70 % этанола, и нагревали при 65 - 100 С в течение 60-120 минут. Экстракцию повторяли дважды в тех же условиях 150 -250 мл 40 -70 % этанола в течение 60 - 120 минут при втором контакте фаз и 60-120 мин - при третьем (таблица 8). Условия экстракции флавоноидов из исходных растительных объектов
Экстракты, полученные при различных условиях, фильтровали через бумажный фильтр (синяя лента), замеряли их объем. Аликвоты (5 мл) анализируемых экстрактов помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, добавляли по 2 мл 5 % спиртового раствора хлорида алюминия и доводили до метки 70 % этанолом. В качестве раствора сравнения использовали раствор анализируемого экстракта разведенного в 5 раз. Измеряли оптическую плотность через 30 мин при Х= 405 нм (є = 609,8) в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Для построения градуировочного графика, в мерные колбы емкостью 25 мл вносили по 2 мл 5 % спиртового раствора хлорида алюминия и следующие объемы стандартного раствора рутина с концентрацией 0,1 мг/мл: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 7,5 мл (объемы измеряли пипетками на 1 и 10 мл с погрешностью 0,01 и 0,1 мл). Содержимое колб доводили до метки 70 % этанолом. Оптическую плотность измеряли через 30 минут при А,=405 нм (є=609,8) в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм [Лобанова, Будаева, Сакович, 2004; Бубенчикова, Кондратова, 2006; Ломбоева, Танхаева, Олейников, 2008; Выбор оптимальных условий...., 2008; Чирикова, Олейников, Танхаева, 2009; Исследование качественного и количественного...., 2009].
Разделение и идентификация флавоноидов, выделенных из надземной части серпухи венценосной методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
Преобладающим флавоноидом в траве гречихи - Fagopyrum sagittatum является рутин, содержание которого составляет 0,95 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 87,17 %). В траве гречихи, (сорта Приморская и Изумруд), культивируемой в Приморском крае в период с 1997 по 1999 гг, массовая доля рутина в сырье варьировала от 2,4 % до 3,0 % в пересчете на сухое сырье [Клыков, 2000], что превышает содержание рутина, выделенного нами (1,31 - 1,91 %) из травы гречихи сорта «Башкирская красностебельная», собранной в Приморском крае в 2010 г.
По-видимому, это связано не только с сортом гречихи, но и значительным влиянием природных факторов среды в данный период (влажности, температуры). По данным М. М. Анисимовой [2011] в траве гречихи, культивируемой в Самарской области, массовая доля рутина составляла 2,5 -3,7 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 47-61 %), что значительно меньше содержания рутина (относительно суммы флавоноидов 87,17 %) выделенного из травы гречихи, произрастающей в Приморском крае. По-видимому, трава гречихи, культивируемой в Приморском крае, может быть перспективным сырьем для получения рутина (витамина Р).
В современной медицине рутин (витамин Р) применяют для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, гипертонии, сахарного диабета, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ревматизма, злокачественных образований, заболеваний печени и желчного пузыря. Рутин уменьшает отмирание тканей при обморожении, усиливает защитные свойства организма работающих с рентгеновскими лучами и радиоактивными веществами [Мисюрева, 1998].
Доминирующим флавоноидом в шелухе гречихи, произрастающей в Приморском крае, является ориентин, массовая доля которого составляет 0,04 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 17,65 %). Массовая доля рутина в шелухе гречихи составляет 0,02 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 11,76 %), что значительно меньше содержания в траве гречихи.
Из литературы известно, что доминирующим флавоноидом в шелухе гречихи Польских сортов (Luba, Kora, Panda, Emka, Hzuszouska) является рутин, массовая доля которого в зависимости от сорта варьирует от 0,05 до 0,08 % в пересчете на сухое сырье (относительно суммы флавоноидов 43-53 %) [Dietrych - Szostak, Burda, Podolska, 2005]. Массовая доля ориентина и витексина составляет 0,01-0,02 % (относительно суммы флавоноидов 6,0-13,3 %) [Dietrych -Szostak, 2004]. По данным М. Watanabe et al. [1997] в шелухе гречихи культивируемой в Японии, массовая доля рутина составляет 0,004 %, витексина -0,005 % (в пересчете на сухое сырье). Массовая доля рутина в шелухе гречихи, культивируемой в Канаде, варьирует от 0,05 до 0,08 % [Ooman, Mazza, 1996].
Таким образом, шелуха гречихи, произрастающей в Приморском крае, может являться источником для выделения флавоноида ориентина и последующего использования его в качестве стандартного соединения.
Обычно разделение, идентификацию и количественное определение соединений класса фитостеролов в растительных объектах проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием масс-спектрометрических [Careri, Elviri, Mangia, 2001; Rajanandh, Kavitha, 2010; Extraction and analysis...., 2010] и УФ-детекторов в диапазоне рабочих длинах волн 196 - 210 нм [Careri, Elviri, Mangia, 2001; Chronic Exposure..., 2008; Jian-lin, Ke, Xue-hua, 2008; Rajanandh, Kavitha, 2010; Extraction and analysis..., 2010; Intraspecific variability of fireweed...., 2011]. Разделение фитостеролов проводят на привитых обращенных фазах С8 или Ci8 при элюировании смесями ацетонитрил : вода [Хеншен и др., 1988], метанол : вода [Rajanandh, Kavitha, 2010], ацетонитрил : метанол [Chronic Exposure..., 2008; Intraspecific variability of fireweed...., 2011] или ацетонитрил : этанол [Je-Chiuan Ye et al., 2010]. Разделение и количественное определение ситостеролина методом ВЭЖХ, проводят на обращенной фазе Ci8 при элюировании смесями ацетонитрил : метанол в соотношении (20 : 80) об./об. [Chronic Exposure..., 2008] или 100 % метанолом [Jian-lin, Ke, Xue-hua, 2008]. Приведенные выше условия использовали для определения ситостеролина в экстракте шелухи и травы гречихи посевной. Нами проведено исследование наличия ситостеролина в траве гречихи посевной. Анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC -6А с УФ-детектором при рабочей длине волны 210 нм в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил : метанол в соотношении (20 : 80) об./об. Идентификацию ситостеролина на хроматограмме разделенной смеси экстракта проводили, сравнивая времена удерживания разделенных пиков с временем удерживания стандартного соединения ситостеролина. Количественное содержание определяли методом градуировочного графика.
Массовая доля ситостеролина в шелухе гречихи составила 0,16±0,04 % в пересчете на сухое вещество. В экстракте травы гречихи ситостеролин не обнаружен. Вероятно, это соединение образуется в процессе развития растения лишь в его отдельных органах. Так как, ситостеролин является биологически активным соединением, обладающим ценными физиологическими свойствами, действие которого основано на снижение сорбции холестерина на стенках кровеносных сосудов. Ситостеролин также обладает иммуномодулирующим действием. Использование шелухи гречихи вероятно перпективно как альтернативный источник выделения ситостеролина и последующего использования его в фармацевтической промышленности для получения препаратов, необходимых при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Особое место в лекарственной флоре Дальнего Востока России занимают растения, содержащие экдистероиды, алкалоиды, флавоноиды и имеющие большое значение в медицине для создания новых лекарственных средств. Такие растения представляют собой резерв для расширения лекарственной сырьевой базы региона [Максимов, Кулеш, Горовой, 2002].
Доля дальневосточных растений в официальной медицине очень невелика. Главным препятствием для введения этих растений в официальную практику является их недостаточная изученность. Как правило, сведения по химическому составу и фармакологическому действию ограничены и требуют дополнительных исследований.
Одним из таких растений является серпуха венценосная - Serratula coronata L.s.l. Это растение содержит ценные биологически активные соединения, среди которых особое место занимают экдистероиды [Серпуха венценосная...., электронный ресурс; Володин, Лукша, Дайман, 1998; Экдистероиды в культурах клеток Serratula coronata и Ajuga reptans, 2002; Исследование химического состава...., 2003; Пунегова, 2004]. Данные исследований, проведенных в Дальневосточном государственном университете и Тихоокеанском институте биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, свидетельствуют о том, что основным экдистероидом в серпухе венценосной произрастающей на территории Приморского края Дальнего Востока является 20-гидроксиэкдизон [Зарембо, Горовой, Соколова, 2001]. Имеются сведения по содержанию в серпухе венценосной и флавоноидов [Исследование химического состава..., 2003; Ангаскиева, 2006]. Известно, что флавоноиды растения, произрастающего в Сибири, представлены апигенином, лютеолином, кверцетином, кемпферолом, рутином, гликозидами лютеолина и кверцетина [Ангаскиева, 2006]. Однако сведения по содержанию флавоноидов в надземной части растения серпухи венценосной, произрастающей на территории Приморского края Дальнего Востока России, отсутствуют.
