Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 6
1.1. Выращивание рыбы в установках с замкнутым циклом водообеспечеиия 6
1.2. Бактериальные болезни рыб при выращивании в УЗВ и факторы, способствующие их возникновению 14
2. Материал и методика исследований 39
3. Микробиальные сообщества карпа из индустриального хозяйства калининградского морского рыбного порта и его подверженность воздействию болезнетворных агентов 46
3.1. Качественный и количественный состав микробиоты карпа 46
3.2. Сравнительный анализ обсемененности микроорганизмами различных органов карпа из УЗВ 54
3.3. Изменение микрофлоры карпа в УЗВ в процессе выращивания 61
3.4. Патогенная роль аэромонад - домипантов в микробиоценозе карпа, выращиваемого в индустриальном хозяйстве бб
3.5. Определение степени патогенности выделенных от карпа условно - патогенных бактерий для выращиваемой в установке с замкнутым циклом водообеспечения рыбы 68
4. Завозимая из прудового хозяйства рыба как источник заразного начала в узв 77
5. Влияние условий выращивания, санитарного состояния водной среды и кормов на эпизоотическое благополучие установки с замкнутым циклом водообеспечения 84
5.1. Влияние условий выращивания на бактериальную обсеменепность карпа в установке с замкнутым циклом водообеспечения 84
5.2. Влияние санитарного состояния водной среды на эпизоотическое благополучие установки с замкнутым циклом водообеспечения 95
5.3. Влияние санитарного состояния кормов на эпизоотическое благополучие индустриального хозяйства с замкнутым циклом водообеспечения 99
Обсуждение результатов 104
Выводы 108
- Бактериальные болезни рыб при выращивании в УЗВ и факторы, способствующие их возникновению
- Сравнительный анализ обсемененности микроорганизмами различных органов карпа из УЗВ
- Определение степени патогенности выделенных от карпа условно - патогенных бактерий для выращиваемой в установке с замкнутым циклом водообеспечения рыбы
- Влияние санитарного состояния водной среды на эпизоотическое благополучие установки с замкнутым циклом водообеспечения
Введение к работе
Аквакультура - современная и высокопродуктивная отрасль народного хозяйства, которая обеспечивает поступление на внешние и внутренние рынки рыбы и морепродуктов (Душкина и др., 1985; Мамонтов, 1999, 2000). Увеличение доли такой продукции по отношению к океаническому и морскому промыслу обусловлено объективными причинами: сокращением уловов в естественных водоемах, потребностью населения в полноценном белке, возрастанием спроса на диетическую продукцию (Моисеев, Карпевич, 1979; Душкина и др., 1985).
Существенный вклад в общую рыбопродукцию вносит индустриальное товарное рыбоводство. Преимущества этого направления аквакультуры очевидны. Короткий цикл выращивания товарной рыбы, содержание ее на всех этапах рыбоводного процесса на незначительных площадях при высоких плотностях посадки обеспечивают сохранность рыбы и повышают выход товарной продукции. Решение иной проблемы - проблемы экономного использования вторичного сырья достигается за счет установок с замкнутым циклом водообеспечения (УЗВ). Потенциал подобных установок довольно велик, так как в них сокращено потребление чистой воды, обеспечивается полное регулирование режимов очистки и кондиционирования отработанных вод и управление жизненным циклом выращиваемых гидробионтов (Спотт, 1983; Филатов, 1988). Производство рыбы в замкнутых системах - интенсивный путь рыбоводства. Интенсификация достигается, главным образом, за счет использования искусственных кормов. В настоящее время потребности в кормах полностью удовлетворяются за счет импорта (Гамыгин, 1999).
Однако содержание рыбы в установках с замкнутым циклом водообеспечения не решает проблемы болезней объектов аквакультуры. В последние годы отмечается тенденция увеличения количества рыбоводных хозяйств, неблагополучных по заразным болезням рыб (Головин, 1998; Яременко, Мачнев, 2000). Наибольший ущерб наносят бактериальные заболевания, прежде всего, аэромоноз (Головин, 1998; Юхименко, 1998). Применение терапевтических мероприятий в замкнутых системах не дает положительного эффекта ввиду уничтожения полезных микроорганизмов биофильтра и, как следствие, ухудшения качества рециркулируемой воды (Спотт, 1983). Поэтому первостепенное значение в хозяйствах, использующих установки с замкнутым циклом водообеспечения, приобретает комплекс профилактических и противоэпизоотических действий.
Развитие индустриального рыбоводства с использованием установок с замкнутым циклом водообеспечения должно базироваться не только на знаниях биологии разводимого объекта, технологии его выращивания, основ очистки воды, сбалансированности и качества кормов, но и учитывать закономерности формирования микробных сообществ и их функционирование в замкнутых системах.
В связи с этим изучение структуры микробиоценозов посадочного материала и выращиваемой рыбы, водной среды и кормов является весьма актуальным исследованием. Полученная информация поможет решить проблему предупреждения инфекционных заболеваний рыб в индустриальных хозяйствах и, таким образом, снизить отход рыбы от болезней бактериальной природы.
Цель настоящей работы: Изучение микробного пейзажа карпа и среды его выращивания и оценка эпизоотического благополучия установки с замкнутым циклом водообеспечения в отношении бактериальных заболеваний.
Нами были поставлены следующие задачи:
1) определить микробный пейзаж карпа, выращиваемого в УЗВ, и микробный
пейзаж карпа из прудового хозяйства как носителя условно-патогенных
микроорганизмов, вносимых в замкнутые системы с посадочным материалом;
2) изучить динамику бактериальной обсемененности рыбы в установке с
замкнутым циклом водообеспечения за полный рыбоводный цикл;
выявить влияние условий индустриального выращивания на бактериальную обсемененность карпа;
установить патогенное значение для выращиваемой рыбы функционирующих в установке с замкнутым циклом водообеспечения бактерий;
выяснить роль водной среды и гранулированных кормов в эпизоотическом благополучии УЗВ и установить степень корреляции звеньев системы «вода - рыба -корма»;
6) оценить эпизоотическое благополучие установки с замкнутым циклом
водообеспечения по бактериальным болезням рыб и разработать схему
профилактических мероприятий в УЗВ в отношении бактериальных заболеваний рыбы.
Научная новизна работы. Автором впервые проведено комплексное изучение микробного пейзажа рыбы, рециркулируемой воды и гранулированных кормов в установке с замкнутым циклом водообеспечения. Доказана роль посадочного материала в формировании фона условно - патогенной микрофлоры в замкнутой системе. С помощью разнообразных методик оценена патогенная роль бактерий рода Aeromonas,
5 функционирующих в УЗВ. Осуществлено сравнение микробных пейзажей карпа из прудового и индустриального хозяйства. Впервые разработана схема мероприятий по предупреждению бактериальных заболеваний рыбы в УЗВ.
Практическая значимость работы. Предложены критерии микробиологического контроля выращиваемой рыбы, оборотной воды и гранулированных кормов, обеспечивающих благополучие УЗВ в отношении бактериальных болезней. Полученные данные о патогенной значимости бактерий рода Aeromonas, заносимых с посадочным материалом в выростные емкости, доказывают необходимость постоянного бактериологического контроля рыбы на всех этапах ее выращивания, начиная с момента завоза в рыбоводное хозяйство. Практические результаты работы могут быть использованы при подготовке дипломированных специалистов по специальности 311700- Водные биоресурсы и аквакультура.
Основные положения, выносимые на защиту:
эпизоотическое благополучие УЗВ в отношении бактериальных болезней рыб зависит от соотношения условно - патогенных бактерий в рециркулируемой воде и рыбо посад очном материале;
рыбопосадочный материал служит резервентом бактерий рода Aeromonas, обладающих патогенными свойствами;
3) аэромопады обладают высокой вирулентностью по отношению к
выращиваемой в УЗВ рыбе.
Благодарности. Научное руководство работой осуществляла кандидат биологических наук, доцент Калининградского государственного технического университета Авдеева Елена Витальевна, которой я выражаю искреннюю признательность за оказанное внимание и благодарность за помощь при выполнении работы. Благодарю коллектив кафедры ихтиопатологии и гидробиологии КГТУ и коллективы карпового хозяйства Калининградского морского рыбного порта и учебно -опытного рыбоводного хозяйства КГТУ за предоставленные материал и условия для проведения экспериментальной части работы.
Бактериальные болезни рыб при выращивании в УЗВ и факторы, способствующие их возникновению
Микробная популяция замкнутых систем состоит из двух взаимосвязанных групп. Это микрофлора окружающей организм среды и аутофлора самого макроорганизма. Становление каждого из этих ценозов имеет свои регуляторные механизмы, ценозы отличаются также по составу. Главная особенность микрофлоры замкнутой системы - изменение ее видового состава. Это происходит из-за ограниченного числа индивидуумов, составляющих популяцию замкнутой системы. Наблюдается и большая вариабельность аутофлоры отдельных индивидуумов, поэтому в небольшой популяции суммарный набор видов микроорганизмов будет редуцирован по сравнению с микрофлорой больших сообществ. При сдвигах в микрофлоре создаются благоприятные условия для колонизации макрооргаїшзма новыми видами, причем зачастую патогенными. В замкнутой системе в кишечнике содержащихся объектов повышается численность патогенных штаммов аутофлоры (Гительзон и др., 1981). Все эти причины определяют суммарное снижение видового состава микроорганизмов, окружающих разводимый объект в замкнутой системе, однако численность может даже возрастать из-за ограничения или нарушения санитарных мероприятий. Нормальная микрофлора гидробионтов - саморегулирующаяся система, выполняющая в организме ряд полезных для него функций, и зависит от состояния организма. Бактериальные популяции кишечника проявляют широкую вариабельность культуральных, морфологических и биохимических свойств, а также сложные взаимоотношения и взаимозависимость друг от друга и метаболическое взаимодействие с макроорганизмом. Нормальная микрофлора является антагонистом патогенных и непатогеиных микроорганизмов. Однако даже облигатные представители микрофлоры могут играть отрицательную роль: демонстрировать конкуренцию за питательные вещества, некоторые витамины, а также проявлять потенциальную патогенность. И.И. Гительзон и другие (1981) отмечают, что на первоначальных этапах экспериментов в замкнутых системах происходят адаптационные изменения. Это касается изменений аутофлоры кожных покровов и микрофлоры кишечника.
У здоровой живой или только что погибшей рыбы микрофлора обнаруживается на поверхности, жабрах и в содержимом желудочно - кишечного тракта. Количество бактерий на поверхности только что выловленной рыбы и жабрах колеблется в широких пределах (от 102 до 107 КОЕ/смг поверхности тела и жабр); в одном грамме кишечного содержимого содержится от 104 до 108 бактерий (Новикова, 1991). В некоторых хозяйствах в кишечнике рыб численность различных микроорганизмов составляла от 106 - 109 до 1012 до 1015 на 1 г массы тела рыбы (Sakata, Okabayashi, Kakimoto, 1980; Rings et al, 1995). Среди факторов, способствующих колонизации микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте, выделяют температуру (MacMillan, Santucci, 1990) и соленость воды (Yoshimizu, Kim ига, 1976; Sakata et al, 1980; Cahill, 1990), питание и пищевые компоненты (Yoshimizu, Kimura, 1976; Cahill, 1990), строение кишечника и условия обитания в кишечнике (Hamid et al, 1979; Rings et al, 1995), взаимоотношения в нем различных групп бактерий (Kvasnikov et al, 1977; Schroder et al, 1980; Tannock, 1983; Wcsterdahl et al, 1991; Olsson et al, 1992; Joborn et al, 1997), использование антибиотиков (Austin, Al-Zahrani, 1988; Rings et al, 1995), Численность бактерий на поверхности рыбы зависит от ряда факторов. В первую очередь, она определяется бактериальной обсемененностыо воды: чем больше микробное число воды, тем больше бактерий обнаруживается на рыбе. Кроме того, численность бактерий зависит от температуры воды (Асорей Риаль, 2000). В изменяющихся условиях выращивания рыбы большое значение приобретает условно - патогенная микрофлора макроорганизма. При ослаблении защитных свойств последнего ее представители могут вызывать патологический процесс, включая нарушение микробного равновесия (в случаях применения облучения, использования антибиотиков и т.п.) (Shotts, Plumb, 1998). Большинство видов условно-патогенных микроорганизмов - нормальные обитатели кожи и слизистых оболочек тела, отмечаются у всех или многих индивидуумов и в больших количествах, не оказывая на здоровый организм патогенного влияния. Они часто обнаруживаются в воде, почве, на объектах окружающей среды, что связано с их массовым выделением из организма хозяина, способностью переживать относительно долгое время во внешней среде, а при определенных условиях и размножаться в ней. Вместе с тем среди условно-патогенных микроорганизмов есть виды - постоянные обитатели объектов внешней среды, в которой они ведут сапрофитный образ жизни. Занос этой группы микробов в здоровый организм может привести к развитию болезни. Патогенное действие на организм гидробионта условно-патогенные микроорганизмы оказывают в условиях пассивного проникновения во внутреннюю среду в больших количествах и (или) резкого снижения общего и местного иммунитета (нарушение целостности покровов, бактерицидной активности секретов, подавление фагоцитарной реакции, снижение числа микробов - антагонистов). Это связано с тем, что условно-патогенные микроорганизмы в отличие от облигатно-патогенных не обладают факторами активного проникновения во внутреннюю среду, подавления защитных сил организма, не выделяют экзотоксины. Патогенное влияние на организм они оказывают с помощью эндотоксина и ферментов-токсинов. Способность условно-патогенного микроорганизма вызывать заболевания увеличивает численность и область его распространения. Заболевания, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (оппортунистические инфекции), по многим признакам отличаются от таковых, вызванных о блигатно-пато генными микробами. Во-первых, условно-патогенные микроорганизмы не имеют строго выраженной органной локализации: один и тот же вид может быть причиной поражения многих органов. Во-вторых, условно-патогенные инфекции полиэтиологичны: одна и та же клиническая форма заболевания может быть обусловлена любым условно-патогенным микроорганизмом. В-третьих, клиническая картина условно-патогенных инфекций мало специфична; их протекание в большей мере зависит от пораженного органа, чем от этиологии возбудителя. В-четвертых, условно-патогенные инфекции часто протекают как смешанные (микст) инфекции.
Они нередко наслаиваются на уже имеющиеся инфекционные и неинфекционные заболевания (т.е. являются вторичными инфекциями) и вызываются совокупностью, ассоциацией возбудителей. В-пятых, условно-патогеиным инфекциям свойственно острохропическое или хроническое течение, что связано с ослабленной способностью макроорганизма противостоять возникновению болезни. В-шестых, хотя условно-патогенные инфекции начинаются как местные локальные процессы, при них всегда сохраняется потенциальная возможность к развитию септикоемии. В-седьмых, эффективность терапии, включая антимикробную, при многих формах условно-патогенной инфекции мала, что обусловлено большей устойчивостью условно-патогенных микроорганизмов к антимикробным препаратам, недостаточной активностью факторов естественного иммунитета макроорганизма (Красильников, Романовская, 1999). Таким образом, для возникновения болезни у рыб необходимо взаимодействие трех факторов: восприимчивости хозяина, вирулентности возбудителя болезни и определенных условий окружающей среды (Snieszko, 1964; Walters, Plumb, 19S0; Ведемейер, Мейер, Смит, 1981). Восприимчивость хозяина определяется унаследованной (видовой) чувствительностью к каким - либо отдельным возбудителям, а также возрастными и индивидуальными особенностями физиологических и компенсаторных механизмов. Значение условно - патогенной микрофлоры в этиологии инфекционных заболеваний у рыб в большой степени определяется неблагоприятными изменениями окружающей среды, которые способны, вводя рыбу в стрессовое состояние, активизировать у нее латентно и хронически протекающие инфекционные процессы, изменять патогенные свойства естественной микрофлоры. К числу наиболее патогенных для рыб возбудителей относят представителей следующих родов: Aeromonas, Pseudomonas, Corynebacterium, Yersinia, Edvvardsiella, Proteus vulgaris, Haemophilus, Vibrio, Streptococcus, Flexibacter, Renibacterium, Pasteurella (Ohnishi, Watanabe, Jo, 1982; Conroy, 1984; Бычкова, Юхименко, Можарова, 1995, 1996; Афанасьев и др., 1997). В инфекционной заболеваемости карпа практически все патогенные бактерии играют определенную роль
Сравнительный анализ обсемененности микроорганизмами различных органов карпа из УЗВ
Нами была исследована обсемененность восьми органов сеголетков и годовиков карпа. Полученные данные по обсемененности органов рыбы бактериями разных таксонов сведены в табл. 8. Единственный микроорганизм, выделенный нами из всех органов - это условно-патогенная бактерия Aeromonas hydrophila. Особенно велика зараженность этим видом селезенки и кишечника. Наибольшее число изолятов A. hydrophila мы выделили в мае 1997 года у годовика и в октябре 1997 года у сеголетка, когда рыба была обильно обсеменена аэромонадами. В посевах крови бактерия этого вида зафиксирована нами только в октябре 1997 года у одного сеголетка. Микробиоценоз кожи, жабр, содержимого желчного пузыря и селезенки представлен ассоциациями бактерий родов Aeromonas, Pseudomonas и Alcaligenes. Во всех посевах органов, за исключением посева крови, с разной интенсивностью мы встречали споровые и аспорогеппые бактерии рода Bacillus. Наибольшие численность их и разнообразие видов отмечены в кишечнике. Бактерии рода Bacillus -нормальная микрофлора гранулированных кормов. В зависимости от интенсивности питания менялась их численность в содержимом кишечника. Псевдомонады изолированы из всех органов карпа, за исключением крови из сердца и жабр. В посевах органов, кроме посева крови, постоянно обнаруживали кокковую микрофлору. Стрессовые условия, складывающиеся при выращивании карпа в УЗВ, приводят к увеличению содержания в жабрах продуктов перекисного окисления, что, в свою очередь, способствует возрастанию количества бактерий, обладающих каталазной активностью, прежде всего кокков. Сапрофитные бактерии родов Acinetobacter и Alcaligenes выделены, в основном, из содержимого кишечника. Они формируют его нормальный бактериальный фон. Эптеробактерий также отмечены в содержимом кишечника и, кроме того, во внутренних паренхиматозных органах. Только Escherichia coli изолирована с жабр. Из представителей семейства Enterobacteriaceae чаще всего регистрировали бактерию Citrobacter freundii, входящую в состав микробных ассоциаций, образующихся в кишечном тракте рыбы. Видовой состав эптеробактерий в последующие после завоза рыбы месяцы не претерпевал изменений, в то время как количественный их состав менялся, хотя оставался очень низким. На коже присутствовали и грамотрицательные, и гр&мположительные бактерии различных таксономических групп (табл. 8).
Состав микрофлоры кожи карпа был сформирован в основном микроорганизмами, обитающими в воде, прежде всего, аэромонадами. Кокковые бактерии попали на рыбу из воздуха, где в условиях закрытого помещения они быстро накапливаются. Присутствие на коже бактерий рода Bacillus, по-видимому, связано с длительным нахождением в воде выростных емкостей гранул корма. Энтеробактсрий на коже мы не обнаруживали. Следует отметить, что количественное соотношение вышеуказанных групп бактерий на коже было примерно одинаковым у карпов первой и второй партий завоза. Но на карпах из первой группы численно преобладали аэромонады, псевдомонады, микрококки и стафилококки, на карпах из второй группы - аэромонады и микрококки. Обязательным условием развития бактерий любых родов является наличие питательного субстрата. Постоянно накапливающаяся в выростных емкостях органика во многом определяла микрофлору не только воды, но и рыбы, особенно ее поверхности и жабр. Большую долю микробиального фона жабр составляли микрококки. Единственный раз за год исследования в посевах жабр отмечена Escherichia coli, появление которой, очевидно, связано с органическим загрязнением воды в выростных емкостях. Хотя в посевах содержимого кишечника этой бактерии не было. Escherichia coli является санитарио-показательпым микроорганизмом и обнаружение ее свидетельствует о возможном наличии в рыбе возбудителей кишечных инфекций человека. Поэтому важно определить правильный режим тепловой обработки рыбы во избежание заболевания человека при массовом размножении коли - бактерии. Непатогенный стафилококк Staphylococcus epidermidis по одному разу встречен нами па жабрах сеголетка и годовика карпа, вместе с тем на покровах рыбы его численность была выше (табл. 8). В посевах содержимого желчного пузыря карпа в течение года микроорганизмы либо вообще отсутствовали, либо при наличии клинических признаков бактериального заболевания у выращиваемой рыбы происходило резкое увеличение видового разнообразия бактерий, обсеменяющих желчь карпа. При этом по числу штаммов преобладала условно-патогенная бактерия Aeromonas hydrophila. Вклад остальных таксономических групп в микробиоценоз желчи незначителен, Обсемененность бактериями таких органов как печень, селезенка и почки также варьировала за период выращивания карпа. Изменялся и качественный, и количественный состав микрофлоры, В этих органах бактерии нами обнаруживались постоянно, что свидетельствует о напряженности систем иммунитета карпа, пониженной его резистентности. Обсеменение внутренних паренхиматозных органов сеголетков и годовиков говорит о несоответствии экосистемы установки с замкнутым водообеспечением экологическим потребностям карпа (Бормотова и др., 1995). Микрофлору внутренних паренхиматозных органов карпа составляли бактерии родов Aeromonas, Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Citrobacter, Alcaligenes, Staphylococcus. Основу микробиоценозов печени, почек и селезенки формировали аэромонады и бациллы, при этом видовой состав бактерий рода Bacillus в них различался незначительно (табл. 8). В целом, в микрофлоре внутренних органов доминировали бактерии Aeromonas hydrophila и неферментирующие глюкозу грамотрицательные бактерии. Появление в этих органах бактерий семейства Enterobacteriaceae, вероятно, связано с увеличением проницаемости эпителия кишечника, из-за чего представители этого семейства оказались в печени, селезенке и почках, хотя количество их в этих органах было невелико.
Особым разнообразием отличалась микрофлора кишечника (его заднего отдела). Здесь представлены все группы выделенных бактерий - аэромонады, псевдомопады, кокки, бациллы, энтеробактерии. Такие виды бацилл как В. sphaericus и В. coagulans присутствовали только в содержимом кишечника. Здесь также встречены нигде ранее не отмеченные сапрофитные бактерии рода Acinetobacter, Количественный состав энтеробактерий в кишечнике выше, чем в других органах за счет обсеменения цитробактерами. Основной микробный фон кишечника определяли бактерии рода Bacillus. Они являются нормальной микрофлорой искусственных кормов и в рыбу попали при употреблении ею гранул корма. Численность бактерий рода Bacillus составляла 23,40% в кишечнике карпов первой группы и 28,21% в кишечнике карпов второй группы (табл. 9). Аэромонады, псевдомонады, кокки, сапрофитные бактерии родов Acinetobacter и Alcaligenes, цитробактеры составляли нормальную микрофлору кишечника. По данным Л.Н. Юхимепко (1998), к этой категории моншо отнести и неферментирующих глюкозу грамотрицательиых бактерий, в том числе неферментирующих щелочеобразователей, к которым относятся представители родов Pseudomonas и Alcaligenes. Следует отметить, что псевдомонады - частые обитатели кишечника прудовых рыб, в кишечнике карпов из УЗВ практически отсутствовали. В целом, микрофлора кишечника карпа соответствует микрофлоре кишечника здоровой рыбы, в том числе по видовому составу сапрофитной микрофлоры, которая выполняет большую роль в пищеварении, особенно в синтезе незаменимых аминокислот, необходимых в белковом обмене. Данные о бактериальной обсемененности того иного органа карпа позволили сопоставить условия выращивания рыбы в УЗВ с ее обитанием в естественных условиях. Отмечена значительная зараженность микроорганизмами паренхиматозных органов карпа из УЗВ Калининградского морского рыбного порта, что свидетельствует о несоответствии условий выращивания его в рециркулируемой воде обитанию карпа в естественных экосистемах (Бормотова, Ларцева, Рогаткина, 1995). 3.3. Изменение микрофлоры карпа в УЗВ в процессе выращивания Изучение обсемененности карпа различными группами микроорганизмов по месяцам проведено впервые. В течение года микрофлора карпа претерпевала некоторые изменения. Они выражались различием качественного и количественного состава микроорганизмов в разные месяцы выращивания. Нами прослежена смена количества бактерий различных таксономических групп у карпов первой и второй групп. На рис. 3 представлено изменение численности бактерий рода Aeromonas. У карпов первой группы их обнаруживали постоянно, у карпов второй группы они дважды отсутствовали (в апреле и июне 1998 года).
Определение степени патогенности выделенных от карпа условно - патогенных бактерий для выращиваемой в установке с замкнутым циклом водообеспечения рыбы
Нами определено 1669 штаммов условно-патогенных для карпа бактерий. Это бактерии рода Aeromonas и бактерии рода Pseudomonas, которые потенциально опасны с точки зрения возникновения инфекционного заболевания. Рыбоводное хозяйство считают неблагополучным в отношении бактериальных заболеваний выращиваемых объектов, основываясь на двух главных критериях. Это отход рыб с выраженными клиническими признаками инфекционной болезни и массовое выделение от них и не погибших особей этиологического агента, обладающего вирулентностью. Для прогнозирования возможности выращивания карпа в установке с замкнутым циклом водообеспечения при допущении постоянного функционирования в них рыбопатогеппых агентов, обладающих протсолитнчсскими и гемолитическими факторами патогенности, мы провели биологическую пробу на восприимчивом виде рыб. Материалом для эксперимента послужили сеголетки и годовики карпа из учебно-опытного рыбоводного хозяйства КГТУ. Существуют два основных метода, позволяющих сделать заключение о природе выделенной бактерии как возбудителя болезни - биологическая проба на восприимчивых видах рыб и определение патогенности бактерий по степени ДНК-азной активности. Биологическая проба позволяет отличить инфекционное заболевание от заболеваний, связанных с действием токсикантов, изменением условий среды и других. Мы провели определение патогенности штаммов аэромонад, изолированными от карпа из выростных емкостей, обоими методами. Метод определения ДНК-азной активности бактерий имеет ряд преимуществ: во-первых, у бактерий, обладающих патогенными свойствами, ДНК-азная активность наиболее тесно коррелируется со способностью вызывать патологический процесс в биологической пробе (до 80-100%); во-вторых, ДНК-азная проба дает возможность испытать большее число культур, что значительно повышает достоверность полученных результатов. Мы исследовали на патогенность 86 штаммов бактерий рода Aeromonas, выделенных от карпов из УЗВ. К настоящему времени установлена прямая зависимость между вирулентностью некоторых видов бактерий и дезоксирибонуклеазной активностью, В.Ф. Борисенко (1991) отмечает, что изоляты с зоной деполимеризации ДНК от 2 мм и выше вызывали клинические проявления и гибель опытной рыбы, причем, чем выше дезоксирибопуклеазная активность, тем быстрее гибла рыба, иногда даже без развития выраженных клинических признаков. Дезоксирибонуклеазная активность исследованных нами 86 штаммов аэромопад варьировала в широких пределах, давая радиус зоны деполимеризации ДНК 0 - 7 мм (табл. 11). Степень активности дезоксирибонуклеазы штаммов Aeromonas hydrophila не была одинаковой. Патогенными преимущественно являлись аэромопады, обнаруженные нами у карпов второй группы.
Среди бактерий Aeromonas hydrophila сорок шесть определены нами как вирулентные, остальные - слабовирулентные. Проведенные исследования подтвердили, что рыба из установки с замкнутым циклом водообеспечения обсеменена патогенными аэромоиадами. Высокая вирулентность штаммов позволяет судить об их способности вызывать патологический процесс. Размножение бактерий - возбудителей в организме рыбы в условиях плотных посадок может привести к вспышке аэромоноза и гибели рыбы, По данным В.Ф. Борисенко (1991) высоковирулентные аэромонады вызывают гибель рыбы в течение суток. Карповое хозяйство Калининградского морского рыбного порта уже по результатам определения активности дезоксирибонуклеазы можно считать неблагополучным по степени риска возникновения аэромонадной инфекции. С целью подтверждения роли аэромонад в течение септического процесса у карпа и определения первичного бактерионосителя, биологическая проба проделана со штаммами Aeromonas hydrophila, изолированными с посадочного материала карпа (годовики и сеголетки, посаженные в установку с замкнутым циклом водообеспечения весной и осенью 1997 года, соответственно). Опытные штаммы аэромонад обладали протеолитической, дезоксирибонуклеазиой активностью и демонстрировали зону гемолиза на кровяном агаре размером б мм. Выбор аэромонад для проведения заражения основан на том, что данная таксономическая группа бактерий постоянно вьзделяется от прудового карпа и, по нашему мнению, при завозе рыбопосадочного материала в рыбоводное хозяйство, использующее установку с замкнутым циклом водообеспечения, где непрерывно поддерживается благоприятная для развития данных бактерий температура, последние могут спровоцировать вспышку аэромоноза. Для проведения биологической пробы использовали 180 экземпляров карпа из хозяйства прудового типа. Общее количество протестированных в эксперименте бактерий составило 2325 изолятов. Подопытным рыбам задавали гранулированный корм, лишенный посторонних микроорганизмов (прежде всего - грамотрицатсльных). Чтобы не исказить корреляцию в изменении численности бактериальной популяции при заражении испытуемым штаммом, осуществили первичный бактериологический посев пяти экземпляров рыбы. Внутримышечное заражение карпа проводили различными дозами бактериальной взвеси, содержащей штаммы Aeromonas hydrophila. Испытуемых рыб (по 5 штук) инъецировали 0,05 мл взвеси, содержащей бактериальный агент в количестве 2,0x10 КОЕ/мл, 2,0x106 КОЕ/мл, 2,0x105 КОЕ/мл, 2,0x104 КОЕ/мл и 2,0x103 КОЕ/мл. Зараженную рыбу помечали обрезанием грудного, брюшного или хвостового плавника и выдерживали в аэрируемом аквариуме в течение 30 дней. Период выдерживания определен с учетом времени, отводимым на карантин при завозе рыбы в рыбоводное хозяйство. Определена совокупная смертность карпа при внутримышечном заражении взвесью, содержащей бактерии рода Aeromonas (рис. 11). Характерным действием на зараженную рыбу отличался штамм A. hydrophila, выделенный из печени от того же посадочного материала (бактериальная культура 2). При большей вводимой дозе бактериального агента смертность карпа нарастала и достигала 100% к концу периода содержания в аквариумах (рис. 11). Полученные результаты подтверждают тот факт, что первичным носителем вирулентной микрофлоры служил завозимый в карповое хозяйство Калининградского морского рыбного порта посадочный материал прудовой рыбы. Раньше других особей гибли карпы, инъецированные большими дозами бактериальной взвеси. Клиническими проявлениями проведенного заражения, выявленными при патологоанатомическом вскрытии, стали экзофтальмия, асцит и увеличенный желчный пузырь. Первый случай гибели карпа, инъецированного наименьшей из испытанных доз 2,0x103 КОЕ/мл, зафиксирован на седьмые сутки с момента заражения. Этим способом заражения определили 50%-ную инфицирующую дозу.
Опыт проведен с двумя бактериальными культурами, поэтому получили два значения ИД 50. По отношению к первому штамму Aeromonas hydrophila: lg DL50 = ]g(2,0xl07) - 1(5,0 - 0,5) = 2,8 DL50 = 6,3x 102 КОЕ/мл По отношению ко второму штамму Aeromonas hydrophila: lgDL50 = lg(2,0xl07) -1(3,8 - 0,5) =4,0 DL50=l,0xl04 КОЕ/мл Чем больше вирулентность испытуемого штамма, тем ниже значение 50%-ной инфицирующей дозы. Заражение рыбы путем погружения в аэрируемую бактериальную взвесь проводили со штаммом Aeromonas hydrophila, выделенным от завезенного в карповое хозяйство Калининградского морского рыбного порта годовика карпа. Испытывали три дозы бактериальной взвеси: 5,0x108 КОЕ/мл (доза 1), 7,25x107 КОЕ/мл (доза 2), 5,0x104 КОЕ/мл (доза 3). Двадцать пять экземпляров карпа выдерживали в аэрируемой бактериальной взвеси в течение 0,5 ч и пересаживали в исходную емкость. Наибольшая из испытанных доз аэромонадной взвеси вызвала 100%-ную гибель рыб к окончанию срока выдерживания в аквариуме (он составил 36 суток). Значительный отход произошел на вторые сутки и затем на двенадцатые. К концу 36 -суточного эксперимента значение совокупной смертности карпа практически не изменялось, а гибель рыбы могла наступить в силу естественных причин. При уменьшении дозы бактериальной взвеси в ванне характер кривой меняется. Гибель рыб нарастала постепенно, с резким (при дозе 2) или незначительным (доза 3) увеличением численности погибших особей в отдельные дни (рис. 12). За 30 дней при меньших дозах аэрируемой бактериальной взвеси совокупная смертность составила 92% (доза 2) и 28% (доза 3). Гибель первых особей карпа (ц) в зависимости от дозы бактериальной взвеси наступила на первые, седьмые и тринадцатые сутки, соответственно для первой, второй и третьей дозы бактериального агента. Пятидесятипроцентная смертность карпа зафиксирована (тзо) только при заражении рыбы в ваннах, содержащих 5,0x108 КОЕ/мл (доза 1) и 7,25х107 КОЕ/мл (доза 2) бактерий A. hydrophila, и составила, соответственно, 8 и 19 дней.
Влияние санитарного состояния водной среды на эпизоотическое благополучие установки с замкнутым циклом водообеспечения
При изучении микробного пейзажа водной среды из рециркулируемой воды выделяли организмы - индикаторы ее санитарного состояния, а также условно-патогенные для карпа бактерии. С целью получения представления о характере микробного загрязнения оборотной воды анализировали качество воды выростных емкостей до зарыбления и динамику санитарно-бактериологических показателей за годичный период с момента завоза посадочного материала. Особое внимание уделили выяснению путей формирования микробного пейзажа воды. В качестве рабочей гипотезы выдвинуто предположение, что количественная динамика бактерий аэромонадного комплекса, во многом, определяется микробиоцепозом посадочного материала, так как завозимая из прудового хозяйства рыба служит носителем бактерий рода Aeromonas и в дальнейшем определяет их поступление в водную среду. Общая бактериальная обсемененность воды в мае 1997 года не превышала 10 КОЕ/мл, при этом доля бактерий рода Aeromonas составляла 40%, а бактерии рода Pseudomonas вообще отсутствовали в микробном пейзаже воды. В этот же период в воде не зарегистрирована кишечная микрофлора. Бактерии группы кишечной палочки, энтерококки отсутствовали в данной пробе воды. Низкий уровень органического загрязнения воды до зарыбления подтвержден данными гидрохимического анализа воды. Значение перманганатной окисляемости составило в этот период 5,84 мг Ог/л. В сентябре 1997 года перед завозом второй партии карпа общая бактериальная обсемененность воды составила 4,6x103 КОЕ/мл. Доля аэромопад в микробном пейзаже воды в данном месяце составляла 60% и также отсутствовали псевдомонады. Бактерии группы кишечной палочки входили в состав микробиоценоза воды, но не занимали доминирующего положения. После завоза посадочного материала, начиная с момента карантинизации, продолжили работу по выяснению качества рециркулируемой воды.
Сразу была зарегистрирована вспышка численности сапрофитных бактерий, в том числе бактерий аэромонадной группы. Для подтверждения гипотезы о роли завозимой рыбы в создании фона условно-патогенных бактерий в водной среде параллельно проводили работу по изучению микробного пейзажа карпа. Доля аэромоиад в микрофлоре оборотной воды всегда была достаточно высокой (табл. 16). Почти во вес месяцы они доминировали над другими группами бактерий, за исключением декабря 1997 года, когда их вытеснили бактерии группы кишечной палочки. Уровень органической нагрузки, приходящейся па выростные емкости, за весь период наблюдения колебался в небольших пределах, что подтверждено значениями численности сапрофитных микроорганизмов. Динамика численности бактерий в рециркулируемой воде имеет вид кривой, и характеризуется резкими спадами или подъемами в отдельные месяцы (рис. 15). Пик численности бактерий приходился на июль 1997 года, январь - февраль и июнь 1998 года. Он обусловлен режимом работы оборудования по очистке оборотной воды. Поскольку уровень бактериального загрязнения воды при нарушении нормального функционирования технологического оборудования не вызывал гибели выращиваемой рыбы, а в остальные периоды не выходил за пределы нормативных значений общей бактериальной обсемененности воды, считаем возможным, применительно к УЗВ, установить ее пороговое значение па отметке, не превышающей 105 КОЕ/мл и, соответственно, верхнее значение представленности бактерий рода Aeromonas в микробном пейзаже определить на уровне 70% (табл. 16). Наши выводы согласуются с критериями эпизоотического благополучия воды УЗВ, разработанными В.10. Жезмер и др. (1988). Изучение качественного состава микроорганизмов, составляющих фон водной среды УЗВ, проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам 40 штаммов. Микробный пейзаж воды сформирован бактериями немногочисленных таксономических групп. Это типичные представители рода Aeromonas (70,0%), рода Citrobacter (30,0%) с двумя видами С. freundii (27,5%) и С. amalonaticus (2,5%). Сопутствующими микроорганизмами во все месяцы наблюдения за микробиоценозом водной среды выступали бактерии Alcaligenes faecalis. Так как последние являются постоянным компонентом водной среды и не представляют угрозы для разводимого объекта, при оценке качества воды их роль не учитывали. Аэромонады представлены единственным видом Aeromonas hydrophila. Небольшое количество штаммов данного вида обладало какими-либо факторами патогенности - 25,0%. Ими проявлена протеолитическая и гемолитическая (с зоной гемолиза 2-3 мм) активность. Динамика качественного состава водных микроорганизмов по месяцам не имеет четко выраженного характера ввиду малочисленности сравниваемых видов бактерий (рис. 29). К началу разгрузки выростных емкостей, соотношение аэромонад и энтеробактерий не меняется. В течение полугодия (начиная с января 1998 года) санитарное состояние рециркулируемои воды не претерпевало значительных изменений.
Это свидетельствует, во-первых, об однородности водной среды при содержании рыбы, во-вторых, о постоянном несоответствии параметров очистки рециркулируемои воды техническим нормативам. Таким образом, плотность посадки рыбы не оказывала заметного воздействия на уровень органической нагрузки в выростных емкостях в конце периода выращивания. На протяжегши последних шести месяцев наблюдения он поддерживался на высоком уровне. Соотношение аэромонад и энтеробактерий в воде выростных емкостей 2:1 с января по июнь 1998 года (до окончания периода выращивания карпа в УЗВ) также не способствовало самоочищению воды. Только бесперебойная работа очистного оборудования и загрузка биофильтра подходящими гетеротрофными микроорганизмами определяют возможность эксплуатации рециркулируемых систем, Таким образом, функционирование технологического рыбоводного оборудования в рабочем режиме без сбоев и остановок гарантирует безопасность водной среды для рыбоводных объектов. В случае нарушения этого условия ведущая роль в формировании микробиоценоза воды отводится вносимым с посадочным материалом микроорганизмам. Качественный состав микроорганизмов, присутствующих в рециркулируемой воде, весьма беден, в то же время условно-патогенные для выращиваемого карпа бактерии рода Aeromonas - постоянные члены микробиоценоза воды. Анализ общей бактериальной обсемененности воды и соотношения выделенных из водной среды групп бактерий дает информацию о процессах накопления и трансформации органического вещества в выростных емкостях. 5.3. Влияние санитарного состояния кормов на эпизоотическое благополучие индустриального хозяйства с замкнутым циклом водообеспечения Исследования микробного пейзажа корма "Aller carp grow supplement" проводили с целью определения показателей его микробиологической безопасности как одного из главных факторов, определяющих здоровье выращиваемой рыбы. Корма датского производства "Aller Moller" для кормления товарного карпа постоянно закупались карповым хозяйством Калининградского морского рыбного порта. Его завозили в герметично упакованных пакетах и хранили в сухом, просторном помещении. Корма реализовали до окончания срока хранения. Бактериологический анализ корма производили раз в квартал, с июля 1997 по июнь 1998 года. Навеску корма отбирали «методом средней пробы» в стерильные пакеты. Уровень общей бактериальной обсемененности корма "Aller carp grow supplement" за все время исследования не превышал нормативного значения, колеблясь от 1,0x103 до 6,0x105 КОЕ/г (табл. 17). Проследить динамику обсемененности кормов не удалось, так как навески его изымались из разных пакетов, соответствующих различному размеру гранул.
