Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы
1. Патогенез иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции
1.1. Последствия персистенции вируса иммунодефицита человека
1.2. Характеристика иммунологических маркеров CD38, CD28, CD57, CD45RO, CD45RA
1.3. Значение изменения иммунологических маркеров при ВИЧ- инфекции
2. Патогенез туберкулеза 22
3. Современные аспекты ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом
3.1. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом
3.2. Возможные механизмы взаимного влияния инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека и микобактерией туберкулеза
3.3. Изменения иммунологических маркеров при ВИЧ-инфекции 3в сочетании с туберкулезом
Часть II. Собственные исследования
Глава 1. Материалы и методы исследования 33
Глава 2. Клиническая характеристика пациентов 47
Глава 3. Влияние терапии на клиническую картину и иммунные показатели у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом
3.1. Динамика клинической симптоматики на фоне проводимой терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом
3.2. Динамика вирусной нагрузки у больных ВИЧ-инфекцией 56
3.3. Сравнительная характеристика количества CD4-, CD8- и CD3-лимфоцитов у больных исследуемых групп перед началом терапии
3.4. Динамика CD4-, CD8- и CD3 -лимфоцитов на фоне проводимой терапии у больных исследуемых групп
Глава 4. Особенности фенотипа CD4- и С08-лимфоцитов и его динамика под влиянием терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом
4.1. Сравнительная характеристика фенотипа CD4- и CD8- лимфоцитов в исследуемых группах
4.2. Динамика изменений фенотипа CD4- и СВ8-лимфоцитов на фоне проводимой терапии в исследуемых группах
Глава 5. Клинические примеры 89
Обсуждение результатов 99
Выводы 109
Практические рекомендации 110
Список использованной литературы
- Патогенез иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции
- Современные аспекты ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом
- Динамика клинической симптоматики на фоне проводимой терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом
- Сравнительная характеристика фенотипа CD4- и CD8- лимфоцитов в исследуемых группах
Введение к работе
Актуальность проблемы
В течение последних 10 лет в Российской Федерации регистрируют неуклонный рост числа больных ВИЧ-инфекцией. К середине 2010 г., согласно данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом, зарегистрировано более 550 тысяч граждан России, инфицированных ВИЧ. При высокой распространенности у населения микобактерий туберкулеза ВИЧ-инфекция способствует переходу состояния инфицированности в заболевание туберкулезом, что приводит к вторичной эпидемии туберкулеза. За последние годы выявлено увеличение смертности пациентов с ВИЧ-инфекцией от туберкулеза, который в настоящее время, занимает лидирующее место в структуре смертности больных ВИЧ-инфекцией: более 50% случаев летальных исходов у больных ВИЧ-инфекцией обусловлено туберкулезом. Причина такой высокой летальности заключается в преобладании атипичной клинической картины и отсутствия четких диагностических критериев выявления туберкулеза у ВИЧ-инфицированных лиц, что приводит к несвоевременному установлению диагноза и запоздалому назначению эффективной противотуберкулезной терапии [Михайлова Л.А., Шинкарева И.Г., Фролова О.П., 2010; Михайловский A.M. , 2009; Бабаева И.Ю, Демихова О.В., Кравченко А.В., 2010].
Большое внимание в настоящее время уделяется особенностям иммунного ответа при сочетанной патологии ВИЧ и туберкулез и иммуноопосредованным механизмам взаимного влияния этих инфекций на иммунный ответ. ВИЧ-инфекция характеризуется постепенным снижением С04-лимфоцитов, количество которых продолжает оставаться основным лабораторным маркером прогрессии ВИЧ-инфекции [Бобкова М.Р., 2006; Покровский В.В., 2010; Mandy Francis, Jan Nicholson, Brigitte Autran et al., 2002]. Уменьшение количества СБ4-лимфоцитов ниже определенного уровня сопровождается повышенным риском развития оппортунистических заболеваний и является критерием для назначения антиретровирусной терапии.
Расширение спектра антиретровирусных препаратов и применение средств комбинированной фармакотерапии, начиная с 1996 года, привело к существенному увеличению сроков и качества жизни ВИЧ-инфицированных пациентов [Бобкова М.Р., 2002; Какорина Е.П., Фролова О.П., Шинкарева И.Г., 2007; Кравченко А.В., Канестри В.Г., 2007; Beck-Sague С, Dooley S.W., Hutton M.D. et al., 1992]. На фоне значительного снижения частоты некоторых оппортунистических заболеваний возросла роль туберкулеза, способного повлиять на долгосрочное течение ВИЧ-инфекции. Кроме того, туберкулез является частой манифестацией иммуносупрессивного состояния, вызванного ВИЧ-инфекцией [Литвинова Н.Г., Кравченко А.В., Шахгильдян В.И., Груздев Б.М., 2007; Чернова О.Э., Знаменская Е.П., Каравашкин В.А., 2007]. D. Goletti, D. Weissman, R.W. Jackson и др. в 1996 году показали, что среднее количество СР4-лимфоцитов во время установления диагноза туберкулеза у ВИЧ-инфицированных составляет в среднем 326 клеток/мкл. Смертность ВИЧ-инфицированных пациентов, больных туберкулезом намного выше, чем ВИЧ-инфицированных пациентов без туберкулеза даже при одинаковом количестве CD4-iaieTOK [Fischl М.А., Uttamchandani R.B., Daikos G.L. et al., 1992].
Поскольку развитие туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией не всегда связано со снижением количества СБ4-лимфоцитов, то подсчет только числа CD4-KneTOK может быть недостаточным для оценки состояния иммунной системы у данной категории пациентов.
Исследование других маркеров фенотипа в настоящее время крайне ограничено. Это объясняется малой изученностью экспрессии поверхностных молекул CD4- и CDS-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов и их клинического значения этих изменений. Тем временем, определение экспрессии маркеров фенотипа, по мнению многих исследователей, может дать дополнительную информацию о прогнозе течения заболевания, эффективности антиретровирусной терапии и тактики ведения больного.
Недавние исследования показали, что изменения фенотипа CD8-лимфоцитов (экспрессия CD38) наблюдаются при диссеминированном туберкулезе [Rodngues DS, Salomao R, Kallas EG, 2006], а также имеют большую значимость для оценки прогрессирования ВИЧ-инфекции по сравнению с вирусной нагрузкой и количеством CD4 [Borkov G., Qibin L., Bentwich Z., 2001; Ситдыкова Ю.Р., 2006].
Кроме того, наблюдается изменение соотношения «наивных» Т-клеток-ранее не встречавшихся с антигеном, и клеток памяти [Бобкова М.Р., 2006; Ситдыкова Ю.Р., 2006; McCune Joseph М., 2001; Scharker Timoty W MD et al., 2010; Market M.L., Alvares-McLeod A.P., Sempowski G.D. et al, 2001], а также отмечается нарушение экспрессии CD28 - важнейшей ко-стимулирующей молекулы, необходимой для эффективного иммунного ответа [Бобкова М.Р., 2006; Ситдыкова Ю.Р., 2006; Swigut Т., Shohdy N., Skowronski J., 2001]. Вопрос о клиническом значении этих маркеров и возможности коррекции иммунных нарушений под влиянием антиретровирусной и противотуберкулезной терапии у больных с сочетанием ВИЧ-инфекции и туберкулеза остается открытым.
Таким образом, значительный рост случаев туберкулеза среди больных ВИЧ-инфекцией, выявленные иммунологические изменения у этих больных, свидетельствуют о необходимости определения дополнительных иммунологических маркеров для оптимизации мониторинга и лечения туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Цель работы
Изучение динамики иммунологических показателей у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом для совершенствования эффективности лечения.
Задачи исследования:
1. Сравнить показатели клеточного иммунитета (CD4-, CD8 и CD3-лимфоцитов) у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом и у больных с моноинфекцией (ВИЧ; туберкулез) до начала терапии.
Изучить динамику показателей клеточного иммунитета (CD4-, CD8 и CD3-лимфоцитов) на фоне терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом.
Выявить особенности изменений фенотипа CD4- и CD8- лимфоцитов до начала терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом по сравнению с больными с моноинфекцией (ВИЧ; туберкулез) по экспрессии иммунологических маркеров: CD28, CD57, CD38, RO, RA.
Выявить влияние антиретровирусной и противотуберкулезной терапии на фенотип CD4- и CD8- лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом.
Определить наиболее информативные показатели системы иммунитета для оценки прогноза течения заболевания и эффективности терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом.
Научная новизна исследования
Впервые в России у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом изучена экспрессия Т-клетками активационных и функциональных маркеров (CD28, CD57, CD38, RO, RA, CD62L) в сравнении с контрольной группой здоровых лиц и группами больных с моноинфекциями ВИЧ и туберкулез.
Впервые проведен анализ изменения экспрессии иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной и противотуберкулезной терапии и определено значение этих изменений в соответствии с клинической картиной.
Выявлена зависимость исходного фенотипа лимфоцитов и иммунного ответа на лечение у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом.
Практическое значение работы
Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания CD4-лимфоцитов от начального % «наивных» СВ4-лимфоцитов, что позволяет рекомендовать данный показатель как маркер эффективности терапии, а также как один из критериев более раннего начала антиретровирусной терапии.
Наиболее значимые изменения фенотипа, как до назначения терапии, так и в процессе эффективной антиретровирусной и противотуберкулезной терапии наблюдаются в экспрессии CD38 на CDS-лимфоцитах, что свидетельствует об эффективности проводимой терапии.
Выявлено, что увеличение доли CD8-KneTOK, несущих маркер CD57 и CD28 из общего числа CD8- лимфоцитов, в процессе ПТТ и АРВТ также может свидетельствовать об эффективности проводимой терапии.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в практику работы Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом, а также используются при подготовке лекций для врачей-инфекционистов и врачей лаборантов в рамках обучающих семинаров и сертификационных циклов ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Апробация диссертации
Материалы диссертации были доложены на Совещание специалистов ЦФО по актуальным вопросам ВИЧ-инфекции (Бекасово, 10-13 марта 2009), Ш Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Туберкулез с лекарственной устойчивостью микобактерий у больных ВИЧ-инфекцией» (Москва, 12-13 мая 2009), Ш Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии (Москва, 28-30 октября 2009), и 12-th European Aids Conference (Кельн, 11-14 ноября, 2009), на Конференции молодых ученых «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней» (Москва, 24-25 ноября, 2009), П Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29-31 марта, 2010) и 10-th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection (Глазго, 10-13 ноября, 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 в изданиях рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 44 отечественных и 69 зарубежных источника литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками, 19 таблицами и 3 клиническими примерами.
1. Патогенез иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции
1.1. Последствия персистенции ВИЧ
Хорошо известно, что ведущим механизмом в патогенезе ВИЧ-инфекции являются нарушения системы иммунитета [20,23,30,36,99]. Установлено, что, проникнув в организм человека, вирус с помощью гликопротеида оболочки gpl20 фиксируется на мембране клеток, имеющих рецептор - CD4+ и корецептор CCR5, либо его аналог CXCR4. Вирус сливается с мембраной клетки, затем происходит дезинтеграция вирусного ядра и выброс РНК ВИЧ в цитоплазму. С помощью фермента ревертазы РНК подвергается транскрибированию в двухнитевую ДНК, которая встраивается в геном клетки с помощью интегразы [4,31].
Рецепторы CD4 находятся на поверхности Т-хелперов (CD4-лимфоциты), играющих центральную роль в иммунном ответе, а также клеток нервной системы (нейроглии), моноцитов, макрофагов, эндотелия сосудов и др. [27].
Образование молекулярного комплекса gpl20 CD4 активирует синтез ФНО-а, который в свою очередь способствует репликации вируса, находящегося в «дремлющем» состоянии [58].
Ведущую роль в патогенезе иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции играет постоянная активация клеток иммунной системы в ответ на персистирование вируса в организме [93].
Недавние исследования показали, что CDS-лимфоциты цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) при ВИЧ-инфекции имеют ряд аномалий. Было обнаружено нарушение пролиферации и созревания CD8-клеток, снижение количества внутриклеточного перфорина и связанную с этим пониженную их лизирующую способность [60,62,74]. Существует целый ряд причин снижения активности ЦТЛ: сокращение выработки ИЛ-2 и ИФН-у как факторов, поддерживающих дифференцировку и активность ЦТЛ; инфицирование CD8 лимфоцитов; нарушение презентации антигена [35]. Еще одна причина снижения активности ЦТЛ - снижение МНС I, вследствие чего вирус-инфицированная клетка избегает лизиса, опосредованного ЦТЛ [4].
Неспецифическая стимуляция иммунной системы напрямую связана с ВИЧ-инфекцией, и тем выше, чем сильнее репликация вируса. О стимулированном иммунитете свидетельствуют соответствующие поверхностные молекулы на Т- и В-лимфоцитах, высокий уровень провоспалительных цитокинов в плазме крови, а также то, что лимфоциты, полученные от ВИЧ-инфицированных, часто находятся в митотическом цикле. Положительная окраска на ядерный антиген Ki-6, увеличение количества ДНК и накопление бромдезоксиуридина свидетельствуют о вступлении Т-лимфоцитов в период S митотического цикла [100,103,105].
Причиной хронической иммунной активации может быть появление в крови большого количества продуктов микробного распада -липополисахаридов (ЛПС). Эти данные подтверждаются снижением уровня ЛПС под влиянием антиретровирусной терапии [57,64]. Так, в первые недели после заражения происходит массовая гибель С04-лимфоцитов, основная часть которых находится в лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта. В результате повышается проницаемость слизистой оболочки тонкого кишечника и продукты распада микроорганизмов попадают в кровяное русло.
Активация также является одним из пусковых факторов апоптоза. Повышенная чувствительность к апоптозу обусловлена увеличением экспрессии CD95 активированными Т-клетками [26]. Кроме того, уменьшение синтеза ИЛ-2 при ВИЧ-инфекции приводит к пониженной экспрессии bcl-2, что также увеличивает чувствительность клеток к апоптозу [85]. Помимо этого, усиление апоптоза происходит за счет повреждения мембраны митохондрий и подавления транскрипции гена NF-kB, отвечающего за подавление апоптоза, вспомогательным вирусным белком Vpr [4]. ВИЧ-инфицированные лимфоциты могут погибать также вследствие цитотоксического действия ФИО, реализуемого посредством апоптоза [39].
При наличии чужеродного, ранее не встречавшегося антигена, происходит активация «наивных» CD4- и СБ8-лимфоцитов. Активация происходит при образовании комплекса TCR с MHC-I для CD8-лимфоцитов и МНС-П для СБ4-лимфоцитов и при наличии в обоих случаях ко-стимулирующего сигнала CD28. «Наивные» клетки начинают активно размножаться и пролиферируют в эффекторные клетки и клетки памяти. Активная репликация вируса происходит, главным образом, в «наивных» (CD45RA+) и клетках памяти (CD45RO+), поскольку эти клетки способны к делению. Эффекторные клетки, которые тоже имеют фенотип CD45RO+, утрачивают способность к делению и погибают после выполнения своей функции [4]. В результате у ВИЧ-инфицированных пациентов наблюдается изменение соотношения «наивных» CD4- лимфоцитов (CD45RA+CD62L+) и клеток с фенотипом CD4+CD45RO+ - относительное содержание «наивных» клеток уменьшается, клеток памяти - увеличивается. При этом «репертуар» (разнообразие) Т-клеточного рецептора (TCR), в норме обеспечивающего ответ на большое количество разных антигенов, становится ограниченным [96].
Есть и другая точка зрения на причину изменения соотношения «наивных» лимфоцитов (CD45RA+CD62L+) и клеток с фенотипом CD45RO+[4,76]: ВИЧ снижает представление TCR CD4- и CD8-лимфоцитами, а также уменьшается количество вирусных антигенов, представленных MHC-I и МНС II при помощи вспомогательных вирусных белков, что препятствует естественной активации Т-лимфоцитов. В этом случае не происходит образования эффекторных клеток и клеток памяти через пролиферацию «наивных» клеток. А поскольку ВИЧ также способен заражать неделящиеся клетки в отличие от остальных ретровирусов, размножение его в неделящихся или медленнее делящихся «наивных» клетках продолжается и приводит к их катастрофическому снижению.
ВИЧ-инфекция характеризуется прогрессирующим снижением количества С04-лимфоцитов, для объяснения чего предложено несколько механизмов.
Во-первых, С04-лимфоциты являются основной мишенью для ВИЧ. Вирус оказывает прямое цитотоксическое действие на инфицированные им клетки [70]. Гибель лимфоцитов может происходить в результате образования синцитиев - гигантских многоядерных клеток, формирующихся при слиянии инфицированных и неинфицированных С04-лимфоцитов. Показано, что при выявлении в крови у пациента штаммов вируса, вызывающих образование синцития, ВИЧ-инфекция прогрессирует быстрее [4,36,73].
Помимо прямого цитотоксического действия, ВИЧ запускает клеточный и гуморальный иммунный ответ, который приводит к гибели как инфицированных, так и неинфицированных СБ4-лимфоцитов, несущих на своей поверхности вирус или его антигены. Противовирусную защиту обеспечивают цитотоксические лимфоциты, естественные киллеры и антитела [27,36,50].
Нарушение продукции С04-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции связано не только с поражением лимфоцитарного, но и других ростков кроветворения [84]. Фенотипический и функциональный анализ клеток -предшественников в костном мозге обнаруживает различные аномалии этих клеток. Причины этих нарушений недостаточно ясны. Несмотря на то, что полипотентные стволовые гемопоэтические клетки слабо экспрессируют рецептор CD4 и ко-рецепторы CXCR-4 и CCR-5, по мнению некоторых исследователей, они напрямую не поражаются вирусом [56]. По-видимому, под действием ВИЧ изменяется микроокружение столовых клеток, в результате этого нарушается их нормальная пролиферация и дифференцировка.
Еще одной мишенью для ВИЧ является тимус - специализированный лимфоидный орган, в котором проходят дифференцировку Т-лимфоциты. В тимусе имеется большое количество CD4+ клеток на разных стадиях созревания [27]. При морфологическом исследовании тимуса у ВИЧ-инфицированных пациентов обнаруживается уменьшение количества тимоцитов и другие изменения структуры. В пользу данной гипотезы свидетельствует и то, что при внутриутробном заражении плода ВИЧ быстрое прогрессирование заболевания наблюдается у 20-30% детей [96]. В основе этого, по-видимому, лежит разрушение вирусом клеток-предшественников в тимусе, и, как следствие, глубокое нарушение его функции. Быстрое прогрессирование ВИЧ-инфекции наблюдается и у лиц пожилого возраста, у которых тимус отсутствует вследствие инволюции. Оба эти наблюдения подтверждают важную роль тимуса в поддержании пула «наивных» Т-лимфоцитов и пополнении их запаса в условиях ускоренной гибели.
Помимо снижения С04-лимфоцитов в результате прямого и опосредованного действия ВИЧ, наблюдается также и снижение их функциональной активности. Причиной этого, вероятно является продуцированное ВИЧ снижение представления антигенов через МНС-П, нарушение ко-стимуляции в результате уменьшения экспрессии рецептора CD28 [4,106].
Таким образом, основные иммунологические нарушения при ВИЧ-инфекции связаны не только с уменьшением количества С04-лимфоцитов, но и с изменением функциональной активности CD4- и CDS-лимфоцитов, что проявляется в изменении экспрессии поверхностных рецепторов.
1.2. Характеристика иммунологических маркеров CD38, CD28, CD57, CD45RO и CD45RA
Молекула CD38 представляет собой одноцепочечный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 45 кДа, который может функционировать в качестве димера [90]. CD38 - это фермент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция. Кроме этого, данный фермент обладает целым рядом других активностей: как аденозиндифосфат рибозил циклазной, циклической аденозиндифосфат рибозил гидролазной и NAD гликогидролазной активностью. Данная молекула также играет роль рецептора, модулируя межклеточные взаимодействия и является переносчиком трансмембранных сигналов [88]. Антиген экспрессируется на ранних стадиях дифференцировки Т- и В-лимфоцитов и исчезает на промежуточных стадиях созревания, затем вновь появляется на терминальных стадиях [78]. Выявлено, что связывание CD38 антигена, экспрессированного на В-клетках человека, зависит от стадии дифференцировки последних. Зрелые В-лимфоциты селезенки, экспрессирующие BCR, пролиферируют в ответ на передачу сигнала через CD38 антиген. У незрелых В-лимфоцитов костного мозга в этом случае происходит блокирование В-лимфопоэза, в основном за счет индукции апоптоза. Возможно, это объясняется существованием ряда тканево-специфичных лигандов для CD38 антигена, которые могут модулировать способность рецептора к передаче сигнала, а также его биологические функции. [69].
Недостаточная экспрессия этого антигена у животных создает заметный дефицит гуморального иммунного ответа [89].
В ряде работ приведены данные о том, что обработка CD38+ NK-клеток антителами против CD38 приводит к активации их литической способности. Однако это происходило только в тех случаях, когда было возможно взаимодействие CD38 со специализированными сигнальными молекулами [40]. CD28 представляет собой двуцепочечный гомодимер трансмембранного гликопротеина с молекулярной массой 44 кДа. Экстрацеллюлярная часть по строению напоминает иммуноглубулин. Экспрессируется на тимоцитах, всех СБ4-клетках и 50% CDS-лимфоцитах [80].
Молекула CD28 играет чрезвычайно важную роль в иммунных реакциях. Известно, что иммунный ответ начинается с распознавания антигена лимфоцитом. Антиген представляется лимфоциту антиген-презентирующей клеткой (АПК), которая «выбрасывает» процессированный антиген на поверхность в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости. После этого CD4 или CD8 Т-лимфоцит распознает антиген. Однако, для пролиферации «наивных» Т-клеток и их дифференцировки в эффекторные клетки необходим второй или ко-стимулирующий сигнал, полученный от той же антиген-презентирующей клетки, на которой Т-лимфоцит распознал антиген. Рецептором для ко-стимулирующего сигнала на Т-лимфоците и является CD28 [27,79]. CD57 - антиген естественных киллеров, который участвует в клеточной адгезии. В лимфоидной ткани CD57 экспрессируется покоящимися NK-клетками, субпопуляцией Т-клеток, некоторыми патологическими В-клетками, клетками нейроэктодермального происхождения.
Считается, что появление маркера CD57 свидетельствует о многократном предшествующем делении клетки и указывает на репликативное старение лимфоцитов. Клетки, экспрессирующие CD57, имеют низкое содержание TREC и склонны к апоптозу [56]. CD45RA и CD45RO, являясь изоформой CD45, представляют собой функциональные маркеры, показывающие, встречалась ли данная клетка с антигеном [27,79]. Маркер CD45 - это трансмембранная молекула, состоящая из 1120-1281 аминокислот, из которых 391-552 формируют внеклеточный домен и 707 составляют длинный цитоплазматический участок. CD45 находится на поверхности всех ядерных гемопоэтических клеток и их предшественников с крайне высокой концентрацией (более 100000 копий на клетку) и присутствует на большинстве лейкоцитов. На Т- и В-клетках он занимает примерно 10% всей клеточной поверхности. Таким образом, этот рецептор необходим для активации и развития клетки и контроля сигналов через рецепторы для цитокинов. CD45RA (205-220 кДа) - наивные Т-лимфоциты, представляют собой клетки, ранее никогда не встречавшиеся с антигеном. CD45R0 (180 кДа) - располагается на Т-лимфоцитах памяти и эффекторных клетках, клетках уже встречавшихся с антигеном и выполняющих свою функцию. Для Т-лимфоцитов памяти характерна более высокая скорость пролиферации по сравнению с «наивными» клетками, для перехода в активированное состояние им требуется гораздо меньший стимул. Для эффекторных клеток способность к делению снижена, но процессы жизнедеятельности заметно оживляются. Большая часть (90%) эффекторных клеток, выполнив свою задачу, погибает [4].
1.3. Значение изменения маркеров CD38, CD28, CD57, CD45RO, CD45RA при ВИЧ-инфекции
Помимо уменьшения количества СБ4-лимфоцитов, у ВИЧ-инфицированных пациентов наблюдаются многочисленные изменения экспрессии поверхностных маркеров как СБ4-лимфоцитов, так и CD8-лимфоцитов.
У ВИЧ-инфицированных пациентов наблюдается уменьшение экспрессии CD28, как CD4, так и CDS-лимфоцитами. Причины этого полностью не ясны. Возможно, уменьшение экспрессии CD28 является следствием нарушения профиля цитокинов при ВИЧ-инфекции. В пользу этой гипотезы говорят результаты исследования, в котором лечение пациентов ВААРТ в сочетании с интерлейкином 2 приводило к большему увеличению числа CD4, экспрессирующих CD28 по сравнению с контрольной группой пациентов, получавших только антиретровирусные препараты [85].
Существует также предположение, что снижение экспрессии CD28 происходит под действием Nef - протеина ВИЧ [4,106]. Effros и соавторы изучали CD28- негативные CD8 и обнаружили, что эти клетки имеют укороченные теломеры и слабую способность к репликации, что, по-видимому, отражает репликативное старение, и отчасти объясняет потерю контроля над вирусом [65]. В другом исследовании была выявлена зависимость между активностью теломеразы и экспрессией CD28: снижение активности теломеразы сопровождалось потерей CD28 [109]. Уменьшение репликативной способности CD28- негативных CD8 лимфоцитов описывается и другими авторами [61]. Предположительно, количество CD8+CD28+ лимфоцитов может служить критерием прогноза прогрессирования ВИЧ-инфекции [34].
С другой стороны, Weekes и соавторы, изучавшие субпопуляцию CD8+CD28- лимфоцитов, обнаружили среди этих клеток большое количество ВИЧ-специфичных клонов [112]. Lewis и его коллегами предшественники ВИЧ-специфичных ЦТЛ были обнаружены как среди CD8+CD28+, так и среди CD8+CD28-CD57+ лимфоцитов, и в меньшей степени среди CD8+CD28-CD57- лимфоцитов. Более того, большее количество предшественников ВИЧ-специфичных ЦТЛ, экспрессирующих CD28, было обнаружено у пациентов с соотношением CD4:CD8 >1, в то время как у пациентов с соотношением < 1 чаще обнаруживались предшественники ЦТЛ с фенотипом CD8+CD28-CD57+. Авторы предполагают, что утрата CD8 лимфоцитами CD28 по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции может сопровождаться уменьшением иммунного ответа на появление новых мутаций вируса [86].
Кроме того, ВИЧ-специфичные СБ8-лимфоциты характеризуются особенностями фенотипа. Brenchley с соавторами обнаружена связь между способностью ВИЧ-специфичных CD8 пролиферировать в ответ на антигенную стимуляцию и экспрессией маркеров CD28 и CD57 [56]. Brenchley считает, что потеря способности пролиферировать в большей мере характеризуется не утратой маркера CD28, а появлением маркера CD57 на поверхности CD8. По мнению авторов, экспрессия CD57 отражает множественные предшествующие деления и репликативное старение CD8 лимфоцитов. Клетки, экспрессирующие CD57, имеют укороченные теломеры, низкое содержание TREC и склонны к апоптозу. Важно отметить, что ВИЧ-специфичные CD8 Т-клетки составляют большую часть (до 80%) Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD57 [113].
У больных ВИЧ-инфекцией обнаружено снижение экспрессии CD28 и повышение экспрессии CD57 CDS-лимфоцитами, что отражает снижение способности клеток к делению. Под влиянием ВААРТ экспрессия CD28 повышалась, экспрессия CD57 имела волнообразную динамику [34].
Недавние исследования показали, что экспрессия Т-лимфоцитами CD38 находится в прямой корреляционной связи с количеством РНК ВИЧ в плазме, и обратной - с количеством CD4-лимфоцитов [34,54,77]. По мнению некоторых исследователей, экспрессия маркеров активации CD8 лимфоцитами имеет большую значимость для оценки прогрессирования заболевания по сравнению с вирусной нагрузкой и количеством CD4. Под влиянием антиретровируснои терапии происходило уменьшение количества CD8+CD38+ клеток, что свидетельствовало об эффективности лечения. Исследование экспрессии CD8 лимфоцитами CD38 рекомендовано в качестве маркера для оценки эффективности антиретровируснои терапии, в случае, если по какой-либо причине исследование вирусной нагрузки невозможно [34,71].
У пациентов, инфицированных ВИЧ, выявлено снижение числа «наивных» CD4 Т-клеток и клеток памяти, а также их соотношения среди популяции CD4-лимфоцитов: уменьшение доли «наивных» клеток и увеличение доли клеток памяти. Под влиянием антиретровируснои терапии наблюдался прирост обеих субпопуляций CD4 Т-клеток, увеличение соотношения «наивных» клеток и клеток памяти за счет большего прироста числа «наивных» клеток [34]. Scharker et al. предлагают использовать % «наивных» СБ4-лимфоцитов не только для прогнозирования роста С04-лимфоцитов на фоне терапии, но и в качестве нового маркера для определения более раннего момента, для определения показаний к началу АРВТ [104].
Имеются данные о благоприятном прогнозе эффективности антиретровируснои терапии у ВИЧ-инфицированных при исходно высоком соотношении «наивных» CD4 и клеток памяти, относительно низкой экспрессии С04-лимфоцитами маркера CD95, а также высокой экспрессии СБ8-лимфоцитами молекулы CD28 и низкой - маркеров CD38, CD57; обратные тенденции в значениях перечисленных показателей прогнозируют слабый иммунный ответ на лечение [34].
Таким образом, наибольшее значение в оценке эффективности лечения имеют поверхностные рецепторы CD38, CD57, CD28, CD45RA, CD45RO.
2. Патогенез иммунологических нарушений при туберкулезе.
Согласно современным представлениям, ключевую роль в формировании иммунитета к туберкулезной инфекции играют альвеолярные макрофаги и различные субпопуляции Т-клеток [51]. В большинстве случаев при низкой антигенной нагрузке (единичные микобактерий) элиминация патогена происходит «силами» врожденного иммунитета. Однако в ряде случаев, когда этого недостаточно, запускается система приобретенного иммунитета. Исход взаимодействия макрофагов и микобактерий туберкулеза зависит от баланса антимикробной активности фагоцитирующих клеток и резистенности микобактерий к бактерицидному действию макрофагов. Общий механизм специфического ответа иммунной системы при попадании микобактерий в легкие условно можно представить следующим образом.
При попадании в легкие микобактерий подвергаются фагоцитозу альвеолярными макрофагами. Альвеолярные макрофаги не могут эффективно уничтожать фагоцитированные микобактерий, поэтому бактерии могут выжить внутри и способны реплицироваться, блокируя созревание фагосомы. Миграция альвеолярных макрофагов к ближайшим лимфатическим узлам активирует Т-клеточный ответ.
Т- клетки хелперного ряда, несущие маркер CD4, распознают комплекс молекулы МНС класса II с пептидами антигенов. В результате распознавания такого комплекса CD4-лимфоциты могут дифференцироваться либо в Txl, либо в Тх2. Первичный иммунный ответ чаще всего приводит к появлению Т-хелперов 1 типа (Txl). Основной функцией Txl является организация и поддержание формирования гранулем вокруг зараженных макрофагов. Именно формирование гранулем является протективным фактором при защите от туберкулеза [59,101]. Дифференцированные Txl также участвуют в активации СБ8-лимфоцитов, обеспечивающих протекцию против внутриклеточных паразитов. Еще одной важной функцией Txl является их помощь фагоцитам в усилении внутриклеточного клиренса за счет индукции слияния фагосом с лизосомами, что позволяет удалять патогены, персистирующие в фагосомах фагоцитов [91].
Активированные СВ4-лимфоциты секретируют хемокины, которые привлекают моноциты из циркуляции к местам воспаления. Они также секретируют ФНО-а, ответственный за образование гранулемы. Причиной является опосредованное действием ФНО-а утолщение и фиброз стенки гранулемы, а также индуцированное ИЛ-4 слияние макрофагов с образованием гигантских клеток (клетки Лангханса). у-Интерферон может активировать туберкулостатические макрофаги, например, стимулируя синтез кальцитриола- вещества, активирующего действие микробицидных факторов, активированные макрофаги выделяют кислородсодержащие продукты и протеазы, вызывая тем самым некроз центральной части гранулемы [27]. S.Yamamoto, M.Wada, I.Toida (1993) рекомендуют проводить мониторное слежение за уровнем СТ)4-лимфоцитов, поскольку именно данный показатель позволяет прогнозировать течение туберкулеза и корректировать лечение [ПО]. По мнению I.M. Orme, A.D.Roberts, J.P. Griffin, J.S.Abrams (1993) снижение числа СБ4-лимфоцитов приводит к утяжелению туберкулезного процесса, так как они равномерно выделяют равнонаправленные против микобактерий туберкулеза цитокины, обеспечивая возможную полноту взаимодействия клеточного и гуморального иммунитета [98].
А.Г.Хоменко, М.М. Авербах, В.И. Литвинов выявили четкую взаимосвязь изменения основных иммунологических показателей и клинико-рентгенологической динамики туберкулезного процесса в легких [41].
Роль СТ)8-лимфоцитов в противотуберкулезной защите обсуждается. Так как Mycobacterium tuberculosis первично живет в вакуолях дольше, чем в цитоплазме клеток, то, казалось, маловероятна роль данной популяции лимфоцитов в формировании противотуберкулезного иммунитета. Однако в исследованиях, которые были проведены Muller et al. (1987), было показано участие С08-лимфоцитов в механизмах элиминации М. tuberculosis из ткани селезенки экспериментальной линии мышей. Считается, что активированные CDS-лимфоциты способствуют лизису макрофагов, в результате чего их содержимое выходит в некротическую зону гранулемы. Создавшиеся здесь условия менее благоприятны для роста микобактерий, что связано с низким давлением кислорода и наличием выделившихся ферментов [82].
Антимикробная активность CDS-лимфоцитов может достигаться несколькими путями. Лимфоциты этой популяции могут быть источниками продукции таких цитокинов, какими являются интерферон-гамма и ФНО-а. CD8 Т-лимфоциты могут оказывать протективный эффект прямым действием, направленным против макрофагов, находящихся в тканях и захвативших М. tuberculosis.
Другой механизм, с помощью которого инфицированные макрофаги поражаются CDS-лимфоцитами, связывают со способностью клеток убивать макрофаги с помощью перфорина. Перфорин является протеином, который синтезируется гранулами СБ8-лимфоцитов. С помощью указанного протеина перфорируется мембрана макрофагов, и через них внутрь клетки проникают такие токсические пептиды, какими являются гранзимы или гранулизин, которые ускоряют процесс апоптоза макрофагов. Исследованиями Stenger S. et al. было показано прямое цитотоксическое действие CDS-лимфоцитов, направленное против М. tuberculosis, находящихся внутриклеточно. Этот механизм прямого поражения микобактерий связывают со способностью человеческих лимфоцитов продуцировать гранулизин [82].
Таким образом, СБ8-лимфоциты имеют несколько механизмов антимикробного действия, среди которых более изученными являются прямые цитотоксические эффекты, участие в продукции провоспалительных цитокинов, синтез целого ряда пептидов с выраженными токсическими свойствами. Эти клетки могут в значительной степени компенсировать функциональную неполноценность CD4-лимфоцитов.
В то же время неконтролируемое разрушение клеток способствует творожистому перерождению гранулемы, что приводит к обширному повреждению тканей. Это в свою очередь может привести к попаданию микобактерий в кровоток и бронхи.
Многочисленными экспериментами показано, что выбор типа хелперов происходит на ранней стадии формирования иммунного ответа и часто является селективным. Последние данные служат основой для предположения о том, что основным моментом, приводящим к активации Txl, является продукция ИЛ-12 АПК. Запуск продукции ИЛ-12 ДК осуществляется через систему TLR. Так, распознавание фрагментов патогенов через TLR2, TLR7 и TLR9 приводит к продукции ИЛ-12, активации Txl и формированию клеточного ответа [81,94]. Ключевой фактор, продуцируемый АПК и определяющий активацию Тх2, пока не выявлен. Одной из гипотез является предположение об отсутствии продукции ИЛ-12 АПК, что помогает выжить и дифференцироваться клеткам, продуцирующим ИЛ-4. Первичным источником ИЛ-4 при запуске дифференцировки Тх2 могут служить не только АПК, но клетки ближайшего микроокружения, такие как эпителиоциты, тучные клетки, эозинофилы. Подобный процесс может запускаться локально, в месте поступления патогена, что приводит к постепенной сенсибилизации организма.
Роль гуморального иммунитета при туберкулезе минимальна. Так, у ряда больных антитела к патогенам не выявляют, но иногда могут наблюдать и высокие титры антител [47]. На экспериментальных моделях показано, что роль антител в патогенезе этой инфекции не является определяющей для исхода заболевания [66,107].
Таким образом, изучая патогенез ВИЧ-инфекции и туберкулеза, мы обнаружили общие моменты: значение имеет не только количество CD4- и СБ8-лимфоцитов, но и их функциональная активность.
3. Современные аспекты ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом 3.1. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом
В последние годы отмечают, что основной причиной смерти больных ВИЧ-инфекцией является туберкулез в 60% случаев [1,16,53,75]. Анализ заболеваемости туберкулезом у больных ВИЧ-инфекцией в России, проведенный в 1997-2007 гг., показал, что неэффективность лечения больных туберкулезом на поздних стадиях ВИЧ-инфекции связана в первую очередь со сложностью его распознавания в этот период и, следовательно, несвоевременным началом лечения [16,31].
С другой стороны, И.Я Семенцов (2000) считает, что отсутствует связь между тяжестью специфического процесса и стадиями ВИЧ-инфекции. Тяжесть туберкулезного процесса, отмечает автор, обусловлена просто поздним обращением больных за медицинской помощью [33].
Сложность ранней диагностики туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией связана с трудностью распознавания туберкулеза из-за сходства клинической симптоматики этих заболеваний [10], а также с тем, что обширность туберкулезного поражения легких при ВИЧ-инфекции обычно менее выражена, чем без нее [2].
На ранних стадиях ВИЧ-инфекции, при нормальном или незначительно сниженном иммунном статусе, клинико-рентгенологическая и морфологическая картина проявлений туберкулеза не отличается от таковой у не инфицированных ВИЧ. Обычно отмечается поражение легких (75-100%) - развиваются верхнедолевые инфильтративные и реже очаговые процессы [6,12]. У больных ВИЧ-инфекцией в стадии вторичных заболеваний (стадия IV) туберкулез протекает атипично на фоне туберкулиновой анергии, прогноз в этих случаях часто бывает неблагоприятным. Значительное уменьшение количества С04-лимфоцитов на поздних стадиях ВИЧ-инфекции способствует гематогенной диссеминации МБТ, некротическим реакциям и распаду без образования гранулем, и формированию очагов воспаления в разных органах и системах [44,11]. В этой стадии болезни туберкулез протекает часто с развитием внелегочных форм одновременно с поражением легких [45,46].
Наслоение ВИЧ-инфекции на туберкулез или одномоментное заражение ВИЧ и М. tuberculosis способствует более легкому течению туберкулезного процесса и незначительному снижению показателей CD4-лимфоцитов. Однако в период острой ВИЧ-инфекции возможен даже летальный исход. Это связано с резким снижением иммунного статуса из-за активной репликации ВИЧ в период сероконверсии и до ее завершения [9]. По мнению Ф.А. Батырова, О.П. Фроловой, Г.Н. Жуковой и др. (2003), именно этот период оказывается очень опасным для больных туберкулезом, заразившихся ВИЧ, так как в это время даже на фоне кратковременного, но значительного иммунодефицита может происходить диссеминация туберкулезного процесса [3].
Присоединение туберкулезного процесса на фоне усугубления иммунодефицита ухудшает течение и прогноз ВИЧ-инфекции [18]. Туберкулез, как правило, развивается в результате реактивации эндогенной инфекции, что связано с прогрессирующим уменьшением количества CD4-лимфоцитов и ослаблением клеточного иммунитета, присущего туберкулезу [21,42].
Вследствие изменений тканевых реакций на микобактерии, изменяется клинико-рентгенологическая картина туберкулеза. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции туберкулез приобретает все черты оппортунистического заболевания, то есть не имеет патогномоничных клинических симптомов, что значительно затрудняет диагностику. Рентгенологические изменения при поражении легких часто атипичны по характеру и локализации, и в большинстве случаев туберкулез протекает как внелегочный и/или генерализованный процесс. Основными клиническими проявлениями туберкулеза в этот период становятся явления интоксикации, длительный кашель, значительное снижение массы тела, диарея. В 65% случаев при осмотре выявляются увеличенные лимфатические узлы, преимущественно шейные и подмышечные, реже паховые, плотной консистенции, бугристые, плохо смещающиеся при пальпации [15,32]. Рентгенологические и бактериологические методы диагностики чаще оказываются в этот период малоинформативными [2,37]. Широко применяемая во фтизиатрической практике туберкулинодиагностика оказалась малоэффективной из-за анергии к туберкулину у больных ВИЧ-инфекцией [38,95]. Сравнительный анализ результатов туберкулиновой пробы с использованием разных доз туберкулина не дал достоверного преимущества этого метода [14].
С трудностью диагностики туберкулеза связано запоздалое лечение. С учетом того, что в настоящее время у большинства вновь выявленных больных ВИЧ-инфекцией диагностируют уже поздние ее стадии, когда число СВ4-лимфоцитов значительно снижено, назначение противотуберкулезной терапии и АРВТ часто были неэффективными.
3.2. Возможные механизмы взаимного влияния инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека и микобактерией туберкулеза
В последние годы в литературе уже появились работы, посвященные изучению различных аспектов двойной инфекции, вызываемой вирусом ВИЧ и микобактериями туберкулеза. Однако патогенез двойной инфекции пока изучен мало.
Большое внимание в настоящее время уделяется особенностям иммунного ответа при ВИЧ/ТБ-инфекции и иммуноопосредованным механизмам взаимного влияния этих заболеваний. Расширение спектра антиретровирусных препаратов и применение средств комбинированной фармакотерапии (HAART, highly active antiretroviral therapy), начиная с 1996 года, привело к существенному увеличению сроков и качества жизни ВИЧ-инфицированных пациентов [5,17,19,49]. На фоне значительного снижения частоты ряда оппортунистических инфекций возросла роль туберкулеза, способного повлиять на долгосрочное течение ВИЧ-инфекции. Кроме того, туберкулез является частой манифестацией иммуносупрессивного состояния, вызванного ВИЧ-инфекцией, наиболее частым сопровождающим ее заболеванием [22,43,87]. Активный туберкулез развивается относительно рано в течении ВИЧ-инфекции и может быть наиболее ранним клиническим проявлением ВИЧ-инфекции. D. Goletti, D. Weissman, R.W. Jackson и др. в 1996 году показали, что среднее количество CD4 во время выявления туберкулеза у ВИЧ-инфицированных составляет в среднем 326/мкл [72]. Смертность ВИЧ-инфицированных пациентов, больных туберкулезом, намного выше, чем ВИЧ-инфицированных пациентов без туберкулеза даже при одинаковом количестве CD4 клеток [67].
Взаимоотношения между M.tuberculosis и ВИЧ на клеточном уровне представляются весьма сложными и недостаточно изученными. Речь идет не только о падении числа - С04-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции, существенно повышающем восприимчивость к заражению туберкулезом и к реактивации дремлющей туберкулезной инфекции.
Как показывают вирусологические исследования, туберкулез ускоряет репликацию ВИЧ, это ускорение стимулируется непосредственно микобактериями туберкулеза и (или) опосредовано цитокинами [29,82,97,111]. Активный туберкулезный процесс, в отличие от латентной инфекции, ведет к клеточной активации и выбросу цитокинов, который, в свою очередь, ускоряет репликацию вируса. Кроме того, больные туберкулезом, инфицированные также и ВИЧ, отличаются более высоким содержанием в сыворотке крови р2-микроглобулина, косвенного маркера активности ВИЧ-инфекции [63].
Патогенное воздействие ВИЧ на защитные механизмы легких изучали J.M. Beck и J. Shellito (1989) и установили влияние ВИЧ непосредственно на функции альвеолярных макрофагов, моноцитов и полинуклеаров, при котором у этих клеток резко снижается способность мигрировать из кровяного русла в легкие. При этом имеет место снижение выработки лимфоцитами опсонизирующих антител, интерлейкина-2, способности лимфоцитов к выработке у-интерферона , что неблагоприятно сказывается на реакциях других эффекторных клеток системы общего иммунитета и снижает местный иммунитет [48]. Инфицирование вирусом ВИЧ также существенно влияет и на патогенез туберкулеза. Выявлено нарушение дифференциации макрофагов и формирование специфической грануляционной ткани. И если на ранних стадиях ВИЧ-инфекции морфология туберкулезного воспаления существенно не изменяется, то в поздний период специфические гранулемы просто не формируются [7,12,28]. Туберкулез также неблагоприятно влияет на прогрессирование ВИЧ-инфекции. In vitro было показано увеличение способности ВИЧ к репликации под действием МБТ-антигенов, что подтверждалось увеличением числа копий РНК вируса в периферической крови [72].
3.3. Изменения иммунологических маркеров при ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом
Лишь единичные исследования были посвящены изучению изменения фенотипа CD4- и CDS-лимфоцитов при сочетанной инфекции.
Так Bernal-Fernndez G, Hermida С et al. (2006) показали, что при сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулеза наблюдается еще большее снижение количества С04-лимфоцитов и изменяется фенотип Т-клеток: отмечается повышенная экспрессия CD95 на СБ4-лимфоцитах и снижение экспрессии CD28 на CDS-лимфоцитах, что может свидетельствовать об усугублении качественных нарушений иммунной системы [52].
Совместное неблагоприятное действие обоих заболеваний подтверждается в исследованиях бельгийских ученых Т Hertoghe, A Wajja, L Ntambi et al. [108]. При сочетанной инфекции ВИЧ и туберкулез выявили уменьшение СБ4-лимфоцитов, повышенную экспрессию HLA-DR, CD38, CD95 и снижение CD28 на СБ8-лимфоцитов, дефектный интерферон-гамма. Изменения были более значительные, чем в группах с моноинфекцией ВИЧ и туберкулез.
Особый интерес представляет оценка изменений состояния иммунной системы у больных с моноинфекцией ВИЧ и сочетанной инфекцией ВИЧ и туберкулез на фоне АРВТ и противотуберкулезной терапии.
В отличие от больных моноинфекцией ВИЧ у больных с сочетанной инфекцией ВИЧ и туберкулез состояние иммунной системы на фоне терапии изучено мало. Имеющиеся публикации в основном связаны с синдромом иммунного восстановления (immune restoration syndrome, IRS), который может возникнуть в начале приема АРВТ [55,68]. В это время увеличивается количество CD4 клеток и существенно снижается уровень РНК ВИЧ в результате успешной антиретровируснои терапии, но данный период опасен клинической манифестацией ряда вторичных заболеваний, в особенности, туберкулеза.
В странах Африканского континента было проведено исследование маркера макрофагальной активности CD 14 у больных сочетанной патологией ВИЧ и туберкулез [83]. Выявлено значительное увеличение уровня CD14 в периферической крови и постепенное снижение экспрессии этого маркера после начала противотуберкулезной терапии у этих больных по сравнению с контрольной здоровой группой. Возможно, использование этого маркера поможет в мониторинге туберкулеза у ВИЧ-инфицированных. Также были исследованы в динамике С-реактивный белок и CD25, уровень которых значительно снижается в течение первых 3-х месяцев от начала противотуберкулезной терапии.
Данные наблюдения свидетельствуют о том, что исследования только уровня CD4 недостаточно для того, чтобы в полной мере оценить состояние иммунной системы у ВИЧ-инфицированных пациентов. Эта проблема становится актуальной, если учесть, что недостаточность противотуберкулёзного иммунитета проявляется рано, до существенного снижения количества С04-лимфоцитов.
Исследование других маркеров фенотипа в настоящее время крайне ограничено. Это объясняется малой изученностью экспрессии поверхностных молекул CD4- и С08-лимфоцитами у ВИЧ-инфицированных пациентов и ее клинического значения. Тем временем, определение экспрессии маркеров фенотипа, по мнению многих исследователей, может дать дополнительную информацию о состоянии пациента, прогнозе течения заболевания и эффективности антиретровирусной терапии.
Таким образом, имеющиеся в литературе еще немногочисленные данные свидетельствуют о взаимном влиянии ВИЧ-инфекции и туберкулеза, ухудшающего прогноз и развитие болезни. Несмотря на постепенное увеличение заболеваемости туберкулезом у больных ВИЧ инфекцией в России, работ по изучению состояния поверхностных маркеров CD4- и CD8-лимфоцитов с целью использования полученных данных для оптимизации мониторинга туберкулеза у ВИЧ-инфицированных не проводилось.
Собственные исследования
Патогенез иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции
Хорошо известно, что ведущим механизмом в патогенезе ВИЧ-инфекции являются нарушения системы иммунитета [20,23,30,36,99]. Установлено, что, проникнув в организм человека, вирус с помощью гликопротеида оболочки gpl20 фиксируется на мембране клеток, имеющих рецептор - CD4+ и корецептор CCR5, либо его аналог CXCR4. Вирус сливается с мембраной клетки, затем происходит дезинтеграция вирусного ядра и выброс РНК ВИЧ в цитоплазму. С помощью фермента ревертазы РНК подвергается транскрибированию в двухнитевую ДНК, которая встраивается в геном клетки с помощью интегразы [4,31].
Рецепторы CD4 находятся на поверхности Т-хелперов (CD4-лимфоциты), играющих центральную роль в иммунном ответе, а также клеток нервной системы (нейроглии), моноцитов, макрофагов, эндотелия сосудов и др. [27].
Образование молекулярного комплекса gpl20 CD4 активирует синтез ФНО-а, который в свою очередь способствует репликации вируса, находящегося в «дремлющем» состоянии [58].
Ведущую роль в патогенезе иммунологических нарушений при ВИЧ-инфекции играет постоянная активация клеток иммунной системы в ответ на персистирование вируса в организме [93].
Недавние исследования показали, что CDS-лимфоциты цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) при ВИЧ-инфекции имеют ряд аномалий. Было обнаружено нарушение пролиферации и созревания CD8-клеток, снижение количества внутриклеточного перфорина и связанную с этим пониженную их лизирующую способность [60,62,74]. Существует целый ряд причин снижения активности ЦТЛ: сокращение выработки ИЛ-2 и ИФН-у как факторов, поддерживающих дифференцировку и активность ЦТЛ; инфицирование CD8 лимфоцитов; нарушение презентации антигена [35]. Еще одна причина снижения активности ЦТЛ - снижение МНС I, вследствие чего вирус-инфицированная клетка избегает лизиса, опосредованного ЦТЛ [4].
Неспецифическая стимуляция иммунной системы напрямую связана с ВИЧ-инфекцией, и тем выше, чем сильнее репликация вируса. О стимулированном иммунитете свидетельствуют соответствующие поверхностные молекулы на Т- и В-лимфоцитах, высокий уровень провоспалительных цитокинов в плазме крови, а также то, что лимфоциты, полученные от ВИЧ-инфицированных, часто находятся в митотическом цикле. Положительная окраска на ядерный антиген Ki-6, увеличение количества ДНК и накопление бромдезоксиуридина свидетельствуют о вступлении Т-лимфоцитов в период S митотического цикла [100,103,105].
Причиной хронической иммунной активации может быть появление в крови большого количества продуктов микробного распада -липополисахаридов (ЛПС). Эти данные подтверждаются снижением уровня ЛПС под влиянием антиретровирусной терапии [57,64]. Так, в первые недели после заражения происходит массовая гибель С04-лимфоцитов, основная часть которых находится в лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта. В результате повышается проницаемость слизистой оболочки тонкого кишечника и продукты распада микроорганизмов попадают в кровяное русло.
Активация также является одним из пусковых факторов апоптоза. Повышенная чувствительность к апоптозу обусловлена увеличением экспрессии CD95 активированными Т-клетками [26]. Кроме того, уменьшение синтеза ИЛ-2 при ВИЧ-инфекции приводит к пониженной экспрессии bcl-2, что также увеличивает чувствительность клеток к апоптозу [85]. Помимо этого, усиление апоптоза происходит за счет повреждения мембраны митохондрий и подавления транскрипции гена NF-kB, отвечающего за подавление апоптоза, вспомогательным вирусным белком Vpr [4]. ВИЧ-инфицированные лимфоциты могут погибать также вследствие цитотоксического действия ФИО, реализуемого посредством апоптоза [39]. При наличии чужеродного, ранее не встречавшегося антигена, происходит активация «наивных» CD4- и СБ8-лимфоцитов. Активация происходит при образовании комплекса TCR с MHC-I для CD8-лимфоцитов и МНС-П для СБ4-лимфоцитов и при наличии в обоих случаях ко-стимулирующего сигнала CD28. «Наивные» клетки начинают активно размножаться и пролиферируют в эффекторные клетки и клетки памяти. Активная репликация вируса происходит, главным образом, в «наивных» (CD45RA+) и клетках памяти (CD45RO+), поскольку эти клетки способны к делению. Эффекторные клетки, которые тоже имеют фенотип CD45RO+, утрачивают способность к делению и погибают после выполнения своей функции [4]. В результате у ВИЧ-инфицированных пациентов наблюдается изменение соотношения «наивных» CD4- лимфоцитов (CD45RA+CD62L+) и клеток с фенотипом CD4+CD45RO+ - относительное содержание «наивных» клеток уменьшается, клеток памяти - увеличивается. При этом «репертуар» (разнообразие) Т-клеточного рецептора (TCR), в норме обеспечивающего ответ на большое количество разных антигенов, становится ограниченным [96].
Есть и другая точка зрения на причину изменения соотношения «наивных» лимфоцитов (CD45RA+CD62L+) и клеток с фенотипом CD45RO+[4,76]: ВИЧ снижает представление TCR CD4- и CD8-лимфоцитами, а также уменьшается количество вирусных антигенов, представленных MHC-I и МНС II при помощи вспомогательных вирусных белков, что препятствует естественной активации Т-лимфоцитов. В этом случае не происходит образования эффекторных клеток и клеток памяти через пролиферацию «наивных» клеток. А поскольку ВИЧ также способен заражать неделящиеся клетки в отличие от остальных ретровирусов, размножение его в неделящихся или медленнее делящихся «наивных» клетках продолжается и приводит к их катастрофическому снижению.
ВИЧ-инфекция характеризуется прогрессирующим снижением количества С04-лимфоцитов, для объяснения чего предложено несколько механизмов.
Во-первых, С04-лимфоциты являются основной мишенью для ВИЧ. Вирус оказывает прямое цитотоксическое действие на инфицированные им клетки [70]. Гибель лимфоцитов может происходить в результате образования синцитиев - гигантских многоядерных клеток, формирующихся при слиянии инфицированных и неинфицированных С04-лимфоцитов. Показано, что при выявлении в крови у пациента штаммов вируса, вызывающих образование синцития, ВИЧ-инфекция прогрессирует быстрее [4,36,73].
Помимо прямого цитотоксического действия, ВИЧ запускает клеточный и гуморальный иммунный ответ, который приводит к гибели как инфицированных, так и неинфицированных СБ4-лимфоцитов, несущих на своей поверхности вирус или его антигены. Противовирусную защиту обеспечивают цитотоксические лимфоциты, естественные киллеры и антитела [27,36,50].
Современные аспекты ВИЧ-инфекции в сочетании с туберкулезом
Исследование завершили все больные - 81 (ВИЧ/ТБ-39, ВИЧ-25, ТБ-17). За время наблюдения и лечения ни у одного из больных клинических признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции выявлено не было.
Клинические проявления ВИЧ-инфекции у 84% больных группы ВИЧ отсутствовали до начала терапии.
Как представлено в главе 2, в группе больных ВИЧ преимущественно диагностировали 3 стадию ВИЧ-инфекции (84%), то есть клинические проявления инфекции выявлены не были. При физикальном осмотре у этих больных, как правило, удавалось обнаружить лишь увеличение периферических лимфатических узлов; чаще всего - подчелюстных, переднешейных, заднешейных, затылочных, надключичных и подмышечных.
У 4 пациентов (16%) в анамнезе были клинические проявления вторичных заболеваний: у 2 пациентов в анамнезе был рецидивирующий опоясывающий лишай, у 1 больного - кандидоз слизистой оболочки полости рта; у одного пациента в анамнезе была диагностирована манифестная ЦМВ-инфекция.
У всех пациентов, имевших в анамнезе клинические проявления вторичных заболеваний, на фоне применения антиретровирусной терапии возникновения их рецидивов не отмечали.
Вначале АРВТ у 9 (36%) пациентов были нежелательные явления, чаще всего - диспепсические расстройства, проявлявшиеся тошнотой, жидким стулом. Данные симптомы, как правило, имели легкое течение, транзиторный характер и самостоятельно купировались через 10-14 дней лечения. Клиническая симптоматика у больных ВИЧ/ТБ и ТБ отличалась до начала терапии. Частота встречаемости различных жалоб в сравниваемых группах представлена в таблице 5. У больных ВИЧ/ТБ в интоксикационном синдроме преобладала слабость (72%), из дыхательной симптоматики -одышка и сухой кашель (по 49%), процент выделения МБТ из мокроты в этой группе был ниже (33%), чем у больных ТБ (53%).
При осмотре у больных группы ВИЧ/ТБ выявлялись увеличенные периферические лимфатические узлы. У 4-х больных аускультативно выслушивался шум трения плевры, у 8-й больных на фоне жесткого дыхания выслушивались мелкопузырчатые хрипы, в то время как у остальных было отмечено только жесткое дыхание. Со стороны сердечнососудистой системы отклонений не было, кроме тахикардии у больных на фоне интоксикации. У ряда больных отмечено приглушение сердечных тонов. При рентгенологическом исследовании у 51% больных диагностирован туберкулез внутригрудных лимфатических узлов, у 15%-диссеминированный туберкулез, у 18%-инфильтративный и у 7% больных очаговый туберкулез легких. У 4 -х пациентов был диагностирован плеврит туберкулезной этиологии, причем у 2-х из них это было единственным проявлением туберкулезной инфекции.
В группе больных ВИЧ/ТБ в анамнезе были диагностированы вторичные заболевания: у 7 пациентов (18%) -манифестная ЦМВ-инфекция, у 2 (5%) пациентов - пневмоцистная пневмония и у 5 (13%) -церебральный токсоплазмоз.
На фоне проводимой терапии состояние больных из группы ВИЧ/ТБ и ТБ улучшилось: клинические проявления регрессировали, отмечалась положительная динамика в рентгенологической и бактериологической картине. В группе больных ТБ не было отмечено нежелательных явлений от терапии. У больных группы ВИЧ/ТБ еще до начала комплексной противотуберкулезной и антиретровирусной терапии были диспепсические явления, поэтому невозможно точно их отнести к нежелательным явлениям, возникшим на фоне терапии.
У пациентов, имеющих маркеры гепатитов С и В (ВИЧ/ТБ, ВИЧ, ТБ), клинических и лабораторных признаков ухудшения течения хронического заболевания печени не было.
В результате назначения АРВТ в группах больных ВИЧ/ТБ и ВИЧ было отмечено снижение РНК ВИЧ, которое сопровождалось ростом относительного и абсолютного содержания CD4 лимфоцитов (таб.6). У больных из группы ВИЧ наблюдали более быстрое снижение РНК ВИЧ, чем в группе больных ВИЧ/ТБ.
Через 12 недель в результате АРВТ отмечено снижение вирусной нагрузки до уровня 400 копий/мл у 23 из 25 больных (92%) в группе больных ВИЧ и у 28 из 39 больных (71%) у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом.
Среди больных с начальной вирусной нагрузкой 400 копий/мл через 12 недель АРВТ отмечено снижение РНК ВИЧ ниже порога определения тест-системой ( 40 копий/мл) у 11 из 25 больных (44%) в группе ВИЧ и у 9 из 39 больных (23%) в группе больных ВИЧ/ТБ.
Динамика клинической симптоматики на фоне проводимой терапии у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом
Сравнительная характеристика групп по количеству CD4-, CD8- и CD3-лимфоцитов (клеток/мл) представлена в таблице 7. Группа больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом по показателям CD4-, CD8- и CD3-лимфоцитов существенно не отличалась от группы больных с моноинфекцией ВИЧ. Помимо этого в группах ВИЧ/ТБ и ВИЧ абсолютные и относительные значения С04-лимфоцитов были достоверно ниже, чем в контрольной группе и группе больных с моноинфекцией туберкулез (р 0,001). В то же время у больных группы ВИЧ/ТБ регистрируемые абсолютные значения СБ4-лимфоцитов были ниже чем группе с ВИЧ, несмотря на то, что в группе ВИЧ/ТБ разброс значений по данному показателю больше. В группе больных туберкулезом были зарегистрированы самые высокие абсолютные и относительные значения С04-лимфоцитов.
При анализе распределения больных по уровню абсолютных значений С04-лимфоцитов в этих двух группах (рис. 10), выявлено, что в группе больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом доля больных с содержанием СВ4-лимфоцитов 100 клеток/мл больше и составляет 28% (11 пациентов), тогда как в группе с моноинфекцией ВИЧ таких больных было 24%. Также у 10 пациентов (25%) из группы ВИЧ/ТБ содержание CD4-лимфоцитов было 350 клеток/мл, тогда как в группе с моноинфекцией ВИЧ таких больных было 8%.
Распределение больных по уровню относительных значений CD4-лимфоцитов в группах ВИЧ/ТБ и ВИЧ показано на рисунке 11. В группе ВИЧ/ТБ содержание С04-лимфоцитов 10% зарегистрировано у 38,5% (15 пациентов), при этом у 6 пациентов (15,3%) относительный показатель CD4-лимфоцитов более 23%. В группе с моноинфекцией ВИЧ не было больных с относительным показателем СБ4-лимфоцитов 23%. Такое распределение по абсолютным и относительным показателям CD4-лимфоцитов в группе ВИЧ/ТБ невозможно объяснить только более высоким количеством лейкоцитов у этих больных (таб.8), так как при этом не менялось общее количество лимфоцитов. Следовательно, мы регистрировали у больных ВИЧ/ТБ истинное количество С04-лимфоцитов, что еще раз подтверждает возможность развития туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией не только при низких его значениях.
По относительным и абсолютным показателям С08-лимфоцитов группы больных ВИЧ и ВИЧ/ТБ не отличались и были существенно выше, чем в контрольной группе (р 0,001 в обоих случаях). В группе больных ТБ данные показатели были, хотя и несколько ниже значений больных ВИЧ-инфекцией, однако - достоверно выше значений контроля (р 0,05) (таб.7).
Процент СОЗ-лимфоцитов в группах ВИЧ/ТБ, ВИЧ и ТБ был выше, чем в контрольной группе (р 0,001, р 0,01 и р 0,01, соответственно) (таб.7). В то время как самые высокие абсолютные значения СОЗ-лимфоцитов регистрировали у больных ТБ, а самые низкие - у больных групп ВИЧ/ТБ и ВИЧ.
Сравнительная характеристика иммунологических показателей по группам на фоне проводимой терапии представлена в таблицах 9 и 10.
На фоне противотуберкулезной терапии в группе больных ТБ отмечено увеличение относительного и абсолютного количества С04-лимфоцитов выше значений контроля (рис.12, 13). В группах больных ВИЧ/ТБ и ВИЧ на фоне терапии наблюдали достоверное увеличение относительного и абсолютного количества С04-лимфоцитов по сравнению с исходными значениями (р 0,05 в обоих случаях), которое, однако не достигало значений нормы.
Достоверной разницы между группами ВИЧ/ТБ и ВИЧ по относительным и абсолютным количествам С04-лимфоцитов установлено не было диагностировано. Однако, медиана ежедневного прироста относительного содержания С04-лимфоцитов в группе ВИЧ/ТБ была в течение первых 4-х недель 0,107 % в день и в последующие 8 недель - 0,071 % в день. В группе больных ВИЧ медиана ежедневного прироста относительного содержания CD4-лимфоцитов составила 0,143% в день в течение первых 4-х недель и 0% в день в последующие 8 недель.
Наоборот, медиана ежедневного прироста абсолютного количества CD4-лимфоцитов была выше у больных группы ВИЧ/ТБ чем в группе ВИЧ.
В группе ВИЧ/ТБ наиболее быстрый прирост отмечали в период с 4 по 12-ю неделю. Медиана ежедневного прироста в этот период составила 2,57 клетки в день. В течение первых 4-х недель медиана ежедневного прироста была 1,96 клетки в день. У больных моноинфекцией ВИЧ медиана ежедневного прироста была меньше, чем группе ВИЧ/ТБ и составила в течение первых 4-х недель 1,8 клетки в день, в последующие 8 недель - 0,375 клетки в день.
Ежедневный прирост абсолютного количества СБ4-лимфоцитов в группе ВИЧ/ТБ на фоне комплексной противотуберкулезной и антиретровирусной терапии больше, чем в группе с моноинфекцией ВИЧ на фоне проводимой антиретровирусной терапии, можно объяснить увеличением абсолютного количества лимфоцитов в результате проведенного лечения (таб.11, 12).
Сравнительная характеристика фенотипа CD4- и CD8- лимфоцитов в исследуемых группах
В соответствии с задачами исследования был изучен фенотип CD4- и CDS-лимфоцитов у больных до назначения терапии. Результаты представлены в таблице 13. До начала терапии у больных группы ВИЧ и ВИЧ/ТБ наблюдались значительные изменения фенотипа CD4- и CDS-лимфоцитов. Так, за счет снижения числа С04-лимфоцитов отмечалось уменьшение процентного содержания CD4+CD45RA+CD62L+ клеток («наивных») и CD4+CD45RO+ (памяти) в общей популяции лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами (р 0,0001 и р 0,0001, соответственно). Наиболее низкие показатели выявлены у больных ВИЧ-инфекцией в сочетании с туберкулезом, что возможно связано с совместным неблагоприятным действием обоих заболеваний на иммунную систему (таб.13). Также было отмечено значительное повышение процентного содержания «клеток памяти» ЦТЛ в общей популяции лимфоцитов выше нормы в группах ВИЧ и ВИЧ/ТБ (р 0,0001 и р 0,0001, соответственно). Процент «наивных» ЦТЛ в общей популяции лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией не отличался от показателей контрольной группы. В то же время разница между группой ВИЧ и ВИЧ/ТБ была не достоверна (р 0,05).
В группе больных ТБ процент «наивных» и «клеток памяти» CD4- и CDS-лимфоцитов среди общей популяции лимфоцитов был близок к контрольной группе (р 0,05).
При изучении доли «наивных» и «клеток памяти» среди CD4- и CDS-лимфоцитов обнаружили, что показатели группы больных ТБ также были близки к контрольной группе (р 0,05) (таб.13). У больных же ВИЧ-инфекцией в группах ВИЧ и ВИЧ/ТБ доля «наивных» клеток среди CD4-лимфоцитов была ниже показателей контрольной группы (р 0,05 для ВИЧ/ТБ), в то время как доля «клеток памяти» - выше (р 0,01 для ВИЧ/ТБ). Точно такая же динамика прослеживалась в группах ВИЧ и ВИЧ/ТБ в отношении доли «наивных» и «клеток памяти» среди CDS-лимфоцитов: отмечали снижение доли «наивных» клеток и увеличение доли «клеток памяти» относительно контроля (р 0,0001 и р 0,0001, соответственно).
При анализе коэффициентов соотношения доли «наивных» и «клеток памяти» CD4- и CDS-лимфоцитов были обнаружены изменения. В группе больных с сочетанной патологией ВИЧ/ТБ соотношение доли «наивных» и «клеток памяти» СБ4-лимфоцитов было меньше 1, в то время как в группе больных ВИЧ оно оставалось 1, но меньше, чем в контрольной группе. Помимо этого у больных групп ВИЧ и ВИЧ/ТБ наблюдалось достоверное изменение соотношения «наивных» клеток и клеток памяти среди CDS-лимфоцитов: отмечалось увеличение доли клеток с фенотипом памяти (CD8+Ro+) и уменьшение доли «наивных» клеток (р 0,0001 и р 0,0001, соответственно).
При анализе экспрессии С04-лимфоцитами маркеров CD57 и CD28 отличий в исследуемых группах не обнаружено (р 0,05). Другая картина выявлена при исследовании экспрессии этих маркеров CDS-лимфоцитами. Доля CD8+CD28+ среди CDS-лимфоцитов в группах больных ВИЧ инфекцией была достоверно ниже значений контрольной группы (р 0,05), в то время как доля CD8+CD57+ среди CDS-лимфоцитов - достоверно выше (р 0,001). Значения исследуемых маркеров в группе больных ТБ не существенно отличались от показателей здоровых доноров (таб.13).
Изучение экспрессии CD38 CDS-лимфоцитами было проведено по трем показателям: количество CD38 на С08-лимфоците, доля CD8CD38 среди С08-лимфоцитов, %CD8brightCD38+ (таб.13). У больных ВИЧ-инфекцией все три показателя были выше, чем в группе контроля (р 0,001). Причем у больных сочетанной патологией значения доли CD8CD38 среди CDS-лимфоцитов и количество CD38 на С08-лимфоците были выше, чем в группе с моноинфекцией ВИЧ. В обеих группах регистрировали одинаковые значения %CD8bnghtCD38+ . У больных же группы ТБ значения были близки к показателям контрольной группы (р 0,05).
Была изучена динамика «наивных» и «клеток памяти» CD4- и CD8-лимфоцитов у больных, получающих этиотропную терапию. Исследование проводилось на 4-ой и 12-ой неделях. Полученные результаты представлены в таблицах 14 и 15. На фоне эффективной АРВТ и ПТТ было выявлено увеличение процента «наивных» и «клеток памяти» CD4-лимфоцитов среди общей популяции лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией (р 0,001). В группе больных ВИЧ наиболее существенная динамика была зарегистрирована относительно % «наивных» CD4-лимфоцитов среди общей популяции лимфоцитов: через 12 недель терапии было выявлено увеличение данного показателя в 1,4 раза. В группе больных ВИЧ/ТБ существенная динамика была зарегистрирована относительно «клеток памяти» С04-лимфоцитов среди общей популяции лимфоцитов, увеличение данного показателя было в 1,7 раза выше через 12 недель терапии.
![Туберкулез органов дыхания в сочетании с ВИЧ-инфекцией [Электронный ресурс]](/i/i/4470/182835.png "Туберкулез органов дыхания в сочетании с ВИЧ-инфекцией [Электронный ресурс] Кузьмин Олег Александрович")
![Клинико-биохимическая характеристика больных туберкулезом легких с сопутствующими хроническими гепатитами B и/или C [Электронный ресурс]](/i/i/4605/189084.png "Клинико-биохимическая характеристика больных туберкулезом легких с сопутствующими хроническими гепатитами B и/или C [Электронный ресурс] Харламова Юлия Михайловна")