Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные направления патогенетического лечения туберкулезных хориоретинитов и их осложненеий (обзор литературы) 12
1.1 Основные направления терапии, патогенез туберкулезного хориоретинита 12
1.2 Патогенетическое лечение туберкулезных хориоретинитов в активной стадии 16
1.3. Патогенетическое лечение туберкулезных хориоретинитов в неактивной стадии 19
1.3.1 Медикаментозные методы лечения 20
1.3.2 Физиотерапевтические и лазерные методы лечения 26
1.3.3 Хирургические методы лечения 28
1.3.4 Клеточные и генные технологии 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 32
2.1 Метод органотипического культивирования ткани сетчатки 32
2.2 Цитологические методы исследования 35
2.3 Методика определения вирулентности микобактерий туберкулеза 37
2.4 Методика определения антимикробного действия препарата «Аноцептин» на М. Tuberculosis 37
2.5 Методика моделирования туберкулезного очагового хориоретинита 38
2.6 Гистологические методы исследования 45
2.7 Методы статистической обработки 46
ГЛАВА 3. Действие препарата «аноцептин» на клетки ткани сетчатки в органотипической культуре 47
3.1 Влияние «Аноцептина» на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре 47
3.2 Исследование возможного механизма действия препарата «Аноцептин» 56
ГЛАВА 4. Эффективность препарата «аноцептин» при лечении экспериментальных туберкулезных хориоретинитов 59
4.1 Действие препарата «Аноцептин» на М. tuberculosis in vitro 59
4.2 Результаты эффективности лечения экспериментальных туберкулезных хориоретинитов по офтальмоскопическим признакам 59
4.3 Результаты гистологических исследований тканей глазного дна экспериментальных животных с туберкулезными хориоретинитами. 67
Заключение 73
Выводы 82
Список литературы 83
- Основные направления терапии, патогенез туберкулезного хориоретинита
- Хирургические методы лечения
- Метод органотипического культивирования ткани сетчатки
- Влияние «Аноцептина» на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре
Введение к работе
Несмотря на рост основных показателей заболеваемости по туберкулезу, показатель заболеваемости для внелегочных форм туберкулеза снижается 2,0/100 тыс. населения в 2005 году против 3,2/100 тыс. населения в 2000 году (Левашев Ю.Н. и соавт., 2005). Туберкулезные поражения глаз при этом прочно занимают 2-3 место среди внелегочного туберкулеза (Устинова Е.И., 2002; Попова С.Г., 2005; Левашев Ю.Н. и соавт, 2006). Доля увеитов туберкулезной этиологии среди общего числа больных с увеальной патологией по-прежнему высока и составляет в среднем около 20% (Шульпина Н.Б., Гонтуар Н.С., 1985; Кацнельсон Л.А., Танковский В.Э., 1998; Хокканен В.М., 1999; Устинова Е.И., 2001, Бурылова Е.А., Черноскутова Э.А., 2006). По данным отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПб НИИФ Росмедтехнологий» удельный вес увеитов туберкулезной этиологии среди поступивших больных с воспалительными заболеваниями органа зрения в период с 2002 по 2007 год составляет около 34% .
Основной формой в структуре туберкулезных поражений глаз в современных эпидемиологических условиях являются очаговые хориоретиниты, которые отличаются наибольшей частотой развития осложнений (Тарасова Л.Н. и соавт., 2001; Устинова Е.И., 2002, Ионова О.Г., 2006; Bouza Е. et al., 1997). В активной стадии заболевания для подавления острого воспалительного процесса применяются антибактериальные средства и кортикостероиды (Хоменко А.Г., 1996; Хокканен В.М., 1998, 1999). При лечении туберкулезного хориоретинита в неактивной стадии используют патогенетические средства, направленные на устранение осложнений (Александров Е.И. и соавт., 1995; Тарасова Л.Н., Панова И.Е., 2001; Полунин Г.С., 2002; Устинова Е.И., 2001, Хокканен В.М. и соавт., 1998, 1999, 2002; Bakkali М., 2001; Ishihara М. 1998; Waheeb S.2001). Однако даже при своевременно начатом лечении, площадь поражения на глазном дне остается значительной. Причиной этого, как правило, является перифокальное воспаление, при котором главным образом страдает пигментный эпителий и как следствие развивается вторичная дистрофия сетчатки.
В последние годы туберкулезные хориоретиниты характеризуются выраженной экссудацией с преобладанием параспецифического компонента воспаления (Азнабаев М.Т. 2003; Хокканен В.М., 2006). По данным литературы (Измайлов А.С., 2001; Ионова О.Г., 2006 и другие авторы), при этом заболевании, особенно при центральной и парацентральной локализации очага, наблюдаются наиболее грозные осложнения - отслойка пигментного и нейроэпителия, вторичная дистрофия сетчатки, фиброз стекловидного тела, геморрагии, которые приводят к стойкому снижению зрения, вплоть до слепоты.
Необходимость предотвращения возникновения и лечения осложнений требует совершенствования патогенетических методов лечения (Беллендир Э.Н. 1986, 2000; Иванова Л.А. и соавт., 1998, Ионова О.Г., 2006).
В этой связи остается актуальным поиск новых средств и методов коррекции различных звеньев патологического процесса, позволяющих максимально сохранить клетки сетчатки.
В рамках программ Отделения биологических наук РАН «Фундаментальная наука - медицине» и «Поддержка инноваций и разработок» в Институте физиологии им. И. П. Павлова РАН разработана лекарственная форма препарата «Аноцептин» в виде раствора для инъекций. Действующей субстанцией препарата является производная гамма-пирона - коменовая кислота, получаемая путем прямого химического синтеза. Препарат «Аноцептин» является оригинальным, относится к V классу малотоксичных соединений, не влияет на эмбриогенез, не индуцирует тератогенез и мутагенез, а также не провоцирует рост новообразований. Лекарственная форма стабильна. В настоящее время препарат проходит 1 фазу клинических исследований по безопасности и фармакокинетике как анальгетическое противовоспалительное средство (разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 158 от 03 05.2007 г.).
Анальгетические свойства препарата реализуются за счет непосредственного влияния на систему кодирования ноцицептивнои информации, трансдуктором сигнала в которой является Na/K-АТФаза мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев (Крылов Б.В. и соавт., 1999).
Доклинические исследования показали, что препарат «Аноцептин» стимулирует системный иммунитет за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов. Поскольку Na/K-АТФаза проявляет функцию трансдуктора сигнала при регуляции процессов роста и пролиферации, клеток разных тканей (Пеннияйнен В. А. и соавт., 2003; Лопатина Е.В. и соавт., 2005; Xie Z., Askari А., 2002; Schonner W., 2002, 2005), было высказано предположение о том, что препарат «Аноцептин» может оказаться эффективным при лечении туберкулезных хориоретинитов, объединяющих в себе ряд воспалительных и деструктивных изменений в оболочках глазного яблока.
Цель исследования. Изучить влияние препарата «Аноцептин» на ткань сетчатки, в органотипической культуре и оценить перспективы его использования в патогенетической терапии туберкулезных хориоретинитов.
Задачи исследования.
1. Изучить влияние препарата «Аноцептин» на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре и оценить возможный механизм действия препарата.
2. Определить клеточный состав эксплантатов ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов, в условиях органотипического культивирования при использовании препарата.
3. Исследовать влияние препарата «Аноцептин» на рост штаммов М. tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98.
4. Оценить эффективность препарата «Аноцептин» как патогенетического средства при лечении экспериментального туберкулезного хориоретинита у кроликов.
Научная новизна.
Исследования, проведенные на эксплантатах ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов, впервые позволили обнаружить влияние препарата «Аноцептин» на процессы пролиферации нейро- и пигментного эпителия. Экспериментально показано, что в основе механизма действия препарата лежит его способность регулировать трансдукторную функцию Na/K-АТФазы клеток сетчатки. Установлена четкая зависимость роста эксплантатов ткани сетчатки от дозы препарата. Доказано, что препарат «Аноцептин» не оказывает ингибирующего влияния на штаммы M.tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98 in vitro. Препарат «Аноцептин» впервые использован в лечении экспериментального туберкулезного хориоретинита и доказана его эффективность как патогенетического средства.
Практическая значимость работы. Полученные данные об эффективности препарата «Аноцептин» на фоне химиотерапии туберкулезных хориоретинитов могут быть использованы при его изучении в условиях другой экспериментальной патологии глаз, а также при проведении второй и третьей фазы клинических испытании, как во фтизиатрии, так и в офтальмологии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Препарат «Аноцептин» регулирует процесс пролиферации клеток ткани сетчатки 10-12 дневного куриного эмбриона в органотипической культуре.
2. Механизм регуляторного действия препарата основан на непосредственном влиянии на трансдукторную функцию Na/K-АТФазы клеток ткани сетчатки.
3. Эффективность препарата «Аноцептин» при включении его в противотуберкулезную терапию не связана с непосредственным влиянием на М. tuberculosis .
4. Препарат «Аноцептин» способствует максимальному сохранению клеток пигментного эпителия сетчатки, что предотвращает ее дистрофические изменения.
Реализация результатов работы
На основании проведенных исследований подана патентная заявка «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства» N 2007135967/15(039320).
Основные положения диссертации используются в экспериментальных исследованиях отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПбНИИФ Росмедтехнологий», научно-исследовательской работе Института физиологии им И.П.Павлова РАН, отдела экспериментальной и клинической фармакологии ФГУ «ФЦСКИЭ им. В. А. Алмазова Росмедтехнологий».
Апробация материалов работы
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции Фонда А. фон Гумбольдта (Санкт-Петербург, 2004), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург 2004), на конференции «Клеточные технологии в офтальмологии и медицине» (Москва 2005 год); на V международном конгрессе по нейроморфологии, (Санкт-Петербург, 2006). По результатам диссертационного исследования опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 103 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 179 источников, в том числе 121 отечественный и 58 иностранных. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 16 рисунками.
Основные направления терапии, патогенез туберкулезного хориоретинита
Методы повышения эффективности лечения хориоретинитов и их осложнений достаточно широко описаны в отечественной и зарубежной литературе (Пеньков М.А. и соавт., 1979; Полунин Г.С. и соавт., 2000; Южаков A.M. и соавт., 2000; Полунин Г.С, Воробьева O.K., 2002; Waheeb S. et al., 2001). Несомненным фактом остается то, что эффективность различных методов зависит от своевременно начатого лечения (Александров Е.И. и соавт., 1995; Выренкова Т.Е., 1996; Helm С.J., Holland G.N., 1993; Waheeb S. et al., 2001). Для подавления воспалительного процесса используют антибактериальные средства и кортикостероиды (Александров Е.И. и др., 1995; Панова И.Е., 2000, 2001; Устинова Е.И., 2002; MachemerR., Steinhorst U.H., 1993; BresslerN.M. etal., 2001).
Поиск новых патогенетических методов лечения обоснован, поскольку позволит сократить длительность проводимой противотуберкулезной химиотерапии и уменьшить риск возникновения осложнений (Выренкова Т.Е.,1995, 1996; Вишневский Б.И., Оттен Т.Ф., 1998; Беллендир Э.Н., 2000, Ионова О.Г., Хокканен В.М., 2005,).
Основными направлениями патогенетической терапии при туберкулезе глаз, являются: восстановление микроциркуляторного русла, регуляция обмена тканевых жидкостей в структурах глазного яблока; ускорение резорбции казеозно-некротических масс; уменьшение фибропластических процессов (Беллендир Э.Н. и соавт., 1977; Хокканен В.М., 1999). Туберкулезные хориоретиниты, наиболее часто встречаемая клиническая форма туберкулеза глаз, составляет от 60 до 90% (Выренкова Т.Е., 1996; Тарасова Л.Н, Панова И.Е., 2001; Алиева З.А., Шульпина Н.Б., 2001). При центральной локализации туберкулезной гранулемы площадь поражения имеет огромное значение, так как всегда сопровождается снижением зрительных функций. Преимущественная локализация микобактерий туберкулеза в сосудистой оболочке глаза объясняется особенностями ее строения (Самойлов А.Я., 1963). Замедленный ток крови, действие офтальмотонуса способствует фиксации в сосудах микобактерий туберкулеза. Хориоидальный очаг формируется в слое сосудов среднего калибра, разрушает и вовлекает в воспалительный процесс хориокапиллярный слой, мембрану Бруха и пигментный эпителий сетчатки, которые являются основными структурами гематоофтальмического барьера. Рост гранулемы происходит, как правило, в сторону стекловидного тела, в связи, с чем слои сетчатки приподняты над очагом. Выстояние (проминенция) очага в стекловидное тело вызывает нарушение гематоофтальмического барьера в окружающей зоне, что приводит к гипоксии сетчатки и стимулирует выработку пролиферативного фактора ангиогенеза. Развивается субретинальная неоваскулярная мембрана, которая может спровоцировать ретинальные кровоизлияния. Перифокальное воспаление, обусловленное параспецифическими реакциями, в большинстве случаев занимает большую площадь, чем непосредственно очаг туберкулезного воспаления (Хокканен В.М., 1999, 2006). В результате хориоидальной экссудации формируется отслойка пигментного эпителия, клетки которого играют не последнюю роль в подавлении и отграничении воспаления (Катаргина Л.А., Архипова Л.Т., 2004). Помимо этого, пигментный эпителий осуществляет барьерную и транспортную функции, абсорбцию световой энергии, метаболизм витамина А, а также защищает сетчатку от «окислительного стресса» (Миронова Э.М., 1990). Нарушение барьерной функции пигментного эпителия ведет к возникновению отслойки нейроэпителия сетчатки (Измайлов А.С., 2001, Кацнельсон Л. А., Танковский В.Э., 1998). Длительно существующая отслойка пигментного эпителия вызывает образование фиброваскулярного рубца, что значительно утяжеляет течение заболевания и ведет к существенному снижению остроты зрения (Измайлов А.С., 2001). Противотуберкулезные препараты сами1 по себе оказывают неблагоприятное влияние на биоэнергетический обмен. Немаловажную роль в развитии осложнений играет корд-фактор микобактерий туберкулеза, который ингибирует дыхание в митохондриях и разобщает окислительное фосфорилирование. Доказано отрицательное действие этамбутола на волокна зрительного нерва (Шмелев Н.А., Степанян Э.С., 1977; Устинова Е.И: и соавт., 1997; Попова СТ., 2005, Citron К., Thomas G., 1986). Именно по этой причине этот противотуберкулезный препарат не используется у больных с туберкулезным поражением глаз, а больные туберкулезом других локализаций получают его под контролем офтальмолога. Анатомо-морфологические изменения на глазном дне приводят к изменению функциональной активности сетчатки. Снижается интенсивность обмена веществ между сосудами хориоидеи и сетчатки, что приводит к гипоксии сетчатки, в связи, с чем быстрее развиваются дистрофические процессы (Шамшинова A.M., Волков В.В., 1999; Justino L. et all, 2001). При нарушении микроциркуляции страдает свертывающая система крови. Развивается гиперкоагуляция и усиливается фибринолиз. В результате рыхлые сгустки крови, агрегаты фибрина и тромбоцитов закупоривают мелкие сосуды, что усугубляет гипоксию и ацидоз в тканях (Александрова А.Е., Антоненкова Е.В., 1998; Приймак А.А., Макинский А.И., Иванько Т.П., 1995; Рябов Г.А., 1998). Формирующиеся осложнения приводят к тяжелейшему течению туберкулезного хориоретинита, нередко с невосполнимой потерей зрительных функций. Именно поэтому патогенетическое лечение туберкулезных хориоретинитов должно быть направлено, прежде всего, на сохранение и восстановление клеток сетчатки, в частности пигментного эпителия.
Хориоретиниты туберкулезной этиологии, проходят несколько фаз развития: активная фаза (включает стадию максимальной активности и стадию затихания), неактивная фаза, ранний и поздний рецидивы (Хокканен В.М., Белова О.Ю., 2000; Хокканен В.М., 1998, 1999, 2006; Устинова Е.И. 2002).
В активной фазе развития очаги имеют светло-желтый мутноватый цвет и нечеткие границы. Иногда офтальмоскопически группа таких очагов может казаться единым конгломератом, но после уменьшения активности специфического процесса и перифокального воспаления сетчатки выявляется их изолированный характер. В процессе обратного развития происходит частичное рассасывание перифокального воспаления и рубцевание гранулемы, что при офтальмоскопии проявляется уплощением очага, четкостью его границ, пигментацией. Специфическая инфильтрация в той или иной степени разрушает слои хориоидеи, поэтому в очаге в виде белых участков начинает просвечивать склера. Погибшие тканевые элементы сетчатки замещаются глией, вследствие чего очаг приобретает сероватый оттенок. В связи с этим, патогенетическая терапия должна быть направлена на уменьшение воспалительной реакции, профилактику и лечение осложнений.
Хирургические методы лечения
Разработан ряд реваскуляризующих операций, при которых к заднему полюсу глаза подводятся различные трансплантаты (Корепанов А.В., 2000, Соломина Е.В.,2000; Binder S.,2002, Del Priore L.V.,1996). Однако эти операции достаточно травматичны и чреваты такими осложнениями, как гемофтальм и отслойка сетчатки. Для лечения макулодистрофий в настоящее время активно развиваются эндо- и трансвитреальные методы макулярной хирургии — эвакуация содержимого субретинальных полостей, методики хирургического удаления субфовеолярных мембран различной этиологии (Столяренко Г.Е.,1989, 1990; Blinder K.J., et al, 1991; Melberg N.S.,1996; Benson M.T., et al, 1998; De Juan E., Alexander J., 1998; Lund R.D., et al., 2003). Выполняются операции по транслокации сетчатки, которые позволяют сместить сетчатку макулы, перевести субфовеолярную неоваскулярную мембрану в экстрафовеолярную и выполнить ее лазерную коагуляцию (Gouras Р., Algvere P.V., 1996; Simon P., et al., 2002; Fujii G.Y., et al., 2002; Haller JA., 2003;Chang A.A.,2003, Van Meurs J.C., et al., 2004). Тяжелыми осложнениями таких операций, в ряде случаев, могут быть разрывы сетчатки, отслойка сетчатки, пролиферативная витреоретинопатия и эндофтальмит. Многие авторы отмечают частые рецидивы неоваскуляризации в первые месяцы после операции, что требует повторного лазерного или оперативного лечения (Glacet-Bernard et al., 2001; Simon P. et al., 2002; Fujii G.Y., et al., 2003).
Хирургическое лечение дистрофий сетчатки весьма трудоемкий процесс, успех которого зависит от опыта офтальмохирурга и дальнейшей терапии, поэтому разработка новых препаратов способствующих восстановлению клеток сетчатки является наиболее перспективным направлением.
На стадии клинических разработок находится генная терапия. Изучается возможность «доставлять» ген фактора пигментного эпителия сетчатки в ткани глаза при помощи модифицированного аденовируса. Использование подходов генной терапии, могло бы позволить стимулировать выработку эндогенного антиангиогенного протеина, играющего важную роль в регуляции ангиогенеза (Lai С.С, 1999). Клинических данных, касающихся применения методов генной терапии для активации эндогенных ингибиторов ангиогенеза при развитии вторичной дистрофии у больных туберкулезными хориоретинитами пока нет.
Значительный интерес представляет восстановление структурной организации и функциональной активности сетчатки и зрительного нерва с помощью клеточных технологий. Рассматривая эту проблему, можно выделить два направления: возможность замещения поврежденных ретинальных структур донорскими стволовыми клетками и возможность стимуляции репаративной регенерации сетчатки через продукцию различных нейротрофических факторов и биологически активных веществ, выделяемых стволовыми клетками (Гундорова Р.А. и соавт., 2005).
Методы трансплантации стволовых клеток в настоящее время отрабатываются в экспериментах на животных. Предпринимаются попытки трансплантации ретинального пигментного эпителия при атрофических процессах в макуле у животных (Gouras P., Algvere P.V., 1996; Yamamoto S. et al., 1993).
Появились работы по трансплантации клеток пигментного эпителия пациентам с возрастной макулодистрофией (Algvere P.V., et al., 1997,1999; Zamiri P., et al., 2004). Мнения исследователей об эффективности этих операций противоречивы (Van Meurs J.C. et al., 2004). К тому же следует отметить, что данные оперативные вмешательства дорогостоящие и травматичные. Для их проведения необходимы четкие показания. Получить материал, состоящий из стволовых (полипотентных) клеток человека затруднительно, поскольку данный вопрос не нашел законодательного подтверждения. Разрешена лишь аутотрансплантация, но в офтальмологической практике она не целесообразна.
При лечении хориоретинальных дистрофий описанные методы используются в зависимости от клинической картины и стадии заболевания. Однако, применение медикаментозной терапии на стадии лечения воспалительного процесса и для стимуляции метаболических и обменных процессов является необходимым независимо от течения болезни. Наибольшую эффективность показывают препараты, направленно действующие на конкретные звенья патогенетического процесса. Поэтому создание и исследование новых лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительными свойствами, и способностью регулировать метаболические процессы на молекулярном уровне по-прежнему является актуальным.
В рамках программ Отделения биологических наук РАН «Фундаментальная науке - медицине» и «Поддержка инноваций и разработок» в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН был разработана лекарственная форма препарата «Аноцептин» в виде раствора для инъекций. Специфические свойства «Аноцептин» реализует за счет непосредственного влияния на систему мембранной сигнализации трансдуктором сигнала в которой является Na/K-АТФаза.
ИаЛС-АТФаза - встроенный в мембрану фермент. В клетках фермент выполняет функцию ионного насоса, трансдуктора сигнала и возможно, является рецептором для эндогенных дигиталисоподобных факторов (Болдырев А.А., 1998; Крылов Б.В., с соавт., 1999; Schonner W., 2005).
При исследовании избирательности действия препарата в опытах in vivo было обнаружено, что «Аноцептин» стимулирует системный иммунитет за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов. Поскольку, Na/K-АТФаза проявляет функцию трансдуктора сигнала при регуляции клеточного метаболизма, внутриклеточной сигнализации, роста и пролиферации клеток разных тканей (Пеннияйнен В. А. и соавт., 2003; Лопатина Е.В. и соавт., 2005 а; Лопатина Е.В. и соавт., 2005 б; Xie Z, Askari А, 2002; Schonner W., 2005), было высказано предположение о том, что препарат «Аноцептин» может оказаться эффективным при лечении поствоспалительных дистрофий сетчатки. Модель туберкулезного хориоретинита объединяет в себе компонент воспаления и элементы деструктивных изменений в клетках ткани сетчатки. Для изучения возможных трофических свойств препарата на тканевом уровне был выбран метод органотипической культуры ткани.
Метод органотипического культивирования ткани сетчатки
В работе использовали коллаген, который получали из сухожилий хвостов крыс по методу Бернстайна (Bernstein М. В. , 1958).
Практически это делалось следующим образом: крысиный хвост, помещенный в чашку Петри со спиртом и выдержанный при -10С не менее 15 минут, освобождали от кожи и при помощи двух зажимов разламывали на кусочки (по 1-1.5 см от кончика к центральной части), затем вытягивали сухожильные нити. Последние помещали в чашку Петри со стерильной дистиллированной водой. Сухожилия от одного хвоста расщепляли на отдельные волокна при помощи тонких пинцетов, опускали в колбу, содержащую 159 мл 0.1%-ного раствора ледяной уксусной кислоты, и оставляли в холодильнике на 48 часов. Затем содержимое колбы центрифугировали в течение часа при 6 тыс. об/мин и получали до 80 мл вязкого раствора. К остатку добавляли 30 мл раствора уксусной кислоты, через 24 часа снова центрифугировали и получали до 40 мл раствора коллагена. Приготовленный таким способом коллаген может храниться в холодильнике до года. Перед использованием коллаген подвергали диализу и испытывали на стерильность. Полученный коллаген наносили на разрезанные предметные стекла (для проведения цитологических исследований), или на дно 40-мм чашки Петри. Коллагеновую пленку уплотняли парами аммиака. Через 2-5 минут восстановленный коллаген образовывал тонкую гель-пленку. Для нейтрализации щелочной реакции геля, чашки Петри промывали дистиллированной водой. Через час коллаген сливали и давали поверхности высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Коллаген образовывал тонкую пленку на дне чашки Петри. Перед использованием поверхность чашек несколько раз промывали раствором Хенкса.
Для получения органотипической культуры ткани сетчатки осуществляли энуклеацию глаза 10-12 дневного куриного эмбриона. Глаз помещали в чашку Петри (диаметр 10 см), с небольшим количеством питательной среды. Инструментами для микрохирургии глаза аккуратно отделяли ткани передней камеры глаза, после чего извлекали стекловидное тело. Далее, ориентируясь на пигментные клетки, осуществляли препаровку ткани сетчатки и переносили частички ткани на коллагеновую подложку стерильных чашек Петри (диаметр 3 см). Герметически закрытые чашки Петри с прикрепленными эксплантатами на 10 минут помещали в термостат. Температура в термостате составляла 36.8 С. Затем чашки извлекали из термостата и заливали в них 3 мл питательной среды и на 30 минут снова помещали в термостат.
После чего извлекали чашки Петри из термостата и добавляли в питательную среду исследуемые вещества. Далее чашки Петри помещали в С02 инкубатор (Sanyo, Япония). Культивирование эксплантатов. ткани сетчатки осуществляли при 37С и 5% СОг в течение 3 суток.
Для проведения цитологических исследований в части экспериментов на дно чашек Петри (диаметр 3 см) помещали разрезанное предметное стекло, поверхность которого предварительно заливали коллагеном вместе с дном чашки. В этом случае эксплантаты ткани сетчатки высаживали на коллагеновую подложку предметного стекла.
Для визуализации эксплантатов использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Количественную оценку роста эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов осуществляли с помощью пакета программ PhotoM.
Для количественной оценки влияния исследуемых веществ применяли морфометрический метод. Интенсивность роста эксплантатов оценивали с помощью относительного критерия - индекса площади (ИП). ИП рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны (рис.1). За условную единицу площади принимали квадрат сетки микроскопа, сторона квадрата при увеличении 3.5x10 равнялась 150 мкм.
Для удобства сопоставления результатов, полученных в разных сериях экспериментов, значения ИП выражали в процентах. Контрольное значение ИП принимали за 100%. В каждой серии за "п" принимали количество эксплантатов, развивающихся в культуральной среде.
Гистологические исследования используются в медицине и биологии для получения данных о строении и состоянии клеток и клеточных структур после тех или иных воздействий. В работе использовалась модифицированная техника исследования, так как клетки культивируемой ткани представляли собой монослой, формирующий зону роста. Вследствие этого отпала необходимость в приготовлении срезов. Данная часть работы позволила зафиксировать наличие или отсутствие изменений, которые могут происходить на клеточном уровне в процессе фармакологического воздействия.
Для проведения цитологических исследований эксплантаты ткани сетчатки выращивали на стеклах, помещенных в чашки Петри. При приготовлении чашек Петри на дно чашек помещали разрезанное предметное стекло, затем всю поверхность дна вместе со стеклом заливали раствором коллагена. Наличие ровного слоя коллагена обеспечивает нормальное прикрепление эксплантатов во время культивирования.
Влияние «Аноцептина» на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре
В этой части работы исследовали влияние препарата «Аноцептин» на регуляцию пролиферации клеток ткани сетчатки в модельных условиях. Действующей субстанцией препарата «Аноцептин» является коменовая кислота - одна из производных гамма-пирона.
Исследовано 500 эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов.
Контрольными служили эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды. Препарат «Аноцептин» добавляли в питательную среду в концентрациях: 10"6 М, 10"7 М, 10 8 М, 10"10 М (в пересчете на действующую субстанцию — коменовую кислоту) (рис. 2). Контрольное значение ИП принимали за 100%, достоверность различий в ИП оценивали с помощью t- критерия Стъюдента.
При введении в питательную среду препарата «Аноцептин» (10"6 М) наблюдали достоверное угнетение роста эксплантатов ткани сетчатки на 24±2% (п=25; р 0.05) по сравнению с контролем (п=25). В концентрации 10" М препарат «Аноцептин» незначительно угнетал рост эксплантатов ткани сетчатки. ИП эксплантатов был ниже контрольного значения на 17,5±2% (п=27). Добавление в культуральную среду препарата в концентрации 10"8 М приводило к достоверной стимуляции роста эксплантатов ткани сетчатки на 18±2% (п=25; р 0.05) по сравнению с контролем (п=25). При введении в питательную среду препарата в концентрации 10"10 М наблюдали стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки. ИП был достоверно выше контрольного значения на 50% (п=25; р 0.05). Таким образом, впервые было обнаружено дозозависимое действие препарата «Аноцептин» по отношению к регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов.
На фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружено, что зону роста контрольных и экспериментальных эксплантатов ткани сетчатки составляют клетки пигментного эпителия, ганглиозные клетки, палочки, колбочки (рис. 3; рис. 4; рис. 5).
При изучении анальгетических и противовоспалительных свойств препарата «Аноцептин» было обнаружено, что его основной компонент -коменовая кислота модулирует ноцицептивный сигнал за счет активации трансдукторной функции Na/ К-АТФазы мембраны сенсорного нейрона.
В качестве трансдуктора сигнала Na/ К-АТФаза принимает участие в регуляции внутриклеточной сигнализации, роста и пролиферации клеток тканей разного типа (Крылов Б.В. и соавт., 1999; Пеннияйнен В.А. и соавт., 2003; Лопатина Е.В. и соавт. 2005а; Лопатина Е.В. и соавт. 20056; Пеннияйнен В. А. и соавт., 2008; Xie Z, 2001).
Для того, чтобы оценить возможный механизм обнаруженного трофического действия препарата «Аноцептин» и участие в этом процессе Na/ К-АТФазы было необходимо: 1. исследовать действие оуабаина на процесс пролиферации клеток сетчатки глаза 10-12 дневных куриных эмбрионов; 2. оценить стимулирующий эффект препарата «Аноцептин» в присутствии сердечного гликозида оуабаина. сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов (трое суток культивирования). По оси абсцисс - концентрация, М; По оси ординат - индекс площади эксплантатов (ИП, %). - р 0.05 Микрофотография зоны роста эксплантата ткани сетчатки 10-12 дневного куриного эмбриона (3-й сутки культивирования, ув. Х200) -основная серия. Окраска гематоксилином и эозином. 1- фоторецепторная клетка (палочка) 2- фоторецепторная клетка (колбочка) 3- ганглиозная клетка Блокатор Na/ К-АТФазы оуабаин исследовали в диапазоне концентраций от 10" до 10 М (рис. 6). Контрольными служили эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды. Впервые обнаружено, что оуабаин в концентрации 10" М достоверно стимулирует рост ткани сетчатки. ИП был выше контрольного значения на 34% (п=25; р 0.05). Введение в питательную среду оуабаина в концентрации 10"12 вызывало недостоверную стимуляцию роста клеток сетчатки на 18% (п=25), по сравнению с контрольным значением ИП. Оуабаин в концентрации 10"11 М стимулировал рост ткани на 15 % (n=25)3 а в концентрации 10"10 М на 5%. Необходимо отметить, что в этой концентрации оуабаин в аналогичных экспериментальных условиях достоверно стимулирует рост эксплантатов ткани сердца на 30% (Лопатина Е.В. и соавт., 2005) и угнетает рост нейритов сенсорных нейронов на 50%) (Пеннияйнен В.А. и соавт., 2003). В присутствии оуабаина в концентрации 10"9 М наблюдали незначительное угнетение степени роста клеток ткани сетчатки (рис. 6) Значение ИП практически не отличалось от контрольного. При введении в питательную среду оуабаина в концентрации 10"8 М рост эксплантатов ткани сетчатки отсутствовал. Последнее, хорошо согласуется с результатами, полученными при исследовании действия оубаина на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов (Пеннияйнен В.А. и соавт., .2003) и эксплантатов ткани сердца (Лопатина Е.В. и соавт., 2005 а,б). Цитологические исследования показали, что в зоне роста контрольных и экспериментальных эксплантатов, окрашенных гематоксилином и эозином, присутствовали клетки пигментного эпителия сетчатки, ганглиозные клетки, палочки и колбочки.
