Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Фотофизические и фотохимические процессы в молекулах индола, триптофана и их производных 10
1.1.1. Спектроскопия основного состояния 10
1.1.2. Первичные фотопроцессы в молекуле триптофана 11
1.1.3. Фотоионизация индола и триптофана 13
1.2. Термические и фотохимические реакции кинуренина и его производных 17
1.2.1. УФ фильтры хрусталика глаза 17
1.2.2. Термические реакции 18
1.2.3. Кинуренин и его производные в процессах старения хрусталика глаза и катарактогенезе 21
1.2.4. Фотохимические реакции 23
1.2.5. Механизмы ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний в органических молекулах 26
1.3. Постановка задачи 27
2. Экспериментальная часть 30
2.1. Материалы и реактивы 30
2.2. Стационарные методы исследования 31
2.2.1. Оптическая спектроскопия 31
2.2.2. Фотолиз 31
2.2.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 32
2.3. Времяразрешенные методы исследования 32
2.3.1. Наносекундный лазерный импульсный фотолиз 32
2.3.2. Фемтосекундный лазерный импульсный фотолиз 34
2.3.3. Время-коррелированный счет фотонов (ВКСФ) 35
2.3.4. Флуоресценция с фемтосекундным временным разрешением (ир-conversion] 35
2.4. Программное обеспечение 36
2.5. Анализ данных флуоресценции 36
3. Фотоионизация водных растворов индола, триптофана и их производных 38
3.1. Введение 38
3.2. Однофотонная ионизация триптофана и его производных 38
3.2.1. Зависимость выхода ионизации от энергии лазерного излучения 38
3.2.2. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для TV-ацетилтриптофана (TVATrpH) и L-триптофана (L-TrpH} 42
3.2.3. Зависимость квантового выхода внутримолекулярного переноса протона (ВПП) от температуры для L-TrpH 44
3.2.4. Реакции синглетного возбужденного состояния триптофана 46
3.2.5. Численное моделирование полученных результатов 48
3.3. Конкуренция между фотоионизацией из состояния *S и релаксацией *S->Si в молекулах индола и триптофана 49
3.3.1. Зависимость квантового выхода радикалов индола и L-триптофана от температуры в различных растворителях 50
3.3.2. Механизм колебательной релаксации *S-»Si 52
3.4. Заключение 53
4. Фотофизические и фотохимические процессы в молекуле кинуренина 55
4.1. Введение 55
4.2. Спектроскопия основного состояния 55
4.3. Ультрабыстрая динамика гибели синглетных возбужденных состояний KN и 30HKN 56
4.3.1. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения KN 56
4.3.2. Квантовый выход флуоресценции KN и его зависимость от температуры 68
4.3.3. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения 30HKN 71
4.3.4. Релаксационная динамика состояния Si 72
4.3.5. Механизм ультрабыстрого безизлучательного перехода Si—>So 72
4.4. Фотохимические свойства триплетного состояния KN 75
4.4.1. Фотолиз KN, сенсибилизированный ацетоном 75
4.4.2. Прямой фотолиз KN в водных растворах 81
4.4.3. Зависимость квантового выхода триплетного состояния KN от растворителя 82
4.5. Двухфотонная ионизация KN и 30HKN 86
4.5.1. Спектры промежуточного поглощения интермедиатов KN и 30HKN 86
4.5.2. Механизм фотоионизации KN и 30HKN 92
4.6. Заключение 94
5. Реакции тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза 96
5.1. Введение 96
5.2. Методика экспериментов 96
5.3. Реакции тушения триплетного состояния KN 97
5.3.1. Аскорбат 97
5.3.2. Глутатион восстановленный 99
5.3.3. Триптофан 101
5.3.4. М-ацетил-Z.-тирозин 102
5.3.5. ЛГ-ацетил--гистидин, М-ацетил-/,-метионин, L-цистеин 103
5.3.6. Кислород 103
5.4. Заключение 104
6. Фотохимическая активность аддуктов кинуренина с аминокислотами гистидином, лизином, цистеином и антиоксидантом глутатионом 106
6.1. Введение 106
6.2. Спектроскопия основного состояния 107
6.3. Ультрабыстрая динамика гибели состояния Si 109
6.4. Триплетные состояния и радикалы 112
6.5. Фоторазложение водных растворов аддуктов 114
6.6. Заключение 118
Выводы 119
- Термические и фотохимические реакции кинуренина и его производных
- Программное обеспечение
- Ультрабыстрая динамика гибели синглетных возбужденных состояний KN и 30HKN
- Двухфотонная ионизация KN и 30HKN
Введение к работе
Ультрафиолетовое излучение Солнца, достигающее поверхности нашей планеты, в небольших дозах оказывает благотворное воздействие на здоровье человека - повышает активность иммунной системы, стимулирует выработку витамина Д, а также ряда гормонов, таких как мелатонин и серотонин («гормон бодрости»). Длительная недостаточность ультрафиолетового излучения может приводить к так называемому «световому голоданию» или «зимней депрессии» — заболеванию, сопровождающемуся нарушением обмена веществ, снижению иммунитета, быстрой утомляемости и т.д. Избыточные дозы облучения могут также оказывать негативное воздействие на человеческий организм - фотоповреждения белковых молекул могут приводить к изменению активности или гибели клеток, что в результате может приводить к развитию таких заболеваний как рак кожи, злокачественная меланома, катаракта и другие. В настоящее время механизмы возникновения и развития этих заболеваний остаются, во многом, неизвестными.
По степени воздействия на ткани живых организмов, ультрафиолетовое излучение делится на три диапазона - ближний, УФ-А (315-400 нм), средний УФ-Б (280-315 нм) и дальний ультрафиолет УФ-С (280-100 нм). Коротковолновое УФ-С излучение потенциально является наиболее опасным для белковых молекул, т.к. оно может приводить к прямому фотораспаду молекулы белка и/или прямой фотоионизации большинства аминокислот, являющихся структурными единицами этих макромолекул. К счастью, УФ-С излучение практически полностью поглощается озоновым слоем и верхними слоями атмосферы. Излучение УФ-Б диапазона, на 90% поглощаемое земной атмосферой, является более мягким, однако оно также способно инициировать необратимые изменения в функционировании белков посредством фотоионизации таких ароматических аминокислот, как триптофан и тирозин. И, наконец, длинноволновое УФ-А излучение может приводить к фотоповреждениям клеточных структур посредством сенсибилизирования реакционных форм кислорода, свободных радикалов и/или прямой реакции хромофоров с аминокислотными остатками белков. УФ-А излучение является наиболее опасным для живых существ, поскольку оно достигает поверхности Земли с минимальными потерями.
Кожа и органы зрения человека в наибольшей степени подвержены воздействию солнечного ультрафиолетового излучения. Наиболее злокачественные заболевания этих органов, такие как рак и катаракта, развиваются примерно у половины населения земного шара, перешагнувшего рубеж 65 лет [1,2]. Широкое распространение этих заболеваний
обуславливает их высокую социальную и экономическую значимость. Выявляемые клинически изменения соответствуют, как правило, необратимым стадиям заболевания, когда терапевтическое вмешательство малоэффективно. Хирургическое вмешательство является основным методом лечения этих заболеваний, т.к. лекарств, способных устранить злокачественную раковую опухоль или восстановить прозрачность хрусталика, в настоящее время не существует. Важно отметить, что большая часть ведущихся в мире исследований производится научными группами медицинской и биологической направленности. В результате их деятельности накоплен значительный материал об изменениях химического состава, морфологии и ряда других важнейших свойств кожи и органов зрения в процессах развития этих заболеваний. Тем не менее большая часть этих данных имеет качественный характер, не позволяющий создать адекватную модель химических процессов, протекающих в соответствующих тканях. Таким образом, исследование первичных фотореакций, протекающих в тканях человеческого организма, является актуальной задачей для понимания механизмов развития различных заболеваний, индуцированных солнечным УФ излучением, а также разработки лекарственных препаратов, направленных на ингибирование нежелательных процессов.
Ткани кожи и органов зрения обладают различным белковым составом, однако большая часть белков содержит аминокислоту триптофан, который является основным хромофором белковых молекул в УФ-Б диапазоне. Фотоионизация триптофана может приводить к фотоинактивации ферментов и фотоиндуцированному повреждению белков, что, как уже было отмечено, может являться начальной стадией развития различных заболеваний. Несмотря на многочисленные исследования фотохимии триптофана на протяжении нескольких последних десятилетий, несколько фундаментальных вопросов, касающихся фотоионизации триптофана, остаются открытыми. Прежде всего остаются невыясненными механизм однофотонной ионизации, а.также природа возбужденного состояния, являющегося предшественником этой фотореакции.
Защита органов зрения от солнечного ультрафиолетового излучения осуществляется преимущественно группой низкомолекулярных соединений, содержащихся в хрусталике глаза. Эти соединения - кинуренин и его производные - являются природными метаболитами аминокислоты триптофан и обладают поглощением в УФ-А диапазоне. Фотохимические реакции этих соединений мало изучены. Было показано, что эти соединения являются очень слабыми фотосенсибилизаторами; на этом основании был сделан вывод, что кинуренины являются молекулярными УФ фильтрами, предохраняющими хрусталик и сетчатку глаза от фотоповреждений. Механизм эффективной УФ защиты в настоящее время остается невыясненным. Недавно было
показано, что фотовозбужденные состояния кинуренина могут окислять ряд биологически важных соединений, таких как цистеин и НАДН, т.е. они способны наносить фотоповреждения органическим молекулам ближайшего кружения. Исследования термических реакций кинуренинов показали, что эти соединения являются нестабильными при физиологических условиях. Спонтанное дезаминирование приводит к образованию химически активных ненасыщенных соединений, которые могут присоединяться к нуклеофильным аминокислотным остаткам белков - гистидину, лизину и цистеину. Белки, модифицированные молекулами УФ фильтров, демонстрируют заметную фотохимическую активность и способны образовывать реакционные формы кислорода при аэробном фотолизе. Эти сообщения показывают, что, несмотря на эффективную защиту от УФ излучения, кинуренины могут участвовать в реакциях фотоповреждения белков хрусталика и развития катаракты. В настоящее время механизмы этих реакций остаются неизвестными.
Отметим, что фотохимические реакции гомогенных растворов триптофана и кинуренина могут существенно отличаться от реакций, протекающих в живых организмах. Это связано с тем, что, во-первых, в живых клетках триптофан присутствует преимущественно в составе белковых молекул, а, во-вторых, реакции в молекулярно-организованных средах (меж- и внутриклеточное пространство, плотная упаковка белков хрусталика) могут существенно отличаться от реакций в гомогенных растворах. Тем не менее, исследование фотовозбужденных состояний триптофана и кинуренина и их реакций является необходимым для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живых организмах.
Настоящая работа посвящена исследованию динамики и механизмов фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекулах триптофана и кинуренина, изучению спектральных и фотохимических свойств короткоживущих промежуточных частиц, образующихся в результате фотолиза этих соединений, и возможных реакций этих частиц с молекулами локального окружения. Исследования проводились с использованием методов времяразрешенной оптической спектроскопии (УФ и видимый диапазон длин волн) в широком временном диапазоне: от нескольких сотен фемтосекунд до нескольких десятков часов.
Целями данной работы являются:
Исследование влияния параметров среды (температура, рН среды, растворитель) на механизм однофотонной ионизации триптофана.
Исследование механизма ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний кинуренина, а также механизма фотоионизации. Определение влияния внешних условий (растворитель, изотопное замещение, значение рН среды, температура) на исследуемую фотофизику кинуренина.
Изучение реакционной активности триплетного состояния кинуренина, образующегося под действием УФ излучения, по отношению к ряду соединений, содержащихся в хрусталике глаза.
Исследование фотохимической активности ковалентно-связанных аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в хрусталике глаза.
Настоящая диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы.
В первой главе диссертации приведен обзор литературы по фотофизическим и фотохимическим процессам с участием триптофана, кинуренина и родственных им соединений. Также представлен обзор термических реакций кинуренина, которые имеют место в хрусталике глаза и приводят к существенным изменениям фотохимических свойств этой молекулы.
Вторая глава посвящена описанию используемого оборудования, программного обеспечения и методик проведения экспериментов.
В третьей главе представлено исследование влияния температуры и растворителя на механизм однофотонной ионизации триптофана и обсуждаются вклады различных возбужденных состояний в эту фотореакцию.
В четвертой главе приведено исследование первичных фотопроцессов, протекающих в молекуле кинуренина, и обсуждаются механизмы ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний и фотоионизации.
Пятая глава посвящена реакциям тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза.
В шестой главе диссертации приведены доказательства того, что ковалентное присоединение кинуренина к аминокислотам и антиоксидантам приводит к увеличению фотохимической активности образующихся аддуктов.
Термические и фотохимические реакции кинуренина и его производных
В хрусталике глаза УФ фильтры образуются посредством метаболических превращений триптофана по так называемому «пути кинуренина» [43-45]. Фермент индоламин 2,3-диоксигеназа [46,47] инициирует образование N-формилкинуренина, который подвергается быстрому гидролизу с образованием KN [46]. Основным путем метаболизма KN является гияроксилирование с образованием 30HKN, последующее гликозилирование приводит к образованию основного УФ фильтра - 30HKG [42,45]. Концентрация УФ фильтров в хрусталике человеческою глаза значительно варьируется от индивидуума к индивидууму, однако в среднем наблюдается выраженная тенденция к понижению концентрации этих соединений с возрастом [48]. Концентрация 30HKG - основного УФ фильтра у приматов - в хрусталиках моложе 20 лет варьируется от 300 до 700 нмоль/грамм, в то время как в хрусталиках старше 80 лет она падает ниже 100 нмоль/грамм. Похожая картина наблюдается и с другими УФ фильтрами. Средние значения концентраций составляют: AHBG - 50 нмоль/грамм (моложе 20 лет) и 25 нмоль/грамм (старше 80); KN - 30 нмоль/грамм (моложе 20 лет) и 5 нмоль/грамм (старше 80 лет); 30HKN - 7 нмоль/грамм (моложе 20 лет) и 2 нмоль/грамм (старше 80 лет) [48]. Таким образом, с уменьшением концентрации УФ фильтров хрусталики людей старшего возраста являются менее защищенными от фотоиндуцированных повреждений. Весьма вероятно, что возрастное снижение концентрации УФ фильтров в хрусталиках обусловлено внутренним барьером, образующимся в среднем возрасте и препятствующим диффузии небольших молекул в и из центральной части хрусталика [50-52]. 1.2.2. Термические реакции Недавние исследования показали, что кинуренин и его производные, содержащие аминокислотную боковую цепочку (KN, 30HKN, 30HKG), являются нестабильными и могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием карбоксикетоалкенов: 2-амино-4-(2-аминофенил)-4-оксобутеновая кислота (СКА), 2-амино-4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутеновая кислота (ЗОНСКА) и О-p-D гликозид 2-амино-4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутеновой кислоты (30HCKAG), Рис. 1.4 [53,54]. Установлено, что реакция дезаминирования протекает посредством медленного неферментативного элиминирования аммиака боковой цепочки с образованием ненасыщенного а,р-кетона [54,55].
Исследование температурной зависимости позволило установить параметры Аррениуса для реакции дезаминирования кинуренина KN: энергию активации Еа = 121±14 кДж/моль и предэкспоненциальный множитель log( ) = 13.6+0.8 [54]. Экстраполяция температурной зависимости к физиологической температуре 37С дает значение константы скорости дезаминирования коеам 1.5x10"7 с"1, что позволяет оценить время жизни кинуренинов в физиологических условиях как примерно 2-3 месяца. Заметим, что в щелочных растворах реакция дезаминирования кинуренина ускоряется [53,56]. Ненасыщенные кетоны, образующиеся в результате дезаминирования кинуренинов, являются химически активными соединениями, и могут вступать в реакции с молекулами, содержащимися в хрусталике глаза. В настоящее время установлено, что в хрусталике глаза могут иметь место следующие реакции с участием карбоксикетоалкенов (Рис. 1.4): реакции циклизации с образованием желтых производных кинуренинов, реакции восстановления двойной связи с образованием новых УФ фильтров, реакции присоединения к аминокислотам и антиоксидантам с образованием соответствующих ковалентно-связанных аддуктов. В отсутствие нуклеофилов и антиоксидантов основной реакцией карбоксикетоалкенов является циклизация с образованием желтых производных кинуренина (см. Рис. 1.4): 2-карбокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (KN yellow), 2-карбокси-8-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (30HKN yellow) и 0-$-D гликозида 2-карбокси-8-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (30HKG yellow) [53,54,57,58]. Впервые in vitro синтез KN yellow был описан в работах [58,59], где было показано, что данное соединение образуется в результате внутримолекулярного присоединения по Михаэлю нуклеофильной аминогруппы, находящейся в орто-положении, к активированному карбоксикетоалкену. Позднее [53] при инкубировании УФ фильтров KN, 30HKN и 30HKG наблюдалось образование циклических кинуренинов KN yellow, 30HKN yellow и 30HKG yellow, при этом наибольший выход циклического производного наблюдался для KN, затем для 30HKN и наименьший для 30HKG [60]. Уменьшение скорости циклизации авторы объяснили увеличением стерических затруднений, создаваемых заместителем в мета-положении ароматического кольца. Как в нормальных, так и в катарактальных хрусталиках глаз человека циклические соединения KN yellow, 30HKN yellow и 30HKG yellow обнаружены не были [60]. Двойная связь в молекуле карбоксикетоалкена может быть восстановлена в результате реакции с антиоксидантом НАДН [55,57,61].
В работе [55] было установлено, что в результате данной реакции в хрусталике глаза происходит синтез второго по количественному содержанию УФ фильтра - AHBG, непосредственно из основного фильтра 30HKG. Схожие реакции, приводящие к синтезу новых УФ фильтров, можно ожидать и для других УФ фильтров - KN и 30HKN. Важнейшей особенностью карбоксикетоалкенов (СКА) является способность присоединяться к нуклеофильным аминокислотным остаткам белков хрусталика — гистидину (His), лизину (Lys) и цистеину (Cys), см. Рис. 1.4 [62,63]. В результате данных реакций образуются ковалентно-связанные аддукты, которые в свободном состоянии могут выполнять функции УФ фильтров [64,65]. Исследование реакций СКА с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующих в составе хрусталика глаза, позволило определить константы скорости присоединения СКА к этим соединениям [57]. Оказалось, что константы скорости реакций с тиолами — цистеином (Cys) и глутатионом (GSH) на 4-5 порядка по величине выше, чем с другими соединениями [53,57,61]. Это означает, что цистеиновые аминокислотные остатки белков являются наиболее уязвимыми для модификации дезаминированными УФ фильтрами, а защита от модификации осуществляется с помощью антиоксиданта глутатиона [62,66]. Было показано, что СКА не реагирует с аминокислотами метионин, тирозин и триптофан [57]. В работе [57] были определены значения параметров Аррениуса для констант скорости реакции СКА с цистеином и глутатионом: Acys = (2.7+0.9)х108 IvT c"1, Ecys - 40.4±5.7 кДж/моль, AGSH = (1.8±0.7)хЮ5 M V, EGSH = 29.2±5.6 кДж/моль. Значительное различие в предэкспоненциальных множителях свидетельствует о важной роли стёрического фактора в реакции присоединения, благодаря которому реакция с более объемной молекулой глутатиона протекает медленнее, чем с молекулой цистеина. Следовательно, можно предположить, что константа скорости реакции СКА с цистеиновыми остатками, находящимися внутри белковой глобулы, может быть на много порядков меньше, чем со свободным цистеином. Образование аддуктов карбоксикетоалкенов с глутатионом и с аминокислотами является обратимой реакцией: эти аддукты при физиологических условиях нестабильны и распадаются с образованием карбоксикетоалкена и исходной аминокислоты [57,67,68]; при этом цистеиновый аддукт является менее стабильным, чем лизиновый и гистидиновый [67,68].
Программное обеспечение
Пакет программного обеспечения установки наносекундного лазерного фотолиза (разработчик - д.х.н. Ю.П. Центалович, МТЦ СО РАН) основан на ядре программы Matlab 7.1 и позволяет осуществлять подгонку получаемых временных профилей кривыми первого, второго порядка, их суммой, а также кривыми, полученными в результате численного расчета систем дифференциальных уравнений. Спектры промежуточного поглощения, полученные на установке фемтосекундного лазерного фотолиза, были обработаны пакетом программ (разработчик - Якоб Грилж, университет г. Женевы), использующих для вычислений ядра программ Matlab 7.1 и Igor Pro 6.0. Временные профили флуоресценции, получаемые методом ВКСФ, были рассчитаны с помощью программы, использующей итерационную численную развертку (деконволюцию) наблюдаемого сигнала с помощью измеренной аппаратной функции и одной экспоненциальной функции (Matlab 7.1, разработчик — Якоб Грилж). Для представления графической информации была использована программа Microcal Origin 7.5. Анализ данных флуоресценции был проведен согласно процедуре подробно описанной в работах [142,143]. Приведем краткую выдержку из этих работ. Наблюдаемые временные профили флуоресценции D(A,t) могут быть воспроизведены с помощью свертки (конволюции) аппаратной функции, описываемой функцией Гаусса, и основной функции, которой в нашем случае является сумма одной гауссовой и нескольких экспоненциальных функций. Свертка одной гауссовой (аппаратной функции) с другой гауссовой функцией или с экспоненциальной функцией приводит к следующим аналитическим выражениям, соответственно: где Го - центр импульса лазера, w - гауссова ширина аппаратной функции, о/ и г/ -амплитуда и обратная ширина функции Гаусса, а,- и г, - амплитуда и временная константа /-ой экспоненциальной функции.
Далее осуществлялась глобальная подборка этих параметров нелинейным методом наименьших квадратов так, чтобы сумма членов в уравнении (2.3) наиболее близко описывала полученные профили флуоресценции. Такой подход позволяет получить необходимые значения временных констант динамики флуоресценции намного быстрее, чем итерационная численная развертка и позволяет легко обрабатывать данные с неравномерными интервалами между точками по временной шкале. Измерения были выполнены на 8-10 длинах волн в диапазоне от 420 до 580 нм на временной шкале, совпадающей со временем гибели флуоресценции. Поскольку данная процедура позволяет получить характерные времена наблюдаемой эволюции флуоресценции, то амплитуды различных каналов гибели могут быть определены с помощью умножения временных профилей на фактор F(X): S(X) где S(l) - интенсивность стационарной флуоресценции. Спектры А,(Л) = F(X) х а,(Я) являются амплитудными спектрами, соответствующие /-ому каналу гибели флуоресценции. Времяразрешенные спектры эмиссии были восстановлены, опираясь на аналитические выражения (2.1—2.3) с использованием значений параметров, полученных в результате расчета наблюдаемых профилей флуоресценции. Погрешность в определении значений временных констант и амплитуд около 10%, за исключением временных констант короче 500 фс, для которых погрешность составляет 100 фс. Как уже отмечалось в обзоре, посвященном фотохимии триптофана (раздел 1.1), в настоящее время не ясно, какое из возбужденных состояний, нерелаксированное предфлуоресцентное S или релаксированное Si, является предшественником однофотонной ионизации триптофана в конденсированной среде. Недавно было показано [8], что в очень кислых средах (рН 0.1) фотоионизация триптофана имеет место только из состояния S; ионизация из состояния Si подавлена другими каналами гибели данного состояния, прежде всего протонированием индольного кольца через растворитель. Таким образом, проведение экспериментов в кислой и нейтральной средах может позволить корректно разделить вклады состояний S и S в общий процесс фотоионизации и провести детальное исследование механизма однофотонной ионизации триптофана в водных растворах. Результаты, полученные в рамках использования этого подхода, представлены в последующих разделах Главы III. При исследовании однофотонной ионизации триптофана необходимо принимать во внимание, что участие двухфотонных процессов может существенно исказить полученные результаты [18,31]. Следовательно, первым шагом данного исследования было определение условий, при которых вклад двухфотонных процессов в общую ионизацию триптофана является незначительным. Химические структуры и оптические спектры поглощения водных растворов (рН 7.0) индола (IH), Z-триптофана (LrpH) и тУ-ацетил-/.-триптофана (TVATrpH) представлены на Рис. 3.1. Хромофорной группой данных соединений является индольное кольцо; присутствие аминокислотной цепочки приводит к сдвигу спектров в красную область. Согласно данным, приведенным в литературе (раздел 1.1 и Рис. 1.2), фотолиз ментальных водных растворов триптофана приводит к образованию следующих короткоживущих частиц: нейтрального ТгрН и протонированного гТгрНг+ триплетных состояний, катион-радикала ТгрН + и сольватированного электрона е МЬ8. В нейтральных растворах катион-радикал быстро депротонируется (рКа = 4.3 [6]), образуя нейтральный радикал Тгр . Основным каналом гибели сольватированного электрона является присоединение к молекуле триптофана в основном состоянии {к-\ = З.ОхЮ8 М_1см [144]), что приводит к образованию анион-радикала ТгрН -, который быстро протонируется с образованием ТгрНг . На Рис. 3.2 квадратами () представлен спектр промежуточного поглощения, являющийся суперпозицией трех частиц: тТгрН, Тгр и ТгрНг . Частица тТгрНг+ является короткоживущей (г— 30 не) и не дает вклада в спектр, наблюдаемый через 3 мке после импульса лазера. В присутствие ацетона имеет место быстрая гибель сольватированного электрона (к? = 6.6x109 М" см" [144]) с образованием радикала ацетона Ас , который быстро протонируется с образованием АсН.
Таким образом, спектр, представленный на Рис. 3.2 треугольниками (Л), является суперпозицией спектров нейтральных триплетного состояния тТгрН и радикала Тгр . Отметим, что поглощение ацетона при используемой концентрации является незначительным (308 = 0.4 М" см" ); радикалы ацетона, образующиеся в результате захвата сольватированного электрона, также являются слабыми хромофорами при А. 300 нм [145]. В присутствие кислорода, который является эффективным тушителем триплетных состояний (&т = 5.3х109 М см"1 [8]) единственным долгоживущим и наблюдаемым интермедиатом является радикал Тгр , представленный в виде закрашенных кружков () на Рис. 3.2. Наблюдаемый спектр обладает двумя полосами поглощения с максимумами на 330 и 510 нм, что хорошо согласуется со спектрами Тгр", приведенными в литературе [6,8,17,18]. В кислой среде основным каналом гибели состояния Si триптофана является протонирование индольного кольца через растворитель (раздел 1.1.2 и [8]). В присутствии ацетона единственным наблюдаемым интермедиатом триптофана (через 3 мкс после импульса лазера) является катион-радикал ТгрН +, спектр которого представлен открытыми кружками (О) на Рис. 3.2. Как и в случае спектра нейтрального радикала, спектр катион-радикала хорошо согласуется с ранее опубликованными данными [6,17,18]. Аналогичные эксперименты были выполнены для IH и Л АТгрН; полученные результаты качественно совпадают со спектрами, приведенными на Рис. 3.2 (данные для IH и NATrpH не приведены). Это наблюдение указывает на слабое влияние аминокислотной цепочки на спектральные свойства интермедиатов индола и триптофана, что также было отражено в работах [6,24,25].
Ультрабыстрая динамика гибели синглетных возбужденных состояний KN и 30HKN
Кинуренин и его производные, обнаруженные в хрусталике глаз приматов, являются природными метаболитами аминокислоты триптофан. Эти молекулы обладают полосой поглощения в диапазоне 300—400 нм и, согласно немногочисленным исследованиям, являются фотохимически инертными соединениями [90,106]. На основании этих фактов был сделан вывод, что кинуренины являются УФ фильтрами хрусталика глаза; однако на сегодняшний день механизм эффективной УФ защиты ткани хрусталика молекулами кинуренинов остается неизвестным. Между тем недавно было показано, что фотовозбужденный кинуренин может вступать в реакции с рядом биологически значимых соединений [108], что может давать вклад в развитие катаракты глаза. Таким образом, исследование фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекуле кинуренина после поглощения кванта света, является необходимым для понимания фото-индуцированных процессов, имеющих место в хрусталике глаза. Глава IV данной работы посвящена решению этой актуальной задачи. На Рис. 4.1 представлены оптические спектры поглощения и флуоресценции KN в различных растворителях при комнатной температуре. При переходе от апротонных к протонным растворителям наблюдается небольшой сдвиг полосы поглощения в синюю часть спектра и существенный сдвиг полосы флуоресценции в красную область спектра. Максимумы поглощения Я и эмиссии Я а х, коэффициенты экстинкции єтах в соответствующих максимумах поглощения Х" _ кинуренина и сдвиги Стокса представлены в Табл. 4.1. Первая полоса поглощения KN обусловлена внутримолекулярным переносом заряда с атома азота анилиновой группы, обладающего неподеленной парой электронов, на ароматическое кольцо KN. Относительно широкие сдвиги Стокса указывают на существенное изменение геометрии молекулы в возбужденном состоянии Si вследствие переноса электронной плотности с ароматического кольца на атом кислорода карбонильной группы, что является характерным для многих азотсодержащих гетероциклических и карбонильных органических соединений [149-151]. Увеличение величины сдвига Стокса с ростом протонности растворителя (Табл. 4.1) должно быть отнесено к участию водородных связей в стабилизации состояния Sj.
Исследование влияния кислотности/основности среды на оптический спектр поглощения KN показало, что основные изменения наблюдаются в диапазоне рН 0-3, тогда как при рН 4 существенных изменений в спектре не выявлено. На Рис. 4.2 представлены спектры поглощения водных растворов кинуренина при рН 0.5, 1.6 и 7.0; основные спектральные особенности нейтральной и протонированной форм кинуренина приведены в Табл. 4.2. Полученные данные хорошо согласуются с данными, опубликованными в работе Атертона и сотр. [107]. На вставке Рис. 4.2 приведена зависимость оптической плотности на длине волны 245 нм от значения рН для водного раствора 7.1х10"5 М кинуренина. Моделирование кривой титрования с использованием двух констант кислотно-основного равновесия (сплошная линия), рКаї = 1.2 и рКа2 = 2.4, приводит к лучшему согласию, чем моделирование с использованием одного значения (пунктирная линия), рКа = 1.5. Значение pKai = 1.2 было отнесено к анилиновой группе кинуренина (ArNH2), а значение рКа2 = 2.4 к карбоксильной группе (СООН). Величина рКа2 является типичной для СООН группы большинства аминокислот. Типичные значения рКа для различных производных анилина находятся в диапазоне 4-5 [152]. Однако в работе [ 152] приведено значение рКа = 2.04 для анилина замещенного карбоновой кислотой в opmo-положение. Таким образом, неожиданно низкое значение рКаї для анилинового фрагмента в кинуренине может быть обусловлено присутствием карбонильной группы в орто-положении, которая уменьшает основность анилиновой группы вследствие индукционных и резонансных эффектов. В работе Атертона и сотр. [107], выполненной в близких экспериментальных условиях, были сообщены следующие значения рКа кинуренина: 1.9, 5.1 и 8.5. Эти величины были отнесены к СООН группе, анилиновой и аминогруппе, соответственно. Однако наши эксперименты не обнаружили каких-либо спектральных изменений в окрестности рН 5.0. Авторы работы [107] также отмечали, что изменения в спектре поглощения в диапазоне рН от 1.0 до 3.5 намного существенней, чем изменения, наблюдаемые при более высоких значениях рН. Эти изменения следует отнести к протонированию анилиновой группы, которое приводит к перераспределению электронной плотности и делает невозможным перенос заряда с атома азота на ароматическое кольцо, что определяет положение первой полосы поглощения молекулы KN. Эволюция интенсивности флуоресценции KN во времени была измерена в воде (рН 6.6), бинарной смеси МеОН/вода 10/1 (по объему) и ДМСО на 10 равноотстоящих длинах волн от 420 до 580 нм на протяжении всего спектра эмиссии во временном диапазоне вплоть до 700 пс с переменным шагом временной развертки. На Рис. 4.3 представлены временные профили флуоресценции, зарегистрированные на синем крае, в максимуме и на красном крае спектра эмиссии KN. Быстрая гибель сигнала в синей области, и соответствующий быстрый рост в красной области спектра являются характерными особенностями динамики эмиссии, вызванными сольватационной релаксацией и представляющими собой сдвиг спектра в красную область, так называемый динамический сдвиг Стокса. Этот сдвиг можно явно видеть по эволюции спектра эмиссии во времени, представленной на Рис. 4.4. По завершении сольватационной динамики форма спектра эмиссии остается неизменной и совпадает со спектром стационарной эмиссии (толстая линия на Рис. 4.4).
Обработка полученных данных была проведена с помощью процедуры глобальной подборки параметров, используя свёртку суммы экспоненциальных функций и гауссовой функции, описывающей профиль импульса лазера (см. раздел 2.5). Хорошее согласие между экспериментальными и расчетными данными было получено при использовании трех экспонент для всех трех растворителей. Результаты расчетов, показанные на Рис. 4.3 в виде плавных линий, были получены при использовании временных констант т\, х-г и тз приведенных в Табл. 4.3 (с. 67). Последняя величина, гз, указывает на значительное замедление динамики флуоресценции при переходе от воды к бинарной смеси МеОН/вода и далее к ДМСО. На Рис. 4.5 представлены спектры амплитудных параметров, соответствующие трем временным константам, Аі(Х), Аг(А.) и Аз(А.), полученные в результате глобальной обработки данных. Положительные значения соответствуют гибели сигнала, а отрицательные — росту. Во всех трех растворителях спектры, относящиеся к самым быстрым компонентам, Ai( .) и Аг(А-), являются схожими по форме, указывая на гибель сигнала в синей области и рост сигнала в красной области полосы эмиссии. Таким образом, данные компоненты можно преимущественно отнести к динамическому сдвигу Стокса. Спектр амплитуды Аз(Х), связанный с наибольшей временной константой гз, практически совпадает со спектром стационарной эмиссии (тонкая серая линия). На этом основании можно сделать вывод, что временная константа гз соответствует гибели населенности возбужденных состояний или, иными словами, гз является временем жизни нижнего возбужденного состояния KN. По данным, приведенным в Табл. 4.3 (с. 67) можно видеть, что гз обладает наиболее ярко выраженной зависимостью от свойств растворителя: её значение увеличивается на два порядка по величине при переходе от воды к ДМСО. Значения констант т\ и г2 также возрастают, но в существенно меньшей степени. На Рис. 4.6.а приведены спектры промежуточного поглощения, зарегистрированные с различными временными задержками после облучения (к = 400 нм) водного раствора KN (рН 6.6). Сразу после возбуждения молекулы KN можно видеть полосу промежуточного поглощения с максимумом на 570 нм.
Двухфотонная ионизация KN и 30HKN
Первый электронный переход в молекуле KN характеризуется внутримолекулярным переносом заряда с атома азота на ароматическое кольцо, что приводит к существенным стоксовым сдвигам флуоресценции. Зависящие от времени стоксовые сдвиги, приведенные на Рис. 4.4 и 4.6, в основном отражают сольватационную динамику вокруг молекулы KN в состоянии Si. В водных растворах сольватационная релаксация протекает в две стадии [157,158]. Первая стадия соответствует инерционному движению - малому перемещению молекулы растворителя или её части в её собственном свободном объеме — и обладает характерным временем около 150 фс [157,158]. Вторая стадия связана с диффузионной переориентацией молекул растворителя и протекает за времена около 1 пс [157,158]. Поскольку аппаратная функция нашей экспериментальной установки составляет около 200 фс, то инерционное движение не может быть зарегистрировано, тогда как наблюдаемую константу Т\ = 0.9 пс можно уверенно отнести к диффузионному перемещению молекул воды. Значения т\, полученные для других растворителей и представленные в Табл. 4.3, удовлетворительно согласуются с величинами, сообщенными в других работах [157-159]. Вторая временная константа, гг, предположительно может быть связана с изменением геометрии KN в возбужденном состоянии. Было показано, что конформационная релаксация три-пептида вызывает замедление компонент динамического стоксового сдвига [160]. Необходимо отметить, что тг не проявляет явную зависимость от вязкости растворителя: значение гч в НгО ( ню = 0.890 сп при 25С) меньше, чем в менее вязком метаноле (т/меон = 0.544 сп при 25С), но оно является наибольшим в более вязком ДМСО (7дмсо = 1.987 сп при 25С). Поскольку водородные связи играют ключевую роль в дезактивации Si состояния KN, то для получения корректной зависимости тгігі) необходимо сравнение растворителей одинаковой протонности. Полученные результаты указывают на очень быструю гибель населенности Si состояния KN в результате безизлучательного перехода Si-»So. Константа скорости квг демонстрирует высокую чувствительность к природе растворителя: она увеличивается в 100 раз при переходе от апротонного к протонному растворителю.
Поскольку спектры промежуточного поглощения KN (Рис. 4.6) указывают на отсутствие поглощения от триплетных состояний или радикалов, то наблюдаемую быструю гибель состояния Si следует преимущественно отнести к быстрой внутренней конверсии (ВК). Замедление динамики гибели состояния Si в дейтерированной воде указывает на прямое участие водородных связей в ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний KN. Сильное влияние свойств локального окружения на скорость безизлучательного перехода Si— So было обнаружено для многих азотсодержащих гетероциклических и ароматических карбонильных соединений [112]. Например, было показано, что для орто-аминоацетофенола (ААР), который является близким к KN по структуре, ВК протекает очень быстро в неполярных растворителях и резко замедляется в полярных апротонных растворителях [132,133]. Это поведение было отнесено к «эффекту близости» (раздел 1.2.5) [113-116]. Однако этот эффект не может объяснить увеличение константы скорости ВК в протонных растворителях, что наблюдается в случае KN и ААР. Известно, что образование водородных связей приводит к увеличению энергии п,тг перехода и к уменьшению энергии 7г,л перехода [161], т.е. к увеличению энергетической щели П,7Е — 71,71 . Согласно модели «эффекта близости», это должно было бы приводить к замедлению ВК в протонных растворителях, что находится в противоречии с экспериментальными наблюдениями. Существенное ускорение ВК в молекуле 30HKN по сравнению с KN также опровергает гипотезу «эффекта близости», т.к. замещение водорода в ароматической системе на электрон-донорную группу приводит к увеличению энергетической щели n,7i -7t,7t [162]. И, наконец, наблюдаемая зависимость квантового выхода флуоресценции от температуры является слишком слабой, чтобы быть отнесенной к «эффекту близости». Для молекул хинолина и изохинолина в этаноле, в которых ВК протекает по механизму «эффекта близости», энергии активации находятся в диапазоне 1300-1900 см-1 (15.6-22.8 кДж/моль) [163-165]. Наиболее правдоподобным объяснением быстрой ВК в протонных растворителях является взаимодействие между молекулой K.N в состоянии Si и молекулами растворителя посредством межмолекулярных водородных связей. Возбуждение молекулы KN приводит к увеличению электронной плотности на атоме кислорода карбонильной группы. Это увеличивает кислотность аминогруппы и основность карбонильной группы, что, в свою очередь, приводит к более интенсивным взаимодействиям этих функциональных групп с молекулами растворителя посредством водородных связей. Как результат происходит образование комплекса из фотовозбужденного KN и молекул растворителя тесно связанного водородными связями. Непрерывный сдвиг полосы флуоресценции KN в красную область спектра при переходе о г апротонного к протонному растворителю указывает на участие межмолекулярных водородных связей в стабилизации состояния Si (Рис. 4.1). В образовавшемся комплексе валентные колебания водородных связей выступают в роли акцепторных мод для безизлучательного перехода Si—»So, и, таким образом, энергия электронного возбуждения переходит в энергию колебательного возбуждения через водородные связи.
Похожий механизм тушения флуоресценции в этаноле был предложен для аминоантрахинонов [118,119] и аминофлуоренов [120]. При переходе от этанола к воде способность растворителя образовывать водородную связь увеличивается, что индуцирует более сильные взаимодействия посредством межмолекулярных водородных связей и существенно ускоряет гибель состояния Si. Наблюдаемый изотопный эффект {k flk f = 1.5) является основным аргументом в пользу данного механизма. В предельном случае перераспределение электронной плотности в возбужденном KN может привести к ситуации, когда аминогруппа окажется более кислой, а карбонильная группа более основной, чем растворитель. В этом случае может иметь место межмолекулярный перенос протона, как это отражено на Схеме 4.1. Отсутствие сигнала от протонированного состояния Si в спектрах промежуточного поглощения не позволяет полностью отказаться от данного механизма, т.к. этот интермедиат может быстро гибнуть в процессе обратного переноса протона с образованием основного состояния KN. Завершая обсуждение возможных механизмов ультрабыстрого безизлучательного перехода Si—»So в молекуле KN, необходимо также упомянуть реакцию внутримолекулярного переноса протона в возбужденном состоянии (ВППВС). В самом деле, между амино и карбонильной группами KN возможно образование межмолекулярной водородной связи. Однако исследования реакции ВППВС в молекулах метилсалицилата [123] и диаминоантрахинона [124,125] показали, что времена жизни флуоресценции данных соединений не зависят от растворителя. Сильная зависимость времени жизни состояния Si от свойств растворителя, обнаруженная для KN, указывает на разрыв этой внутримолекулярной связи в протонных растворителях, что препятствует реакции ВППВС. Фотохимические свойства триплетного состояния KN были изучены при ацетон-сенсибилизированном фотолизе методом лазерного импульсного фотолиза с наносекундным временным разрешением. На Рис. 4.12 приведены спектры промежуточного поглощения, наблюдаемые при фотолизе (А, = 308 нм) 1x10"4 М кинуренина в смеси вода/ацетон в соотношении 10/1 (по объему) под аргоном. При данных концентрациях каждого хромофора, поглощение ацетона на 308 нм (єш = 0.4 М- см-1) на порядок выше, чем поглощение кинуренина (QOS - 870 М-1см-1 в нейтральном растворе и зо8 = 260 NT CM-1 В кислой среде).
