Введение к работе
Актуальность проблемы. Работа посвящена решению важной физиологической задачи - изучению механизмов действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) на процессы в ЦНС млекопитающих и человека. Кинурениновые метаболиты связаны с развитием ряда нейропатологий, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона и др. (Widner et al., 1999; Beal et al., 1999; Savvateeva-Popova et al., 2003). По КПОТ в организме млекопитающих и беспозвоночных метаболизируется около 90% триптофана (Лопатина и др., 2004). В литературе продукты КПОТ получили наименование «кинуренинов». С конца 80-х - начала 90-х годов большинство исследований кинуренинов было посвящено их нейродегенеративному эффекту. Нейрофизиологоческая активность кинуренинов установлена у многих животных: лягушек, мышей, крыс, кроликов, кошек, собак и др. (Лапин, 2004).
Особый интерес представляет изучение молекулярных механизмов активности кинуренинов у мутантов с генетически блокированными стадиями КПОТ. К их числу у насекомых относится дрозофила (D. melanogaster), пчела (A. mellifera) и др. У мутантов дрозофилы накопление тех или иных промежуточных метаболитов КПОТ оказывает модулирующее действие на уровень активности ЦНС, а также на процессы обучения и памяти (Savvateeva, 1991; Savvateeva et al., 2000; Savvateeva-Popova et al., 2003). Для мутантов vermilion (v) с блокированной первой ключевой стадией пути показано полное отсутствие продуктов КПОТ. У мутантов cinnabar (сп) с повышенным уровнем кинуреновой кислоты (KYNA) наблюдается улучшение ряда физиологических и поведенческих параметров (Savvateeva-Popova et al., 2003). Мутантам cardinal (cd) с повышенным уровнем 3-гидроксикинуренина (ЗНОК), напротив, свойственны функциональные нарушения в нервной системе, в том числе - прогрессивная потеря среднесрочной памяти при обучении методом условно-рефлекторного подавления ухаживания (УРПУ) (Savvateeva et al., 2000).
Механизмы нейрофизиологической активности кинуренинов весьма разнообразны и на настоящий момент исследованы в основном у млекопитающих. ЗНОК в клеточных культурах нейронов индуцирует процессы свободнорадикального окисления, вызывающие гибель клеток путем апоптоза (Okuda et al., 1998). KYNA является конкурентным антагонистом ионотропных рецепторов глутамата (iGluR), преимущественно стрихнин-нечувствительного глицинового сайта NR1-субъединицы NMDA-рецептора (Kessler et al.,
1989), и, возможно, а7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) (Hilmas et al., 2001). KYN проявляет свойства агониста NR1-субъединицы NMDA-рецептора (Stone, 1991). NMDA-рецепторы опосредованно через систему малых GTP-аз и ключевой фермент ремоделирования актина ЫМ-киназу 1 (LIMK1) активируют транскрипционный фактор CREB (Yang et al, 2004). CREB регулирует множество клеточных процессов и обеспечивает формирование договременной памяти у млекопитающих и дрозофилы (Yin et al., 1995). LIMK1 также опосредованно через кофилин-зависимую регуляцию полимеризации актина модулирует процессы синаптической пластичности, лежащие в основе процессов обучения (Savvateeva-Popova et al., 2002). Дисбаланс кинуренинов у мутантов дрозофилы коррелирует с уровнем LIMK1 в мозге имаго (Лопатина и др., 2007).
Влияние кинуренинов на нейрофизиологические и когнитивные процессы у пчелы и дрозофилы носит весьма сложный характер (Savvateeva et al., 1991, Лопатина и др., 2004). Неизученными остаются механизмы сходных нарушений долговременной памяти у 13-суточных имаго v, сп и cd (Никитина и др., неопубл. данные). Моделирование кинуренин-зависимых нейродегенеративных заболеваний на дрозофиле должно опираться на точные знания механизмов физиологической активности КПОТ. Это обусловливает необходимость исследования молекулярных процессов, опосредующих действие кинуренинов на ЦНС дрозофилы, с выяснением их сходств и отличий от аналогичных процессов у млекопитающих.
Цель работы. Целью диссертационной работы являлось изучение механизмов воздействия кинурениновых продуктов на процессы в ЦНС дрозофилы на уровне регуляции активности генов рецепторов, лиганд-рецепторных взаимодействий и активности компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов.
Конкретные задачи исследования:
Оценить различия транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц dnrl iGluR, da.7 и da.3 nAChR, а также гена dlimkl у взрослых самцов кинурениновых мутантов (v, сп, cd) в возрасте 5 суток и 13 суток методом ПНР в реальном времени.
Изучить влияние химической структуры лиганда и рецепторных аминокислотных остатков на специфичность формирования стэкинг-связи кинуреновой кислоты (KYNA) с субъединицами iGluR крысы и дрозофилы методами квантовохимических расчетов.
Исследовать возможность взаимодействия ксантуреновой (XAN) и антраниловой (АА)
кислот, кинуренина (KYN) и 3-гидроксикинуренина (ЗНОК) с субъединицами iGluR, а также взаимодействия KYNA с а7 nAChR млекопитающих и дрозофилы методом компьютерного докинга.
Изучить распределение pCREB в мозге 5 суточных имаго дикого типа и кинурениновых мутантов (сп, cd) методом лазерной конфокальной микроскопии до и после 5 часового обучения при условно-рефлекторном подавлении ухаживания.
Изучить распределение LIMK1 и р-кофилина в мозге 5 суточных самцов дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии.
Положения, выносимые на защиту:
KYNA и XAN способны взаимодействовать с iGluR дрозофилы в качестве антагонистов. Специфичность воздействия KYNA на рецепторные подтипы определяется, в том числе, свойствами ее стэкинг-связи с ароматическим остатком рецептора. Хроническое воздействие KYNA на ЦНС взрослых самцов дрозофилы вызывает компенсаторное увеличение транскрипционной активности dnrl. KYNA у дрозофилы является более специфичным антагонистом NR1 iGluR, чем а7 nAChR.
Сродство ЗНОК к NR1 в качестве агониста существенно ниже, чем у KYN. Хроническое воздействие ЗНОК на ЦНС взрослых самцов дрозофилы вызывает увеличение транскрипционной активности dnrl и da.7.
3. Локализация компонентов iGluR-зависимых внутриклеточных сигнальных
каскадов pCREB, LIMK1 и р-кофилина в мозге взрослых дрозофил - как дикого типа
Canton-S, так и мутантов КПОТ сп и cd - носит избирательный характер и связана с
различными структурно-функциональными подсистемами мозга.
Научная новизна работы. Впервые показано, что хроническое воздействие KYNA и ЗНОК вызывает у взрослых самцов сп и cd увеличение транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц dnrl iGluR и da.7 nAChR на временном интервале 5-13 суток.
Впервые осуществлена сравнительная оценка энергии и геометрических параметров стэкинг-связи в ароматических димерах, моделирующих взаимодействие KYNA с различными подтипами iGluR, с изучением механизмов специфичности связывания.
Впервые построены компьютерные модели лиганд-связывающих сайтов NR1, NR2 и GluRl iGluR, а также а7 nAChR дрозофилы. Впервые построены компьютерные модели
комплексов KYNA с субъединицами NR1, NR2, GluR iGluR и а7 nAChR крысы и дрозофилы.
Впервые исследовано распределение p(Ser )CREB в мозге имаго дрозофилы и выявлены pCREB-обогащенные нейрональные структуры. Впервые выявлена локализация LIMK1 в глиальных клетках мозга у взрослых самцов дрозофилы.
Теоретическая и практическая значимость. Изучение молекулярных механизмов действия кинуренинов на процессы в ЦНС мутантов дрозофилы - модельных объектов нейропатологических синдромов человека - важно для выяснения роли продуктов КПОТ в развитии ряда заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона. Также оно может способствовать раскрытию механизмов регуляции продуктами КПОТ процессов памяти и обучения, общих для всех высокоразвитых организмов. Изучение биофизических особенностей стэкинг-связи ароматических лигандов с рецепторами имеет как теоретическое, так и практическое значение для разработки лекарственных средств, воздействующих на определенные подтипы рецепторов.
Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены на: 9th International Danube Symposium & 1st International Congress on ADHD (Wuerzburg, 2007); Международной школе-конференции, поев. 100 летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (Санкт-Петербург, 2007); XVII WFN Word Congress on Parkinson diseases and related disorders (Amsterdam, 2007); Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); IX East European Conference "Simpler Nervous Systems". Saint-Petersburg, 2009; Международной конференции "Topical problems of biophotonics - 2009" (Нижний Новгород, 2009); Международной конференции "Topical problems of biophotonics - 2011" (Нижний Новгород, 2011); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011).
Вклад автора. Лично автором выполнена основная часть квантовохимических расчетов, построены компьютерные модели рецепторных субъединиц в комплексе с лигандами, осуществлена оценка экспрессии рецепторных субъединиц у кинурениновых мутантов методом ПЦР в реальном времени, осуществлен анализ распределения pCREB, LIMK1 и р-кофилина в мозге кинурениновых мутантов методом конфокальной микроскопии. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались
совместно с соавторами и научным руководителем.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка литературы. Работа изложена на 212 страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и иллюстрирована 32 рисунками. В списке литературы приведено 235 источников.
