Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Механизм действия вазопрессина на водную проницаемость осморегулиетщего эпи телия 9
1.1. Взаимодействие вазопрессина с рецептором и синтез ц-АМФ 10
1.2. Вазопрессин-стимулируемый синтез простаглацди-нов и их участие в развитии антидиуретической реакции 13
1.3. ц-АМФ -зависимые протеин киназы, участвующие в изменении водной проницаемости осморегулирующего эпителия 19
1.4. Вазопрессин-зависимое изменение цитоскелета клеток осморегулирующего эпителия 21
1.5. Агрегированные частицы. 23
1.6. Вазопрессин-зависимый экзоцитоз и эндоцитоз в мочевом пузыре жабы 31
1.7. АДГ-зависимое изменение внеклеточных гликоз -аминогликанов 34
1.8. Механизм водной проницаемости осморегулирующего эпителия 41
Глава II. Материалы и методы исследования 53
2.1. Препараты, используемые в работе 53
2.2. Методаческие приемы при исследовании действия АДГ (питуитрина П) и ц-АШ на активность гиал-уронат гидролаз в экспериментах in vivo 54
2.3. Методические приемы при исследовании действия АДГ (питуитрина П) и ц-АШ на активность и ло кализацию гиалуронат гидролаз в экспериментах in vitro 56
2.4. Аналитические методы 64
Глава III. Результаты собственных исследований 79
3.1. Влияние АДГ на активность гиалуронат гидролаз ткани почек крыс и кроликов 79
3.2. Действие АДГ и ц-А на активность гиалуронат гидролаз клеток сосочка почки 91
3.3. Влияние АДГ на локализацию гиалуронат гидролаз клеток сосочка почки 109
3.4. Влияние катионов и мочевины на активность гиалуронат гидролаз 122
Глава IV, Обсуждение результатов 134
Выводы 157
Список основной использованной литературы 160
- Вазопрессин-стимулируемый синтез простаглацди-нов и их участие в развитии антидиуретической реакции
- АДГ-зависимое изменение внеклеточных гликоз -аминогликанов
- Методические приемы при исследовании действия АДГ (питуитрина П) и ц-АШ на активность и ло кализацию гиалуронат гидролаз в экспериментах in vitro
- Действие АДГ и ц-А на активность гиалуронат гидролаз клеток сосочка почки
Введение к работе
Актуальность темы. Водно-солевой гомеостаз у млекопитающих поддерживается системой рефлекторных реакций, в резуль -тате которых основной эффектор - почка - обеспечивает задержку в организме или выведение необходимых количеств электролитов ж вода. Ведущая роль в регуляции водовыделительной функ -ции почек принадлежит гормону нейрогипофиза вазопрессину (или антидиуретическому гормону - АДГ), под влиянием которого происходит резкое увеличение водной проницаемости эпителия собирательных трубок.
В настоящее время существуют две точки зрения на меха -низм изменения гидравлической проницаемости эпителия собирательных трубок при действии гормональных стимулов, удовлетворительно объясняющие накопленные экспериментальные данные. Согласно первой, основным скорость-лимитирующим барьером эпителия является апикальная плазматическая мембрана формирующих его клеток. Предполагается, что движение воды через этот ба -рьер осуществляется через малые поры, обеспечивающие строгую молекулярную селективность. При действии гормона происходит значительное увеличение числа пор в апикальной мембране без изменения диаметра, а значит и способности пропускать молекулы большие, ЧЄМ МОЛекуЛЫ ВОДЫ (Handler, Qrloff, 1981; Dousa, 1981; De Sousa, Grosso, 1981; Hebert, Andreoli, 1982a).
Вторая гипотеза, впервые сформулированная А.Г. Гинецин -ским (1958, 1964), предполагает, что основным барьером, определяющим скорость осмотического тока воды через эпителий со -бирательных трубок, являются внеклеточные структуры, сформи -
рованные преимущественно гликозаминогликанами. Гормон-зависи-мое увеличение проницаемости обеспечивается в результате ферментативного разрушения полисахаридов барьерного слоя. Экспе-риментальное доказательство гипотезы базируется на системе данных, среди которых наиболее существенными являются следующие: при действии гормона происходит деструкция внеклеточных гликозаминогликанов (Гинецинский и др., 1958; Закс, Титова, 1959; Крестинская, 1964; Могard, 1967; Иванова, 1972); при антидиурезе в моче резко увеличивается активность тканевой гиалуроницазы - эцдогидролазы, способной расщеплять гиалуро -новую кислоту, основной компонент гликозаминогликанов почки (Гинецинский и др., 1954; Иванова, 1958а; Наточин, 1959; Thorn
et al., 1962; Rosenfeld et al., 1963); введение антител против гиалуронидазы блокирует развитие антидиуретической реак -ции, вызываемой гормоном (Law, Rowen, 1981); экзогенная ги -алуронидаза, введенная внутривенно или непосредственно в со -бирателыше трубки, вызывает развитие антидиуретической реакции (Гинецинский, Васильева, 1963; Иванова, Перехвальская, 1968).
Таким образом, есть все основания предполагать, что скорость реабсорбции воды определяется состоянием структур, примыкающих к собирательным трубкам и отделяющих их от других элементов концентрирующей системы, и поэтому представляется существенным дальнейшее изучение механизма регуляции внекле -точных протеогликанов. Очевидно, что более детальное молеку -лярное описание механизмов, лежащих в основе действия АДГ, требует изучения процессов обмена полисахаридов и в первую очередь ферментов, вовлеченных в этот обмен.
Целью настоящего исследования явилось изучение действия АДГ на уровень активности и тканевую локализацию ферментов катаболизма гиалуроновой кислоты.
Задачи исследования. Основные задачи данной работы заключались в следующем:
Исследовать уровень суммарной активности гиалуронат гидролаз в функционально различных зонах почки млекопитающих и состав ферментов, участвующих в катаболизме гиалуроновой кислоты.
Изучить действие АДГ иед4АМФ на суммарную активность ферментов, гидролизующих гиалуроновую кислоту, и на актив -ность отдельных гиалуронат гидролаз.
Исследовать внутри- и внеклеточное распределение гиалуронат гидролаз в суспензии интактных клеток сосочка почки и клеток, обработанных АДГ.
Проанализировать влияние некоторых компонентов вне -клеточной среда сосочка почки (ионов натрия, калия, кальция, магния и мочевины) на активность изучаемых ферментов.
Научная новизна. Впервые обнаружено, что максимальная активность гиалуронат гидролаз почки млекопитающих выявляется в зоне сосочка. Установлено, что АДГ стимулирует увеличение суммарной активности гиалуронат гидролаз как в ткани, так и в суспензии клеток сосочка почки. Этот эффект обусловлен главным образом повышением активности ^-глюкуронидазы. Действие гормона на активность ферментов почки, так же как и его действие на водную проницаемость осморегулирующего эпи -телия, опосредуется увеличением синтеза ц-АМФ, поскольку показано, что ц-АМФ оказывает действие на активность ферментов
катаболизма гиалуроновой кислоты в почке подобное действию АДГ. Впервые усановлено, что АДГ индуцирует секрецию экзо -гидролаз из клеток сосочка почки, тогда как гиалуроницаза, как в присутствии, так и в отсутствие гормона, практически полностью локализована на внешней поверхности мембраны клеток почки. В экспериментах in vitro было продемонстрировано, что концентрации ионов и мочевины в интеротициальнои среде в широком диапазоне физиологических состоянии почки допускают протекание ферментативных реакций, необходимых для исчерпы -вающего гидролиза гиалуроновой кислоты. Изменение степени гидратации животного, определяющей состав интеротициальнои жидкости сосочка почки, может выступать как дополнительный фактор, регулирующий активность внеклеточной гиалуроницазы.
На основании полученных данных предложена схема последовательности молекулярных этапов развития антидиуретичес -кой реакции.
Теоретическая и практическая значимость. Настоящее экспериментальное исследование развивает современное пред -ставление о молекулярных механизмах действия вазопрессина на водную проницаемость осморегулирующего эпителия. Данные о вовлеченности ферментов катаболизма гиалуроновой кислоты в осморегулиругощую функцию почки могут быть основой для разработки направленного воздействия на скорость реабсорбции вода в почке. Полученные результаты используются при чтении курса лекций по физиологии в НГУ и НГМИ.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на ІУ Всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевому обмену (Черновцы, 1974), на II Европейском коллок -
виуме по физиологии почки (Балатонфюред, Венгрия, 1977), на У Всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевому обмену (Ленинград, 1978), на 28 Международном конгрессе физиологических наук (Будапешт, Венгрия, 1980), на УІ Всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевому обмену (Новосибирск, 1981), на ІУ Европейском коллоквиуме по физиологии почки (Прага, ЧССР, 1982).
Объём работы. Материалы .диссертации изложены на 183 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка и 14 таблиц. Список основной использованной литературы составляет 206 источников, в том числе 162 иностранных.
, - 9 -
Вазопрессин-стимулируемый синтез простаглацди-нов и их участие в развитии антидиуретической реакции
Наряду с активацией аденилат циклазы вазопрессин в почке млекопитающих и в мочевом пузыре амфибий стимулирует синтез простаглаНДИНОВ /Grantham, Orloff, 1968; Handler, 1981 /. Простагландины оказывают сильное модулирующее действие на развитие антициуретической реакции. В этом направлении ведутся обширные исследования, однако следует отметить, что сделать окончательные вывода о механизме участия простагландинов в изменении гидравлической проницаемости осморегулиру-ющего эпителия в настоящее время достаточно затруднительно.
В ряде работ при анализе эффектов различных аналогов вазопрессина было показано, что для стимуляции синтеза простагландинов важно наличие у аналога прессорной активности, а не антидиуретической / Handler, 1981; Dunn, 1979; Zipser et al., 1981/. На основании этих данных можно предположить, что рецепторы вазопрессина, вовлеченные в активацию аденилат ци-клазы и в индукцию синтеза простагландинов, различны.
Фермент циклооксигеназа, осуществляющий синтез проста -гландинов из полиненасыщенных жирных кислот, был обнаружен методом непрямой иммунофлюоресценции в клетках, выстилающих собирательные трубки почки и мочевой пузырь жабы /Smith,Bell, 1978, Dunn, 1979; Handler, 1981 /. Основными продуктами синтеза, по крайней мере в клетках собирательных трубок мозго -вой зоны почки крысы, являлись БГЕ2 и ЛП- оі. /Dunn, Hood, 1977; Jackson et al., 1980 в /. Кроме того, гомогенати, полученные из мозговой и корковой зон почечной ткани крысы, способны синтезировать тромбоксан А2 и простациклин 12 /наз-sid, Dunn, 1980/. При инкубировании мочевого пузыря амфибий в присутствии вазопрессина обнаруживается кроме ПГЕ и ПИ- также тромбоксан В2 - продукт превращения тромбоксана А2 /Zusman et al., 1977; Burch et al., 1979 /. Вазопрессин-зависимый синтез простагландинов наблюдали также в культуре интерстициальных клеток медуллы /Zusman, Keiser,l977 а,б/. Во всех случаях скорость-лимитирующей стадией при действии вазопрессина является освобовдение арахидоновой кислоты /zusman et al., 1977; Zusman, Keiser, 1977 б/.
В настоящее время накоплен обширный экспериментальный материал, который позволяет утверждать, что вазопрессин-за-висимый уровень простагландинов влияет на проявление анти -диуретической функции гормона. Экзогенная арахидоновая кислота, предшественник простагландинов, подавляет гдцросмоти-ческое действие вазопрессина на осморегулирующий эпителий /Herman et al., 1980/.
Надпочечниковые стероидные гормоны, как глюкокортикои - 15 да, так и минералкортикоиды, повышают водную проницаемость мочевого пузыря жабы в ответ на вазопрессин/Handler et al., 1969/. Этот эффект слагается из подавления стероидными гормонами активности ц-АММВДЭ и ингибирования ацилгидролазы, фермента, обеспечивающего формирование эндогенного пула ара-хидоновой кислоты в результате гидролиза мембранных фосфоли-ПИДОВ /stoff et al., 1973; Zusman et al., 1978/. Гидросмо-тический ответ на действие аргинин-вазопрессина изолирован -ных кортикальных собирательных трубок, выделенных из почки адреналэктомированных кроликов, был значительно понижен. Добавление альдостерона или дексаметазона восстанавливало эф фект АДГ /Schwartz, Kokko, 1980 /.
Нестероидные противовоспалительные агенты, ингибирую -щие циклооксигеназу, и,таким образом,блокирующие синтез про-стагландинов, повышают проницаемость эпителия в ответ на АДГ /Bitо, Salvador, 1976} Handler, 198V. Экзогенный ПГЕ2 ИНГИ-бирует водную проницаемость в ответ на вазопрессин, но не влияет на водную проницаемость в ответ на экзогенный ц-АМФ в мочевых пузырях жаб и в изолированных собирательных трубках кролика /Orloff et al., 1965; Grantham, Orloff,1968/. В присутствии низких концентраций ПГЕ подавляется вазопрессин-стимулированное накопление ц-АМФ в эпителиальных клетках мочевого пузыря жабы и в срезах мозгового слоя почки /Omachi et al., 1974; Beck et al., 1971 /.
Эти данные позволили сделать вывод, что простагландины блокируют антидиуретическое действие вазопрессина, ингиби-руя гормон-зависимую аденилат циклазу, которая занимает промежуточное положение в гцдросмотическом ответе. Однако прямое измерение влияния простаглацдинов на активность аденилат циклазы дало неожиданные, на первый взгляд противоречащие такому выводу, результаты.
В мочевых пузырях жабы, так же как и во многих .других тканях, высокие концентрации ПГЕ2 стимулируют аденилат циклазу, повышая концентрацию ц-АШ в ткани и увеличивая ответ на теофиллин /Orloff et al., 1965; Grantham, Orloff, 1968; Ота -chi et al., 1974; Flores et al., 1975/. Герман и соавторы /Herman et al., 1980/, на фракциях мембран из различных зон почечной ткани крысы показали, что ПГЕ2 оказывает дозо-зависи-мое стимулирующее действие на аденилат циклазу как в отсутствие, так и в присутствии вазопрессина. В то же время пред -шественники ПГЕ2, арахидоновая кислота и эндопироксид 111, ингибируют аденилат циклазу конкурентно с ПГЕ2. Как повышение уровня ц-АШ в присутствии ПГЕ2» так и снижение в присутствии предшественников не является следствием изменения активности фосфодиэстеразы. Таким образом, аденилат циклаза почки млекопитающих и мочевых пузырей амфибий, подобно ферментам в других тканях, активируется простагландинами, по крайней мере группы Е.
Отмеченные противоречия в результатах можно предвари -тельно объяснить на основании данных, полученных Эдвардсом и соавторами /Edwards et al., 1981/ на изолированных собира -тельных трубках крысы. На разрушенных собирательных трубках авторами показано, что ПГЕ2 при концентрации ІСГ6 М не влиял на активность аденилат циклазы, а при концентрации 10 М стимулировал её активность на 335%. В то же время в интакт-ных собирательных трубках ПГЕ2 при концентрации 10 М не -значительно увеличивал базальную концентрацию ц-АМФ и подавлял вазопрессин-стимулируемое накопление ц-АМФ. Следует от - 17 метить, что Ш22 в исследуемых концентрациях не оказывал влияния на ц-АШ-ФДЭ в собирательных трубках.
АДГ-зависимое изменение внеклеточных гликоз -аминогликанов
Наряду со значительными морфологическими изменениями, которые вызывает АДГ в эпителиальных клетках собирательных трубок почки млекопитающих или коже и мочевых пузырях амфибий, имеются отчетливые морфологические изменения во вне -клеточном пространстве почек млекопитающих. А именно, вазо - 35 прессин вызывает деструкцию гликозаминогликанов /ГАГ/, осо -бенно ярко выраженную в базальной мембране, межклеточных пространствах эпителия собирательных трубок и интерстиции сосочка почки, что дало основание А.Г. Гинецинскому сформу -лировать гипотезу об участии этих соединений в механизме действия АДГ /Гинецинский и др., 1958:; Ginetzinsky, 1958; Закс, Титова, 1959; Крестинская, I964;Morard, 1967; Иванова, 1972 /.
ГАГ в почке млекопитающих распределены неравномерно. В корковой зоне эти структуры практически отсутствуют, в этой области их удается выявить только в клубочках. Основное скопление ГАГ локализуется во внутренней зоне мозгового вещества и в сосочке почки. Здесь они входят в состав базальних мембран собирательных трубок, выявляются в межклеточных промежутках эпителия и в прослойке интерстициальной ткани. Менее ясна полисахаридная организация гликокаликса апикальной мембраны клеток собирательных трубок. Известно, что полиса -харидная выстилка большинства эпителиальных клеток сформирована нейтральными протеогликанами /spicer et el., 1981 /. Однако, по данным Сато и Спщера /Sato, Spicer, 1982 /, у морской свинки гликокаликс апикальной мембраны основных клеток /преобладающий тип эпителиальных клеток в собирательной трубке/ состоит из кислых полисахаридов, чувствительных к гиалуронидазе. Хотя не исключена возможность, что состав ГАГ в гликокаликсе основных клеток собирательных трубок у данного животного является их видовой особенностью, тем не менее можно допустить, что ГАГ участвуют в формировании люминаль -ной поверхности собирательных трубок почек всех млекопитающих.
В организме млекопитающих ГАГ представлены рядом суль -датированных полисахаридов /хоцдроитинсульфаты, гепарансуль-фаты, дерматансульфаты, гепарин/ и гиалуроновой кислотой. Результаты определения фракционного состава ГАГ в почечной ткани,по данным разных авторов, существенно отличаются. Ди-кер и Франклин /Dicker, Franklin, 1966/ обнаружили, что гиалуроновая кислота и хондроитинсульфаты являются основными полисахаридами и представлены в равных соотношениях. По данным Кастора и соавторов /castor et al., 1968/ преобладающим полисахаридом в мозговой зоне почки является гиалуроновая кислота /около 70$/. Аналогичные данные были получены Никифоровской /1971/. Иное соотношение между фракциями ГАГ получили Барри и Боунес / Barry, Bowness, 1975/. По их мнению преобладающими и в кортикальной и в мозговой тканях являются хоцдроитинсульфаты, содержание гиалуроновой кислоты в коре составляет 17$, а в медулле - 22$. Невзирая на сущест -венные расхождения результатов, полученных разными авторами, можно отметить характерную особенность организации ГАГ по -чечной ткани - высокое содержание гиалуроновой кислоты. Для сравнения, в ткани хряща гиалуроновая кислота составляет только 1$ от всех ГАГ /Мецлер, 1980 /.
Гиалуроновая кислота внеклеточного пространства почки входит в состав протеогликанов. Однако точная молекулярная архитектура этих протеогликанов, в отличие от формирующих хрящевую ткань, . неизвестна.Протеогликаны синтезируются внутри клеток и секретируются в готовом виде в межклеточное пространство. Как показано в работе Сато и Спицера /Sato, Spicer, 1982 /, в основных клетках собирательной трубки морской свинки обнаружены ГАГ в аппарате Гольджи и в гранулах, расположенных в цитоплазме. Таким образом, можно предполо -жить, что по крайней мере основные клетки осуществляют синтез и секрецию почечных кислых полисахаридов. Авторы наблюдали секрецию глюкоконъюгатов как на базолатеральную, так и на апикальную поверхность клеток.
Следует отметить, что скорость обмена ГАГ в почке очень высока. По данным Барри и Боунеса /Barry, Bowness, 1975 / время полужизни ( Tj/2 ) сульфатированных полисахаридов равняется двум .дням, а для гиалуроновой кислоты эта величина оказывается меньше 18 часов. В то же время не обнаружено ни одной другой ткани, в которой время полужизни гиалуроновой кислоты было бы меньше 24 часов. Таким образом, ясно, что ГАГ почки, и в особенности гиалуроновая кислота, участвуют в :: ../ весьма активных метаболических процессах, что согласуется с приведенными выше данными о существенном изменении концентрации полисахаридов в ходе гормон-зависимых изменений концентрирующей способности почки.
Как уже сказано в начале раздела, существует корреляция между действием вазопрессина на почку и состоянием ГАГ во внеклеточном пространстве собирательных трубок. Гинецинский предположил /1964/, что гормон-зависимые изменения, затрагивающие ГАГ,лежат в основе молекулярных процессов, определяющих изменение проницаемости канальцевого эпителия для вода. По мнению Гинецинского осмотический ток вода в почке осуществляется не через клетки, а через межклеточное пространство и, следовательно, ферментативный гидролиз полисахаридногох материала этой зоны должен существенно повышать величину водного потока.
Методические приемы при исследовании действия АДГ (питуитрина П) и ц-АШ на активность и ло кализацию гиалуронат гидролаз в экспериментах in vitro
Для получения клеток выделяли сосочки почек крыс линии Вистар,как это описано в разделе 2.4.1. В каждый эксперимент объединяли сосочки от 20 до 40 животных. Ткань помещали в культуральнуго среду "Игла", тщательно измельчали бритвой и переносили на капроновый фильтр с размером пор 400 микрон. Кусочки ткани продавливали через фильтр стеклянной лопаточкой. Полученную клеточную суспензию осаждали центрифугированием в течение 5 минут на центрифуге К-23 при I тыс. об/мин при ОС. Осадок ресуспендировали в свежей среде "Игла", и клетки переосаждали до тех пор, пока супернатант не оказывался свободным от белка /обычно 3-4 переосаждения/. Окончательный осадок клеток взвешивали в пробирке с известным весом. Среду предварительно тщательно сливали и капельки раствора на стенках пробирки удаляли фильтровальной бумагой. Таким образом определяли вес влажной клеточной массы. К клеточному осадку /примерно 0,5 г/ добавляли свежую среду "Игла" до конечного объема 2 мл. Разработанная процедура выделения клеток приводит к получению как отдельных клеток, так и клеточных агрегатов размером до 200 микрон /рис. I/.
Используемый метод не позволяет полностью расчленить ткань на отдельные клетки. Это связано, по-видимому, с тем, что в данном методе разделение клеток достигалось только в результате механического разрыва межклеточных взаимодействий. Обычно используемые для получения изолированных клеток процедуры, включающие обработку ткани различными гидролитическими ферментами /гиалуронидазой, коллагеназой, трипсином и т.д./ и добав-ление комплексонов для связывания ионов Са /erescottn b /, мы были вынуждены исключить. Для поставленной в работе цели использование ферментов недопустимо, поскольку необходимо было получить клетки, сохранившие в неповрежденном состоянии белки и полисахариды внешней поверхности плазматической мембраны. Мы были вынуждены также отказаться от использования комплексонов, так как оказалось, что прединкубация в течение 10 минут при 20С кусочков ткани в среде "Игла" в присутствии ЭДТА в кон-центрации ТО М перед получением клеток приводит к резкому снижению активности гиалуроницазы, выцеленной из полученных об - 59 разцов клеток /табл. I/. Оказалось, что удельная активность гиалуронидазы была не более I нмол/мин освобождаемого и -ацетил--Д-глюкозамина на I г ткани против 5-7 нмол/мин при выделении клеток без ЭДТА. Очевидно,что при этом определяется только та часть полной тканевой активности гиалуронидазы, которая прочно связана с клетками. Потеря гиалуронидазной активности при выделении клеток в присутствии ЭДТА не связана с ингибирущим действием комплексона на активность фермента. Такое заключение основано на следующем эксперименте: из сосочков почек выделяли суммарную ферментативную фракцию методом гомогенизации, использование которого позволяет определить полную тканевую активность, в присутствии ЭДТА и в отсутствие ЭДТА. Оказалось, что в присутствии комплексона определяемая активность гиалуронидазы была даже несколько выше, чем в отсутствие этого препарата /табл. I/. Таким образом, можно сделать вывод, что при выделении клеток в присутствии ЭДТА происходит потеря существенной части гиалуронидазной активности.
Для анализа освобождения ферментов из изолированных клеток использовали два экспериментальных подхода: прямое определение активности соответствующих ферментов в среде инкубирования клеток и определение доли ферментов, чувствительных к действию экзогенного трипсина.
В первом методе изолированные клетки, полученные из сосочков почек крыс,суспендировали в среде "Игла" /250 мг клеток на I мл среды/ и инкубировали в течение 10 минут при 37С. Эта процедура проводилась для освобождения ферментов из частично разрушенных клеток. После инкубации клетки осаждали центрифугированием в течение 5 минут на центрифуге К-23 при I тыс. об/мин при 0С. Затем клетки ещё .два-три раза промывали средой "Игла". Оптическое поглощение последнего суперна -танта не превышало 0,8 о.е. при длине волны 280 нм. Клетки окончательно ресуспендировали в I мл свежей среды. В опытные образцы добавляли питуитрин П в концентрации 25 мЕ на мл пробы, инкубировали 30 минут при 37С. Затем пробы охлаждали в ледяной бане и осаждали центрифугированием в течение 5 минут на центрифуге К-23 при I тыс. об/мин при 0С. Суммарную фер -ментативную фракцию из супернатанта и клеток выделяли следующим образом.
Действие АДГ и ц-А на активность гиалуронат гидролаз клеток сосочка почки
Изложенные в предыдущем разделе результаты допускают два объяснения механизма действия АДГ и ц-АШ на активацию гиалуронат гидролаз. Можно предположить, что гормон /или ц-АШ/ не -посредственно действует на метаболизм клеток сосочка почки млекопитающих, индуцируя активацию изучаемых ферментов. Второе возможное объяснение основывается на предположении, что изме -нение состава внеклеточной среда, происходящее при антидиуре -тической реакции, увеличивает активность ферментов. Проведение экспериментов на изолированных клетках почки позволяет исключить эффекты, связанные с изменением внеклеточной среда, и от -крывает возможность установить влияние АДГ и ц-А№ непосредственно на клеточный метаболизм. В связи с этим были проведены исследования на изолированных клетках сосочковой зоны почки крыс и кроликов.
Прежде всего был разработан метод получения клеток из этой ткани. Традиционно используемые метода разделения ткани на клетки, включающие обработку материала гидролитическими ферментами и комплексонами на .двувалентные катионы, были иск -лючены, так как необходимо было сохранить в максимально непо -врежденном состоянии наружную поверхность плазматической мембраны клеток. Эти требования диктовались тем, что на этой по -верхности расположены рецепторы АДГ и протеогликаны - потенциальные субстраты изучаемых ферментов. Полученный препарат клеток содержал наряду с отдельными клетками кусочки не .диспергированной ткани размером до 200 мкм, т.е. содержащие не более 10 клеток /рис. I/. Для проведения экспериментов не принципиально, чтобы препарат состоял из отдельных клеток, но важно, чтобы скорость диффузии гормона к рецепторам на поверхности клеток была достаточно высока и не лимитировала АДГ-зависимую реакцию. Нетрудно показать, что скорость диффузии гормона в получаемые нами агрегаты клеток достаточно велика. Считая коэффициент диффузии для вазопрессина порядка 10 cwr/сек, можно оценить характерное время диффузии гормона по формуле /Ко -тык, Яначек, 1980/
Следовательно,время диффузии в такие клеточные агрегаты мало и не может лшлитировать развитие клеточной реакции на гормон.
Прежде всего необходимо отметить два свойства полученного препарата клеток сосочка почки. Во-первых, прединкубация кусочков ткани при комнатной температуре в течение 10 минут в при -сутствии ЭДТА приводит к существенному снижению удельной активности гиалуроницазы в клетках /в 5-7 раз/. Это снижение актив -ности фермента не связано с ингибирующим действием ЭДТА /табл.1/. Трудно предположить, что в ходе выделения клеток в присутствии комплексона происходит спонтанная .диффузия фермента через плазматическую мембрану. Кажется более вероятным, что гиалуроницаза в значительной степени связана с внешней поверхностью клеток и этот комплекс формируется с участием двухвалентных катионов. Выделение клеток в присутствии ЭДТА может приводить в этом случае к "отмывке" фермента.
Второе неожиданное свойство полученного препарата клеток заключается в следующем. Инкубация изолированных клеток в среде "Игла" при 37С в течение 10 минут приводит к увеличению как суммарной активности гиалуронат гидролаз, так и активности от -дельных составляющих ферментов /гиалуроницазы, -глюкуроницазы, N-ацетил-yi-Д-гексозаминидазы/. Более того, происходит увеличе - 94 ние активности и ряда других лизосомальных ферментов, не свя -занных с катаболизмом гиалуроновой кислоты. Кинетики соответ -ствующих ферментативных реакций приведены на рис. II, а вели -чины начальных скоростей реакций сведены в табл. 7. В доступной нам литературе мы не встречали описания подобного явления, механизм этого процесса нуждается в самостоятельном исследовании.
