Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Пластичность соматических стволовых
клеток 12
1.2. Стволовая клетка тонкого кишечника и ее основные
свойства 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ 46
3.1. Гистологический и генетический анализ колоний,
образованных в селезенке летально облученных мышей, после
трансплантации клеток кишечника 46
3.2.Изучение влияния гуморальных факторов клеток
эмбриональной печени (КЭП) на колониеобразующую
активность клеток кишечника и клеток костного
мозга 52
3.2.1. Изучение влияния кондиционных сред (КС) от КЭП на
способность клеток кишечника к колониеобразованию в селезенке
летально облученных мышей 52
3.2.2. Изучение влияния КС от КЭП, культивированных с разными
растворимыми медиаторами, на колониеобразующую активность клеток
кишечника 55
3.3. Изучение распределения клеток тонкого кишечника
в организме летально облученного реципиента после
трансплантации 60
3.4. Изучение способности клеток эпителиального слоя
тонкого кишечника к восстановлению гемо- и иммунопоэза у
летально облученных мышей 62
Изучение восстановления численной популяции клеточных элементов периферической крови у облученных реципиентов после трансплантации клеток кишечника 65
Изучение влияния трансплантации клеток кишечника на показатели иммунного ответа у летально облученных реципиентов 69
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ 73
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
АОК - антителообразующая клетка БОЕ-Э - бурстообразующая единица эритроидная ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный
колониестимулирующий фактор ИЛ - ингерлейкин ИФН - интерферон КОЕс-9 - колониеобразующая единица, формирующая
колонии в селезенке на 9-е сутки. КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная КонА - конканавалин А КС - кондиционная среда КЭП - клетки эмбриональной печени ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота СКК - стволовая кроветворная клетка ТФР - трансформирующий фактор роста ФНО - фактор некроза опухоли ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка ЭПО - эритропоэтин ЭБ - эритроциты барана
Введение к работе
В настоящее время одним из перспективных направлений в области биологии и медицины является изучение соматических стволовых клеток [4]. Новый взрыв интереса к стволовым клеткам особенно сильно проявился в последние годы в связи с накопившимися данными о том, что стволовые клетки взрослого организма в определенных условиях способны дать начало целому спектру клеточных типов независимо от того, из какого зародышевого слоя они происходят [50]. Наиболее часто это явление описывается как «пластичность» стволовых клеток [50, 13]. Изучение потенциала пластичности соматических стволовых клеток открывает новые возможности в заместительной клеточной терапии многих заболеваний, в том числе кроветворной и иммунной систем [4].
Существует ряд работ, в которых продемонстрировано свойство пластичности уже для многих стволовых клеток взрослого организма. С помощью культуральных методов in vitro была показана способность стволовых клеток костного мозга [85, 86], клеток кожи [175, 176], мышечной ткани [86, 33, 145], головного мозга [86], тонкого кишечника [188] дать начало тканям различных зародышевых слоев. Изучение пластичности in vivo в большинстве исследований основано на трансплантации клеток, меченных зеленым флюоресцирующим белком или Р-галактозидазой, или клеток, отличающихся по половым хромосомам (например, клетки самцов, содержащие Y-хромосому, трансплантируются самкам) [180]. Так, экспрессия маркеров, присущих донорским клеткам костного мозга, была выявлена в негемопоэтических клетках кожи, эпителия легкого [101, 173], эпителия тонкого кишечника [101, 152] эпителия почки [89], паренхимы печени [101, 105, 137, 172, 179, 184], поджелудочной железы [78] скелетной мускулатуры [29, 32,
42, 49, 54, 66, 104], эндотелия [62, 82], миокарда [82] и нейронах центральной нервной системы [30, 123, 143, 185, 186]. Также существует ряд работ, в которых показано, что стволовые клетки негемопоэтических тканей способны обладать гемопоэтическиы потенциалом. Это заключение основано на способности стволовых клеток центральной нервной системы [25], клеток мышечной і кани [83] или мышечных SP клеток [66], клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани [44], клеток сосочкового слоя дермы [106] восстанавливать различные линии клеток периферической крови у летально облученных мышей.
Уникальную модель для изучения соматических стволовых клеток представляет собой эпителий тонкого кишечника, поскольку, являясь одной из наиболее быстролролиферирующих тканей организма, содержит большой пул стволовых клеток и клеток- предшественников, обеспечивающих адекватную регенерацию ткани (в англоязычной литературе применительно к эпителию употребляется понятие «turnover)) [141, 142]. Стволовым клеткам кишечника также присуще свойство пластичности, демонстрируемое в ряде работ последних лет [76, 188]. Известно, что клетки тонкого кишечника in vivo в организме летально облученных мышей могут дифференцироваться в клетки кожи [76], а также трансдифференцироваться in vitro в клетки, содержащие маркеры нервной, печеночной и поджелудочной ткани [188].
Учитывая филогенетическую роль кишечника в процессах кроветворения [11], а также продемонстрированную способность ряда стволовых клеток к дифференцировке в клеточные элементы других тканей, можно предположить, что стволовые клетки тонкого кишечника также при определенных условиях смогут демонстрировать и гемопоэтический потенциал. В исследованиях, проведенных ранее в
нашей лаборатории В.В.Темчурой, была показана способность клеток кишечника к образованию колоний в селезенке (КОЕс-8) летально облученных мышей-реципиентов на 8 день [10]. Однако генетическое и гистологическое подтверждение этих результатов проведено не было. В этой связи нам представлялось важным продолжить изучение колониеобразующей активности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника, провести гистологический и генетический анализ колоний, образованных в селезенке летально облученных мышей после трансплантации клеток кишечника, изучить возможность влияния гуморальных факторов на колониеобразующую активность клегок эпителиального слоя тонкого кишечника.
Исходя их того, что в литературе отсутствуют данные, описывающие гемопоэтический потенциал клеток эпителиального слоя эпшелия тонкого кишечника, их способность восстанавливать функциональную активность клеток иммунной системы, нам представлялось актуальным изучить данный аспект биологии клеток. В частности: изучить способность клеток кишечника восстанавливать численную популяцию клеточных элементов периферической крови, а также изучить возможность восстановления показателей гуморального и клеточного иммунного ответа у летально облученных мышей после трансплантации клеток эпителия тонкого кишечника.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель данной работы - изучить гемо- и иммунопоэз-восстанавливающую активность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученных мышей.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Изучить с помощью гистологических и генетических методов способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний (КОЕс-9) в селезенке летально облученных мышей.
Исследовать возможность влияния на колониеобразующую активность клеток тонкого кишечника кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП), культивируемых с добавлением и без добавления различных ростовых факторов.
Изучить наличие донорских клеток эпителия тонкого кишечника в различных тканях летально облученного реципиента через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации.
Изучить способность клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению кроветворения.
Изучить способность клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению функций клеток иммунной системы.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые с помощью генетических и гистологических методов было доказано, что клетки эпителиального слоя тонкого кишечника способны к образованию в селезенке летально облученных мышей-реципиентов гемопоэтических колоний (КОЕс-9), которые представляют собой клон донорских клеток.
В работе продемонстрировано, что на способность клеток тонкого кишечника к образованию КОЕс-9 оказывают влияние кондиционные среды от клеток эмбриональной печени, полученные в период активного гистогенеза кроветворной ткани.
Впервые показано, что у летально облученного реципиента через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника происходит восстановление численной популяции клеточных элементов периферической крови. Более того, клетки эпителия тонкого кишечника обладают способностью восстанавливать и функциональную активность клеток иммунной системы. Полноценное проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа и IgM антителообразование у летально облученных мышей наблюдается через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника. Нами также было впервые продемонстрировано, что донорские клетки эпителиального слоя тонкого кишечника, экспрессирующие маркер Y-хромосомы ген sry, длительное время персистируют в организме самок-реципиентов и обнаруживаются в различных тканях через 2,4 и 6 месяцев после трансплантации.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Полученные результаты расширяют представление о гемопоэтическом потенциале клеток эпителия тонкого кишечника мыши, вносят существенный вклад в понимание явления «пластичности» соматических стволовых клеток, демонстрируют возможность влияния гуморальных факторов на способность клеток тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний, формируют представление о гемо- и иммунопоэз-восстанавливающей активности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученных мышей.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Клетки эпителиального слоя тонкого кишечника мыши характеризуются способностью образовывать гемопоэтические колонии (КОЕс-9), восстанавливать кроветворение и функциональную активность клеток иммунной системы у летально облученных мышей.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005 г.);
Семинарах группы лаборатории молекулярной иммунологии ГУНИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2005, 2006).
3. Российско-американской конференции «Биотехнология и
онкология» (Санкт-Петербург, 2005 г.);
4. 7-й отчетной сессии ГУНИИКИ СО РАМН. (Новосибирск
2006 г.);
5. Симпозиуме «Клуб профессиональных иммунолога»
(Анталия, Турция, 2006 г.)
6. Семинаре научного отдела ГУ НИИКИ СО РАМН
(Новосибирск, 2006 г.).
САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЫ.
Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИКИ СО РАМН г. Новосибирска.
Большую признательность автор выражает научному руководителю работы д.м.н, профессору СВ. Сенникову за подробное обсуждение полученных результатов, а также сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии и лично В.В. Осипову за взаимопонимание и содействие в ходе выполнения работы.
