Содержание к диссертации
Введение 5
Глава 1. Система комплемента человека
(обзор литературы) 7
Введение 7
Белковые компоненты системы комплемента человека 9
Небелковые регуляторы системы комплемента 14
Полиморфизм компонентов системы комплемента 16
1.4.1. Функционирование и полиморфизм С4 17
1.5. Дефициты компонентов системы комплемента, влияющих на
образование и функционирование СЗ-конвертазы и заболевания человека 23
1.6. Инициация активации и функционирование системы комплемента 25
Иммуноглобулин-зависимая инициация активации системы комплемента 26
Иммуноглобулин-независимая инициация активации системы комплемента 28
1.7. Сборка фрагментированных и целых компонентов системы комплемента
в комплексы 29
1.7.1. Сборка СЗ- и С5-конвертаз 30
1.8. Взаимодействие микробных и вирусных компонентов
с системой комплемента 32
1.8.1. Липополисахариды и липоолигосахариды, взаимодействующие
с системой комплемента 33
1.8.2. Взаимодействие капсулярных полисахаридов бактерий и грибов
с системой комплемента 34
1.8.3. Взаимодействие белков наружной мембраны бактерий
и оболочки вирусов с системой комплемента 34
Взаимодействие пептидогликанов с системой комплемента 35
Прочие микробные модуляторы системы комплемента 35
1.9. Сходство и особенности компонента С4 комплемента млекопитающих 36
1.10. Функциональный анализ компонента С4 и его изотипов
системы комплемента человека 37
1.11. Заключение 43
Собственные результаты 45
Глава 2. Материалы, приборы, реактивы, методы .' 45
2.1. Материалы 45
2.2. Приборы 45
Реактивы 46
Методы 53
2.4.1. Определение изотипов С4А и С4В варинтами ИФА в микропанели 53
Особенности определения С4А и С4В в микропанели новыми методами 58
Определение функциональной активности С4А в микропанели
новым вариантом ИФА 59
2.4.1.3. Определение функциональной активности С4В в микропанели
новым вариантом ИФА 60
2.4.2. Определение изотипов С4А и С4В новыми вариантами ИФА
на блоте (ХЛА). Экспериментальное обоснование 63
2.4.2.1. Десиалирование сывороток 65
2.4.2.2. Визуальный и количественный анализ изотипов С4А и С4В
в десиалированных сыворотках 77
Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле : 83
Электро- и иммуноблотинг 90
Анализ хемилюминесценции С4А и С4В 97
Итоговые варианты ХЛА изотипов С4А и С4В сыворотки человека....'. 101
2.4.3. Флуоресцентное определение белка на блоте 102
2.5. Прочие методы 104
Глава 3. Основные результаты и их обсуждение 106
3.1. Разработка новых вариантов ИФА изотипов С4А и С4В сыворотки человека 106
Разработка новых количественных микропанельных вариантов ИФА функционально активных С4А и С4В 106
Разработка новых вариантов микропанельного ИФА ингибирования
изотипов С4А и С4В человека антигенами 109
3.1.3. Разработка новых вариантов ХЛА для прямого визуального
количественного иммунохимического определения С4А и С4В 111
3.2. Определение дефицитов изотипов С4А и С4В разработанными вариантами
микропанельного ИФА и ХЛА в сыворотках пациентов и здоровых доноров 120
Исследование дефицитов С4А и С4В в сыворотках пациентов 120
Исследование дефицитов С4А и С4В в сыворотках беременных 123
3.3. Дефициты С4А и С4В при антибактериальном
и антитоксическом противодифтерийном иммунитете 125
Заключение 130
Выводы 131
Литература 131
Список сокращений 157
Введение к работе
Одним из направленийпрофилактической медицины является создание единообразных тест-систем для клинических обследований гуморального статуса человека, в том числе на основе иммуноферментного анализа (ИФА) [3]. В последние годы все больше возрастает интерес исследователей к определению статуса системы комплемента (СК) в организме человека, особенно ключевых компонентов СК. В группе молекулярной иммунологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского разрабатываются иммунофер-ментные методы определения функциональной активности компонентов и факторов СК [26,30].
Настоящая диссертационная работа связана с разработкой и применением ИФА изоти-пов С4А и С4В компонента С4 комплемента сыворотки человека. Ключевая роль компонента С4 состоит в том, что он участвует в самом начале каскада ферментативных реакций, осуществляемых СК после инициации классического пути (КСК), когда активацией С4 начинается формирование СЗ-конвертазы (С4Ь2а).
Определение белков СК в микропанельных вариантах обычно основаны на определении содержания компонентов СК как антигенов. Однако, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует каскадное развитие патологического процесса.
Таким образом, разработка надежных и высокочувствительных методов установления статуса изотипов компонента С4 является актуальной задачей. Новые методы улучшат диагностику, прогноз и мониторинг аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека.
В связи с вышесказанным была поставлена цель исследования - разработка вариантов ИФА функциональной активности изотипов С4А и С4В, а также их количеств после изоэлектрофоретического разделения изотипов и применение разработанных методов в исследовании С4-изотипического статуса сывороток в норме и патологии.
Для выполнения цели были поставлены следующие задачи исследования:
разработать, варианты ИФА функциональной активности С4А и С4В в микропанели; на их основе разработать микропанельные варианты ИФА для определения констант ингибирования акцепторами функционально активных С4А или С4В;
разработать варианты ИФА, включающие изоэлектрофокусирование сывороток в полиакриламидном геле, электроблотинг, иммуноблотинг и хемилюминесценцию пероксидазной реакции в режиме живого изображения, для визуального определения С4А и С4В;
апробировать разработанные варианты ИФА на сыворотках больных с дефицитами С4А и С4В;
с помощью разработанных вариантов ИФА исследовать дефициты С4А и С4В в сыворотках крови людей, в том числе с нарушениями беременности и при иммунном ответе на Corynebacterium diphtheriae..
Научная новизна:
разработаны высокочувствительные варианты ИФА функциональной активности изотипов С4А и С4В компонента С4 комплемента человека в микропанели и количественного хемилюминесцентного анализа изотипов С4А и С4В, позволяющие определять любые варианты дефицитов изотипов С4 в сыворотке, а также выявлять индивидуальные сывороточные особенности изотипов С4А и С4В;
разработан высокочувствительный метод микропанельного ИФА ингибирования функциональной активности индивидуальных изотипов С4А и С4В сыворотки человека бактериальными антигенами;
исследование наличия дефицитов изотипов компонента С4 .комплемента может быть использовано в диагностике течения гестационного процесса и выделения групп повышенного риска женщин в невынашивании беременности, особенно по типу неразвивающейся беременности;
наличие дефицитов С4В в сыворотке крови может приводить к снижению уровня антибактериального иммунного ответа против Corynebacterium diphtheriae.
Практическая значимость работы
Упрощена технология изотипирования компонента С4 комплемента в микропанели, предусматривающая использование более чувствительных и доступных реагентов - антител против СЗ и пероксидазного конъюгата этих антител по сравнению с реагентами на основе С4 человека;
метод позволяет определять дефицит С4А и С4В в сыворотке больных, что может быть расценено, как фактор риска развития аутоиммунных и инфекционных заболеваний и может быть рекомендован для широкого использования в клинических условиях для диагностики нарушений в иммунной системе вместе с другими клиническими показателями;
практическая ценность работы подтверждена двумя патентами.
