Содержание к диссертации
Список сокращений 4
Введение. 5
Обзор литературы
Глава I. Иммунобиологические свойства антител . 10
Свойства и значение антител 10
Авидность и аффинность как факторы, определяющие функциональные свойства антител ,.17
Влияние некоторых физико-химических воздействий на иммунобиологическую активность антител 26
Глава 2. Метод криорадиационной обработки как один из способов
инактивации вирусов в донорской плазме и ее препаратах 31
Собственные исследования
Глава 3. Материалы и методы 38
Глава 4. Изучение специфических антител IgG класса в донорской плазме
и препаратах иммуноглобулина, обработанных криорадиацион-
ным методом 45
Титры антител к вирусу бешенства и цитомегаловирусу 45
Титры антител к вирусам клещевого энцефалита и ГЛПС 57
Титры антител к вирусам гепатита А и В 62
4.4 Титры антител к вирусам паротита, кори и краснухи ,..70
Титры антител к микобактериям туберкулеза и экзотоксину коклюшного микроба ...77
Титры антител к альфастафилолизину 80
Глава 5. Изучение биологических и физико-химических свойств препара
тов иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным
методом 83
Определение индекса авидности и относительной аффинной величины антител в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов 83
Титры специфических антител в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов в процессе хранения после криорадиа-
ционной обработки 90
Исследование молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов 95
Изучение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулина 99
Электрофоретическое фракционирование препаратов иммуноглобулина 101
Заключение.... ...105
Выводы 115
Библиографический список 116
4 Список сокращений
АГ - антиген
AT - антитело
В ГА - вирус гепатита А
ВИЧ - вирус иммунодефицита
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита
ГЛПС - вирус гемморрагической лихорадки с почечным синдромом
ИФА - иммуноферментный анализ
ОП - оптическая плотность
ПААГ- поли акрилам ид иы и гель
ЦМВ - цитомегаловирус
IgG - иммуноглобулин класса G
RHAV - относительная аффинная величина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Применение в клинической практике иммунных препаратов направленного действия в настоящее время становится основным этапом развития трансфузиологии и службы крови [4, 27, 57, 59]. Увеличение объема выпуска препаратов крови достигается главным образом за счет увеличения объема перерабатываемого сырья, роста трудовых и материальных затрат и в значительно меньшей степени за счет совершенствования технологического процесса, повышения качества готовой продукции [39, 84].
Разработка и совершенствование технологий производства высокоэффективных препаратов из плазмы донорской крови, обеспечивающих вирусную безопасность и сохранение биологической активности является актуальной задачей [3, 17, 86, 148, 174, 150, 152, 180, 182, 203, 226, 227]. Одним из перспективных методов обеспечения вирусной безопасности донорской плазмы крови и ее препаратов считается способ криорадиационной обработки с программируемым замораживанием [47].
Данная работа является фрагментом исследований, проведенных по Программе Международного научно-технического центра и Консорциума наук о плазме (США) « Разработка метода и основ технологии инактивации вирусов путем радиационной обработки программно-замороженных препаратов крови».
Влияние гамма-облучения с программируемым замораживанием на структуру и свойства белков более подробно освещено в исследованиях донорской плазмы крови и ее препаратов: альбумина, концентрата фактора VIII, человеческого лейкоцитарного интерферона [22, 29, 61, 78 ].
В работах Шангареевой Р.Ф. с соавт. (2000, 2001) [12, 85] были определены основные подходы для отработки режима гамма-облучения, позволяющие сохранить нативность и физико-химические свойства белков плазмы крови. Было показано, что замораживание плазмы по специальной программе до температуры (-78) " С с последующей радиационной обработкой
в дозах 35 и 50 кГр, обеспечивающих надежную инактивацию всех возможных
вирусов-контаминантов, не приводит к статистически значимым отклонениям
нарушения состояния ее основных белковых фракций: альбумина,
иммуноглобулинов G и А, церулоплазмина, липопротсидов высокой и низкой
плотности. Установлено, что оптимальной дозой криорадиационной обработки
плазмы донорской крови, при которой происходит наименьшее изменение ее
основного белкового состава, является доза 35 кГр. Таким образом, влияние
криорадиационной обработки на белковый состав донорской плазмы в
основном изучен. Тем не менее, иммунобиологические свойства
иммуноглобулина G после криорадиационной обработки оставались не исследованными.
Препараты иммуноглобулинов из крови человека и животных широко используются в медицине. Действующим началом препаратов иммуноглобулинов являются специфические антитела. Поэтому изучение влияния криорадиационной обработки на титры специфических антител, а также физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов представляет значительный научный и практический интерес.
Цель исследования. Оценить влияние криорадиационной обработки донорской плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов на иммунобиологические свойства антител IgG класса.
Задачи исследования.
Изучить влияние криорадиационной обработки в дозах 5-50 кГр на титры антител к вирусным и бактериальным антигенам в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов человека нормального и специфических.
Определить влияние криорадиационной обработки на протективные вируснейтрализующие титры антител в реакции биологической нейтрализации на животных (in vivo).
Исследовать функциональные свойства: авидность и аффинность специфических антител в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом.
Изучить влияние различных доз криорадиационной обработки на основные физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов.
Установить оптимальные дозы криорадиационной обработки, при которых физико-химические свойства молекул IgG соответствуют критериям качества препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного применения.
Научная новизна.
Впервые:
установлено, что в результате криорадиационной обработки плазмы донорской крови и препаратов иммуноглобулина в дозах 5-50 кГр статистически достоверно и дозозависимо повышаются (в 1,2 - 4,6 раза) титры специфических антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов;
показано, что в результате криорадиационной обработки происходит повышение (в 1,3-4,6 раза) вируснейтрализующих титров антирабических антител;
выявлены особенности изменения функциональных свойств антител: тенденция к повышению авидности и аффинности в донорской плазме и препаратах иммуноглобулина, обработанных криорадиационным методом, установлена сильная корреляция между относительной аффинностью и титрами антител (к вирусу ГЛПС и коклюшному токсину);
обнаружена корреляционная зависимость между содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального и титрами антител к вирусу клещевого энцефалита;
установлено, что криорадиационная обработка не приводит к значительным изменениям молекулярных параметров препаратов иммуноглобулинов.
8 Практическая значимость работы.
По материалам исследования подана заявка №2003123647 на изобретение «Способ повышения специфической активности антител IgG класса».
Полученные результаты являются основой для создания технологии, направленной на повышение специфической активности препаратов иммуноглобулинов и антитоксических сывороток в производстве соответствующих препаратов крови. Установленная высокая корреляция между аффинностью и титрами антител позволяют рекомендовать метод криорадиациошюй обработки для повышения функциональной активности антител с дальнейшим использованием в качестве иммунохимических реагентов дианостических тест-систем, а также для производства специфических иммуноглобулинов, применяемых по жизненным показаниям.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Криорадиационная обработка донорской плазмы и препаратов
иммуноглобулинов в дозах 5-50 кГр сопровождается повышением титров
антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов (в 1,2 - 4,6 раза), при этом
уровень повышения титров антител коррелирует с дозой гамма-облучения.
2. Криорадиационная обработка препаратов антирабического иммуноглобулина
в дозах 5-50 кГр приводит к повышению (в 1,3-4,6 раза) протективных
вируснейтрализующих титров антирабических антител.
3. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов, обработанных
криорадиационным методом, соответствуют требованиям, предъявляемым к
качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения. Повышенный
уровень титров специфических антител в процессе хранения после
криорадиационной обработки сохраняется в течение 1,5 лет (срок наблюдения).
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV международном съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003), Всероссийской научной конференции, посвященной 105-
9 летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003), научно-практической конференции «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), II Республиканском конкурсе молодых ученых (г.Уфа, 2003), Ученых Советах ГУП «Иммунопрепарат» (2003 - 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, принята заявка на изобретение Федеральным институтом патентной собственности.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (5 глав), заключения и выводов. Материал изложен на 139 страницах текста, содержит 20 рисунков и 23 таблицы. Библиографический список включает 229 источников (87 отечественных и 142 иностранных).
