Введение к работе
Актуальность проблемы
Псориаз – хронический дерматоз мультифакториальной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалением в дерме (Соколовский Е.В. и соавт., 1999).
Эпидемиологические исследования последних лет показали, что псориаз встречается практически во всех климатогеографических зонах земного шара, однако отмечаются расовые отличия в частоте заболевания. Распространенность псориаза варьирует в разных странах, и, по данным различных авторов, составляет от 0,1% до 2% (Lomholt G., 1963; Brandrup F., Green A., 1981; Christophers E., 2001). В Европейских странах псориаз поражает 1,5-2% популяции, в Канаде заболевание встречается с частотой до 4,7%, в Азиатских странах встречается реже (0,4% в Китае). У 14–47% больных псориазом наблюдается артрит и/или спондилит (Gladman D.D., 1998). В настоящее время число больных псориазом в России составляет приблизительно 3 млн. человек; отмечается тенденция к росту заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, увеличению числа тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания (Беляев Г.М. и соавт., 2005). К настоящему времени доля больных псориазом среди всех больных дерматозами составляет 12-15% (Соколовский Е.В. и соавт., 1999). Установлено, что у 60-70% больных псориаз предшествует артриту, у 10-20% – псориаз развивается одновременно с артритом и примерно у 20% кожные проявления псориаза могут развиться после возникновения поражения суставов (Логинова Е.Ю. и соавт., 2008). Артрит предшествует развитию псориаза чаще у детей, имеющих отягощенный семейный анамнез по псориазу (Насонов Е.Л., 2008). В формировании и реализации клинических проявлений псориаза участвуют многочисленные факторы. Многие зарубежные и отечественные исследователи отмечают ведущую роль иммунных механизмов в патогенезе псориаза (Шегай М.М., и соавт., 1998; Gottlieb A.B., 2003; ., 2008).
В связи с распространенностью данного заболевания и не выясненным первичным патогенетическим механизмом, представляется актуальным исследование хемокинов, хемокиновых рецепторов, основных цитокинов, участвующих в патогенезе псориаза, и транскрипционного маркера Т-регуляторных клеток – FOXP3. Данное исследование позволит уточнить патогенез заболевания, охарактеризовать длительность и течение хронического повреждения в коже.
Цель работы. Оценить закономерности системной продукции и местного синтеза цитокинов при псориазе с целью изучения иммунопатогенеза и поиска новых биомаркеров заболевания.
Задачи работы
-
Определить нормальные значения уровня цитокинов в сыворотке крови и в моче, а также экспрессию мРНК СС- и СXC-хемокинов в биоптатах кожи практически здоровых лиц.
-
Определить в сыворотке крови больных псориазом содержание следующих цитокинов:
провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-1, IL-9, IL-12 (p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF-, TRAIL, MIF, LIF; IL-2R, IFN-2);
противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA);
Th1-цитокинов (IFN-, TNF-, IL-2,);
Th2-цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6);
факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (FGFbasic, SCF, SCGF, PDGF-BB, -NGF, VEGF, HGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, ICAM-1, VCAM-1);
хемокинов (CCL27/CTACK, CXCL1/GRO, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CCL11/eotaxin, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1 и CCL4/MIP-1).
-
Оценить содержание цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-, GM-CSF, TNF-) в сыворотке крови и моче у больных псориазом и у больных атопическим дерматитом и склеродермией, и в зависимости от клинической активности процесса.
-
Исследовать экспрессию мРНК FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже при псориазе.
5. Определить экспрессию мРНК некоторых СС- и СXC-хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой и в пораженной коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией.
Научная новизна
Впервые определена экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже практически здоровых лиц. Выявлено, что в коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов (CCL4/MIP-1, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8) и гены рецепторов для СС-хемокинов (ССR1, CCR3 и ССR5), однако отсутствует экспрессия СС-хемокинов (CCL3/MIP-1, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов для семейства СXС-хемокинов. Показано, что у больных псориазом с индексом PASI менее 10 и с индексом PASI более 20 значительно повышено содержание в сыворотке крови: CCL4/MIP-1, CCL7/MCP-3, CCL11/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCL1/GRO, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1 по сравнению с практически здоровыми лицами, а также повышено содержание CXCL10/IP-10 в сыворотке крови у пациентов с индексом PASI < 10. Установлены особенности экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией. Установлена зависимость экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в коже от распространенности и тяжести течения псориаза и псориатического артрита, а также определена их корреляция с индексами прогрессии данной патологии, индексами VAS и PASI.
Впервые определены лабораторные маркеры активности псориаза в моче: выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом PASI и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче при псориазе и взаимосвязь между уровнем IL-6 и содержанием белка в моче, что может указывать на диагностическую значимость этого цитокина как маркера «активности поражения почек» при псориазе. Установлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами. Изучен уровень экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже у больных псориазом, также установлены закономерности экспрессии этого гена по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой коже больных псориазом и индексом тяжести и распространенности заболевания (PASI).
Теоретическая значимость работы
В данной работе освещены три аспекта иммунопатогенеза псориаза: участие цитокинов, Т-регуляторных клеток, а также хемокинов и их рецепторов в формировании и поддержании псориатического воспаления. С помощью мультиплексного анализа цитокинов показано вовлечение в патогенез псориаза «цитокинового каскада», включающего активацию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, Th1- и Th2-цитокинов, хемокинов, а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул. На уровне регуляторных Т-клеток было выявлено нарастающее повышение экспрессии гена FOXP3 по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом тяжести и распространенности псориаза и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче.
Третий аспект относится к определению закономерностей повышенного местного синтеза СС- и СХС-хемокинов и хемокиновых рецепторов в кожных биоптатах больных псориазом, участвующих в формировании и поддержании воспаления в коже. Высказана гипотеза о наличии в визуально непораженной коже больных псориазом повышенного содержания мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1, CCL4/MIP-1, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и двух рецепторов для CXCL8/IL-8 (СXCR1 и СXCR2) как потенциальных биомаркеров заболевания, что наиболее значимо в дебюте псориаза, особенно при суставных его проявлениях.
Практическая значимость работы
Определение показателей повышенной экспрессии мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1, CCL4/MIP-1, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов (СXCR1 и СXCR2) в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3 в коже предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике для дифференциальной диагностики псориаза, что наиболее значимо в дебюте заболевания, особенно при суставных его проявлениях. Для определения активности заболевания рекомендуется определять IL-6 и IL-8 в моче, предлагаемые «маркеры» активности псориаза, которые определяются с помощью неинвазивных методов и доступны для клинического применения. Для уточнения поражения почек при псориазе возможно определение IL-6, который коррелирует с содержанием белка в моче.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. В сыворотке крови больных псориазом значительно увеличено по сравнению с практически здоровыми лицами содержание провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-13, IL-16, IL-18, TNF-, IL-2R, IFN-2 и LIF), Th1-цитокинов (IFN-); Th2-цитокинов (IL-5), хемокинов (CCL11/eotaxin, CCL4/MIP-1, CCL7/MCP-3, CCL27/CTACK, CXCL1/GRO-, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1), а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, SCGF, -NGF, HGF и ICAM-1).
2. У пациентов с псориазом по сравнению с больными атопическим дерматитом и склеродермией повышенная экспрессия мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1, CCL4/MIP-1, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2), хемокиновых рецепторов (СXCR1 и СXCR2) и FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже сочетается с повышенным содержанием IL-6, GM-CSF, IFN- и TNF- в сыворотке крови и повышенным содержанием IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN- и TNF- в моче.
3. Рост клинической активности псориаза сопровождается повышенным содержанием IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN- и TNF- в периферической крови и повышенным содержанием IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN- в моче в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3, хемокинов (CCL11/ eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-1 и CCL4/MIP-1) и рецепторов для CXCL8/IL-8 (CXCR1, CXCR2) в биоптатах визуально здоровой и пораженной кожи.
Личный вклад автора
Автором лично выполнено проведение punch-биопсий у больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц. Автором проводилась оценка тяжести заболевания, подсчет интегральных индексов – PASI и VAS, проведение ПЦР диагностики (выделение мРНК из биоптатов кожи, проведение обратной транскрипции, амплификация, проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации). Вклад соавторов состоял в помощи при отборе, клиническом обследовании больных псориазом и псориатическим артритом и групп сравнения (Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г., Хобейш М.М.), а также в освоении и постановке новых методов исследования (Сысоев К.А.). Доля участия автора в накоплении, обобщении, анализе материала составляет 100%.
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования были доложены на конференциях: Общества Молодых Ученых СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), II Международный молодежный медицинский конгресс (Санкт-Петербург, 2007), на конференции 8-th JOHN HUMPHREY (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2008), Объединенный иммунологический форум – 2008 (Санкт-Петербург, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009). Работа поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга № 4/04-05/19 в 2008 и № 4/30.04/021 в 2009 году.
Объем и структура диссертации
