Введение к работе
Актуальность, цель и задачи исследования
Млекопитающие обладают множеством рецепторов для распознавания микробных агентов и немедленного запуска врожденного иммунного ответа. В частности, к ним относятся так называемые toll-like рецепторы (TLRs), которые также известны как паттерн-распознающие (PRRs, pattern recognition receptors). В настоящее время у человека идентифицировано 10, а у мышей 9 TLRs [Ковальчук Л.Н., Ганковская Л.В., 2005; Chuang T., 2001; Vasselon T., 2002]. В норме система TLRs участвует в защите организма от непатогенных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, поддерживая иммунный гомеостаз. Характерной чертой ряда патогенных микроорганизмов является способность преодолевать первичную линию защиты, частью которой являются TLRs. Во многом ответственным за неспособность врожденной иммунной системы справиться с патогеном является ИЛ-10.
Одним из патогенных микроорганизмов, способных к подавлению иммунной защиты хозяина, является Yersinia enterocolitica. Среди иммуносупрессивных воздействий этого патогена наибольшую роль отводят:
короткодистантному эффекту – прямое подавление синтеза фактора некроза опухоли- (ФНО-) через активацию TLRs, осуществляемое за счет аппарата секреции/транcлокации III типа (TTS) и белков наружной мембраны Y. enterocolitica (Yops – Yersinia outer proteins);
длиннодистантному эффекту – непрямое подавление синтеза ФНО-, реализуемое через V-антиген Yersinia (LcrV).
Несмотря на достаточное количество исследований, молекулярные механизмы, лежащие в основе преодоления Y. enterocolitica иммунологической защиты организма, остаются не до конца изученными. Для ряда других патогенов они и вовсе неизвестны.
Поэтому целью данной работы является изучение in vivo и in vitro иммуномодулирующих эффектов основного антигена Y. enterocolitica – LcrV.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Определение механизмов иммуносупрессивного действия Y. enterocolitica на клетки врожденной иммунной системы и роли LcrV в этом процессе.
-
Определение рецептора(ов) врожденного иммунитета, отвечающего(их) за взаимодействие с LcrV Y. enterocolitica.
-
Выявление активного региона LcrV, ответственного за взаимодействие с рецептором.
-
Выявление роли TLR2 в иерсиниозе и восприимчивости мышей разных линий к Y. enterocolitica.
-
Сравнение значимости TLR2 и TLR4 в развитии инфекционного процесса при заражении животных Y. enterocolitica.
Научная новизна работы
Выявлено, что V-антиген Y. enterocolitica (LcrV) оказывает иммуносупрессивный эффект как in vitro, так и in vivo, который выражается в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-.
Впервые показано, что иммуносупрессивное действие LcrV проявляется при условии одновременной экспрессии на клетках хозяина CD14 и TLR2. Установлено, что взаимодействие LcrV с рецепторным комплексом CD14/ TLR2 вызывает генерацию внутриклеточного сигнала и активацию NF-B.
Проведен анализ аминокислотной последовательности V-антигена Y. enterocolitica, и обнаружен участок аа31-49 NH2-конца LcrV, обладающий наиболее выраженной иммуносупрессивной активностью.
Впервые получены данные о восприимчивости линейных мышей к иерсиниозу в зависимости от их генотипа. Показано, что линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие этот рецептор. Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ-10 и высокими – ФНО-, за исключением сублиний мышей C3H.
Обнаружено, что у мышей сублиний C3H даже при отсутствии экспрессии TLR2 сохраняется повышенная восприимчивость к иерсиниозу, а цитокиновый ответ на rLcrV не изменяется.
В результате сравнения инфекционного процесса, вызванного Y. enterocolitica у линейных мышей, установлено, что экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4.
Практическая значимость полученных результатов
Представленные исследования расширяют имеющиеся представления о механизмах иммуносупрессивного воздействия Y. enterocolitica на врожденные иммунные реакции человека и животных. Кроме того, полученные в работе данные способствуют более глубокому пониманию функционирования достаточно мало изученных рецепторов TLR2 и их возможной двоякой роли во врожденном иммунном ответе на бактериальные инфекции.
Выявленная в исследованиях ведущая роль ИЛ-10 в патогенезе иерсиниоза, а также имеющаяся к настоящему времени технология создания терапевтических моноклональных антител создают предпосылки для разработки новых подходов для лечения этого инфекционного заболевания. С другой стороны, обнаруженный активный пептидный фрагмент LcrV, высокоэффективный в подавлении иммунного ответа на Y. enterocolitica, может послужить основой для создания нового иммуносупрессивного лекарственного препарата.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
V-антиген Y. enterocolitica (LcrV) и синтетические пептиды, отражающие часть его последовательности при взаимодействии с рецепторным комплексом CD14/TLR2 обладает иммуносупрессивным эффектом как in vitro, так и in vivo, который проявляется в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-.
-
Линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие TLR2. Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ-10 и высокими – ФНО-, за исключением сублиний мышей С3Н.
-
Экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4.
Апробация работы
Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке фонда DFG (Мюнхен, Германия), включена в проект программы Graduiertenkolleg «Механизмы подавления врожденной иммунологической защиты организма Y. enterocolitica».
Материалы диссертации неоднократно докладывались в Институте гигиены и медицинской микробиологии им. М. Петтенкофера (Университет им. Л. Максимилиана, Мюнхен, Германия) в 2001-2003 г.г., на Съезде молодых ученых, работающих по программе Graduiertenkolleg фонда DFG (Ульм, Германия, 2001 г.). Основные результаты работы были представлены на Съезде Немецкого общества гигиены и микробиологии (6–10 октября 2002 г., Гейдельберг, Германия), 11-м Европейском совещании по бактериальным белковым токсинам (ETOX-11; 28 июня–3 июля 2003 г., Прага, Чехия), 8-й Конференции Международного эндотоксинового общества (15–18 ноября 2004 г., Киото, Япония), Конференции молодых ученых, посвященной памяти Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (4–7 декабря 2006 г., Пермь, Россия).
Апробация работы проходила на совместном заседании кафедры фармакологии и кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. По результатам выполненных исследований опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати.
Внедрение результатов исследования
Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры фармакологии и лекционном курсе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в экспериментальной работе бактериологической лаборатории по исследованию вирулентных свойств Y. enterocolitica Института гигиены и медицинской микробиологии им. М. Петтенкофера (Университет им. Людвига Максимилиана, Мюнхен, Германия).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав и заключения. Работа содержит 19 рисунков и 2 таблицы. В списке использованной литературы – 222 источника.
