Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Серологические маркеры вируса гепатита В 10
Методы определения серологических маркеров вируса гепатита В.. 23
Метод иммуноферментного анализа 24
Метод полимеразной цепной реакции 28
1.3. Основные этапы обеспечения вирусной безопасности препаратов
иммуноглобулинов 30
2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
Материалы 38
Методы 39
2.2.1.1.Определение антигенных и антительных маркеров вируса
гепатита В 39
2.2.1.2. Количественное определение HBsAg 40
2.2.2. Методы получения компонентов тест-системы для
количественного определения анти-HBs 41
Получение очищенного HBsAg 41
Получение иммуносорбента 43
Получение конъюгата 43
Получение контрольного отрицательного образца (К') и
контрольных положительных образцов (К+ю, К+50> K+ioo) 44
2.2.3.1.Выявление ДНК ВГВ методом ПЦР 45
2.2.3.2. Определение ДНК ВГВ методом ПЦР в режиме реального
времени 46
2.2.4. Статистическая обработка данных 47
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 48
Особенности выявления HBsAg в пулах плазмы для фракционирования 49
Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами 60
Сравнение методов ИФА и ПЦР при оценке маркеров вируса гепатита В в модельных опытах 66
Разработка тест-системы для количественного определения антител
к поверхностному антигену вируса гепатита В 69
Применение формулы для расчёта концентрации анти-HBs 83
Определение уровня анти-HBs в плазме для фракционирования и
препаратах иммуноглобулинов 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 93
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ '. 104
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Анти-НВс - антитела к ядерному («core») антигену вируса гепатита В
Анти-HBs - антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В
AT - антитела
ВГВ - вирус гепатита В
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ГВ - гепатит В
ДНК ВГВ - дезоксирибонуклеиновая кислота вируса гепатита В
ИГ - иммуноглобулин
ИГВВ - иммуноглобулин для внутривенного введения
ИФА - иммуноферментный анализ
МЕ/л, мМЕ/мл, МЕ/г - международные единицы измерения концентрации
антител к вирусу гепатита В
ОГВ - острый гепатит В
ОСО - отраслевой стандартный образец
ПФО - Приволжский Федеральный Округ
ПНР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ФСВОК - Федеральная система внешней оценки качества
ФСП - Фармакопейная статья предприятия
ХГВ - хронический гепатит В
IgG - иммуноглобулин класса G
IgM - иммуноглобулин класса М
HBcAg - ядерный («core») антиген вируса гепатита В
HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В
rHBsAg - рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирусная безопасность препаратов из плазмы крови обеспечивается многоступенчатым комплексом мер, включающих: отбор доноров; проверку индивидуальных порций плазмы на отсутствие вирусных маркеров; введение в технологический процесс стадий инактивации вирусов и контроль готовых продуктов. Для обнаружения маркеров вирусных инфекций в плазме и препаратах крови в настоящее время используется иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы основаны на разных принципах обнаружения возбудителя и взаимно дополняют друг друга.
Однако несмотря на такой контроль сохраняется риск инфицирования пулов плазмы вирусом гепатита В (Kleinman S.H. et al., 2005; Alvarez do Barrio M. et al., 2005; Soldan K. et al. 2005). Это связано с широким распространением заболевания, малой инфицирующей дозой и высокой устойчивостью вируса гепатита В (ВГВ). Для снижения этого риска рекомендовано расширить перечень обязательных тестов при обследовании доноров и контроле готовых продуктов, в частности Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) рекомендовано проводить контроль уровня антител к HBsAg (анти-HBs), концентрация которых в препаратах иммуноглобулинов нормируется. Введение этого дополнительного контроля в нашей стране сдерживается отсутствием отечественных тест-систем для количественного определения анти-HBs. Как показал многолетний опыт, анти-HBs являются фактором защиты. Однако связывание анти-HBs с HBsAg может влиять на результаты анализа, экранируя HBsAg в составе иммунных комплексов.
Учитывая погрешности лабораторной диагностики (Джумагулова А.Б. и др., 2001; Нетёсова И.Г. и др., 2005) нерешённой остаётся также проблема по созданию алгоритма тестирования пулов плазмы для фракционирования и
препаратов иммуноглобулинов. В монографии «Плазма человека для фракционирования» в Европейской фармакопее 4-го издания предусмотрено тестирование первого гомогенного пула плазмы на HBsAg. Пул плазмы считается пригодным для дальнейшей работы, если в нём не выявлен HBsAg. Национальная фармакопейная статья этого требования не предусматривает. Поэтому усовершенствование алгоритма обследования на присутствие маркеров вируса гепатита В пулов плазмы для фракционирования, используемых для получения препаратов иммуноглобулинов, является актуальным.
Цель работы - разработка оптимального алгоритма обеспечения вирусной безопасности готовых препаратов в отношении гепатита В на основе изучения эффективности тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов на HBsAg, анти-HBs и ДНК ВГВ.
Задачи исследования:
1. Оценить влияние иммунной нейтрализации на обнаружение HBsAg методом
ИФА и количественно охарактеризовать способность специфических антител
экранировать HBsAg в пулах плазмы для фракционирования и в препаратах
иммуноглобулинов.
Изучить влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs на возможность выявления ДНК ВГВ.
Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения анти-HBs.
4. Исследовать уровень анти-HBs в индивидуальных образцах плазмы крови,
пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.
Научная новизна.
Изучена эффективность выявления HBsAg в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.
Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления HBsAg методом ИФА в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов является иммунная нейтрализация HBsAg антителами.
В опытах in vitro показано, что в оптимальных температурных условиях при равновесной концентрации антигена и антител в системе достигается наиболее полная иммунная нейтрализация. В этом случае анти-HBs в количестве 1 ME способны связывать не менее 50 нг HBsAg.
Исследовано влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs на особенности выявления HBsAg и ДНК ВГВ. Продемонстрировано, что процесс формирования иммунных комплексов не влиял на эффективность выявления генома вируса гепатита В методом ПЦР.
Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-HBs и рабочий стандарт для калибровки с концентрациями 10, 50 и 100 МЕ/л, для стабилизации которого использована мальтоза.
Разработан оригинальный способ очистки HBsAg из сформированного иммунного комплекса HBsAg/aHTH-HBs.
Практическая значимость и внедрение результатов.
В результате проведённых исследований разработана технология производства иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Для упрощения расчета количественного содержания антител наряду с традиционным использованием калибровочного графика предложена формула, позволяющая определять содержание анти-HBs только по одному контрольному образцу с концентрацией антител (50 МЕ/л). Тест-система
успешно прошла апробацию на базе цеха гаммаглобулинов Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» и государственные испытания в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Проект нормативной документации находится на утверждении в Фармакопейном Государственном комитете. На изобретение «Тест-система для определения анти-HBs в биологическом образце» получена приоритетная справка № 2005107749 от 21.03.05. Сравнение разработанного диагностического набора с зарубежными аналогами показало высокую специфическую активность разработанной тест-системы и целесообразность её использования для количественного определения анти-HBs в плазме (сыворотке) крови при обследовании доноров, для определения напряжённости иммунитета, а также для определения соответствия препаратов иммуноглобулинов стандартам ВОЗ.
В фармакопейную статью предприятия на «Имбиоглобулин» (ФСП 42-0504-4266-04) внесены дополнительные показатели, улучшающие безопасность препарата: контроль уровня антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.
Основываясь на изученных закономерностях «экранирования» HBsAg специфическими антителами, показано, что определение HBsAg не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов. Рекомендовано внести дополнение в алгоритм мониторинга препаратов иммуноглобулинов - определение анти-HBs. В случае выявления концентрации антител, не соответствующей международным требованиям, необходимо проводить тестирование препаратов иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР.
Положения, выносимые на защиту
1. Определение HBsAg, являющееся обязательным при тестировании пулов плазмы для фракционирования, не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов в отношении
вируса гепатита В, что позволяет внести дополнение в алгоритм их контроля — определение уровня анти-HBs.
2. Создана иммуноферментная тест-система для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.
Апробация работы.
Результаты работы представлены на 10-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2002); на II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (С.-Петербург, 2003); на Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004); на научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (Н.Новгород, 2004); на VI Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблема эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005).
Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной с участием сотрудников Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» 24 ноября 2005 г.
По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
І.І.Серологические маркеры вируса гепатита В.
Первые сведения о гепатите В были получены B.S.Blumberg (1963) и D.S. Dane в 1970 году, которые описали, соответственно, «австралийский» антиген и сам возбудитель. В настоящее время известно, что возбудитель гепатита В - ДНК-содержащий вирус с предпочтительным тропизмом к печёночной ткани относится к семейству Hepadnaviridae, вызывает острое воспаление печени и может сопровождаться формированием длительного вирусоносительства и/или переходом в хронический гепатит [Жданов В.М., Ананьев В.А., Стаханова В.М., 1986; Robinson W.S., 1989; Соринсон С.Н., 1997; Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Краткая характеристика ВГВ представлена в таблице 1.
Таблица 1
Краткая характеристика вируса гепатита В
Вирионы диаметром 42-45 нм (частицы Дейна) имеют сферическую форму и состоят из оболочки и нуклеокапсида. Оболочка вируса содержит
' 42 им
* *
Рис. 1. Структура вируса гепатита В [Майер К.-Л., 1999]
поверхностный антиген ВГВ (HBsAg); дополнительно она содержит рецептор для полимеризованного альбумина (pAR). В нуклеокапсиде находятся ядерный (core) антиген ВГВ (HBcAg) и антиген е ВГВ (HBeAg); дополнительно в нём содержатся ДНК-полимераза (обратная транскриптаза), протеинкиназа и ДНК вируса (рис.1) [Львов Д.К., 1997; Майер К.-Л., 1999; Аммосов А.Д., 2003; Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003].
Каждый из антигенов ВГВ вызывает гуморальный иммунный ответ, проявляющийся выработкой соответствующих антител (анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе) [Лобзин Ю.В. и др., 2003]. Для решения комплекса научных и практических задач вирусспецифические маркеры гепатита В, которые обычно определяют соответствующими лабораторными анализами в сыворотке, плазме крови, лимфе, слюне, моче, а также в клетках и тканях различных органов [Львов Д.К., 1997; Мартова О.В., 1999], классифицируют следующим образом [Балаян М.С., Михайлов М.И., 2003]:
- антигенные (HBsAg, HBcAg и HBeAg);
- иммунологические (антитела класса IgM и IgG к HBcAg и антитела
класса IgG к HBs- и НВе-антигенам);
- генетические (нуклеотидные последовательности ДНК).
Антигенные, иммунологические и генетические специфические маркеры
инфекции в крови обычно объединяют под общим названием - серологические маркёры [Аммосов А.Д., 2003].
Основой лабораторной диагностики ВГВ-инфекции является определение следующих серологических маркеров инфицирования вирусом: поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) и антител к нему (анти-HBs), «е»-антигена ВГВ (HBeAg) и антител к нему (анти-НВе), ядерного антигена ВГВ (HBcAg) и антител к нему (анти-НВс), ДНК ВГВ [Ильина Е.Н. и др., 2001].
Основным диагностическим серологическим маркером вируса гепатита В является HBsAg [Moerman В., Moons V., Sommer Н. et al., 2004], который появляется в сыворотке крови перед клиническими проявлениями заболевания и достигает максимальной концентрации в момент проявления клинических симптомов. HBsAg сохраняется в течение всего периода существования симптомов заболевания и исчезает в фазу реконвалесценции. HBsAg является маркером контакта с вирусом гепатита В, возможного наличия ВГВ, при острой или хронической инфекции или носительстве вируса [Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999; Майер К.-П., 1999].
HBsAg синтезируется в цитоплазме гепатоцитов обычно в избытке. Небольшое его количество участвует в формировании новых вирусных частиц, а остальная часть секретируется в межклеточное пространство и поступает в кровь. Концентрация HBsAg в крови колеблется от нескольких пикограмм до сотен микрограмм и иногда приближается к концентрации нормальных сывороточных белков [Соринсон С.Н., 1997].
HBsAg представляет собой белковый комплекс, который входит в состав оболочки вируса (собственно частиц Дейна) и существует самостоятельно в виде неинфекционных сферических частиц диаметром около 20 нм и филаментозных частиц длиной около 230 нм. Известно, что на каждый обнаруженный вирион (частицу Дейна) приходится сотни «пустых» оболочек (рис.2).
Рис.2. Форма и структура вириона и неинфекционных HBsAg-филаментов и частиц
По химическому составу частицы HBsAg состоят в основном из гликопротеина (226 аминокислот), который имеет В-клеточные эпитопы, важные для индукции защитного антительного ответа у людей. Чётко показано, что область между остатками 120 и 150 из S-белка представляет детерминанты, обычные для всего ВГВ, расположена на поверхности ВГВ частицы [Howard CR, Allison LM, 1995].
Разнообразие генотипов ВГВ (А, В, С, Д, Е, F) [Kidd-Ljunggren et al., 2002; Arauz-Ruiz P. et al, 2002; Tran T.-T. H. et al., 2003; Лобзин Ю.В. и др., 2003; Sitnik R. et al., 2004; Mizuochi T. et al., 2005] привело к тому, что циркулирующие штаммы вируса неоднородны по антигенной характеристике HBsAg. Антигенный комплекс HBsAg включает в себя несколько детерминант: одну общую группоспецифическую - «а» (идентифицировано три её варианта - al, а2, аЗ) и две пары аллельных или подтиповых детерминант «d» или «у», «г» или «w» (четыре варианта - wl, w2, w3, w4) и дополнительные (минорные) детерминанты «х», «f», «t», «n», «g», «k» и «q». Сочетание антигенных детерминант определяет серотип (субтип) антигена. Соответственно, выделяют 9 основных субтипов HBsAg: ayw 1, ayw 2, ayw З, ayw 4, ayr , adrq-, adrq+, adw 2, adw 4 и пять более редких: awr, adrw, adyr, adyw и adywr. Протективные свойства связаны в основном с антителами к групповой детерминанте «a» [Norder Н. et al., 1991; Львов Д.К., 1997; Maillard Р, Pillot J, 1998; Ярославцева Н.Г., 2002; Shokrgozar М.А., 2002; Аммосов А.Д., 2003; Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003; Yalcinkaya К.Т. et al., 2005].
Установлена неоднородность генотипов и субтипов HBsAg в разных регионах, что обусловило известное значение выявления субтипов в качестве эпидемиологической региональной метки [Мукомолов С.Л. и др., 1992; Соринсон СМ., 1997; Рахманова А.Г. и др., 2003; Ding X. et al., 2003; Yalcin К et al., 2004; Senturker Guldas N., Abacioglu Y.H., 2004; Weber В., 2005].
Кочнева Г.В. с соавт. (2005) при изучении генотипического разнообразия ВГВ выявили превалирование генотипа D (97,6 %) среди пациентов инфекционных больниц в трёх регионах Сибири.
На территории европейской части России преобладает циркуляция субтипа «ау» (92 %). Соотношение субтипов HBsAg таково: 53 % ayw2; 24 % ayw3varB; 15 % ayw3varA; 8 % adw2 [Нетёсова И.Г. и др., 2004; Нетёсова И.Г. и др., 2005]. В Ямало-ненецком автономном округе выявлено абсолютное доминирование генотипа D, представленного субтипами ayw2 (23,5 %); ayw3 (70,6 %); adw2 (5,9 %) [Майнулов В.А. и др., 2005]. Вместе с тем, в отдельных группах населения, особенно среди представителей народов России с компактным проживанием, субтип «ad» может быть выявлен чаще. Так, среди ненцев, проживающих в Пуровском районе Тюменской области, соотношение субтипов «ad» и «ау» равно 1:3 [Netesova I.G. et al., 2001].
Различия, связанные с субтипами, несут ответственность за одновременное появление в одной и той же пробе сыворотки HBsAg и антител к поверхностному антигену ВГВ (анти-HBs) [Майер К.-П., 1999; Karthigesu VD et al., 1999; Ge J.H. et al., 2004; Margeridon S. et al., 2005].
Анти-HBs являются маркером, свидетельствующим о ранее перенесённой инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета. [Bocher WO et al., 1996; Балаян M.C., Михайлов М.И., 1999]. Пациенты, которые после перенесённого гепатита В становятся анти-HBs-положительными, являются также, как правило, и анти-НВс-положительными. В отличие от естественно приобретённого иммунитета, при иммунитете, развивающемся после вакцинации, здоровые лица становятся анти-HBs-положительными и при этом остаются анти-НВс-отрицательными [Майер К.-П., 1999].
HBcAg обнаруживается только в ядрах гепатоцитов, а в периферической крови не обнаруживается, поэтому в клинической практике применяется определение в крови антител против HBcAg (анти-НВс) [Gandhi R.T., 2005].
Анти-НВс IgM являются самыми ранними антителами, которые появляются после инфицирования и являются маркером активной репликации ВГВ. Поскольку динамика элиминации HBsAg может быть индивидуально различной и у некоторых больных HBsAg элиминируется уже в течение первой недели после появления клинических симптомов, то у 10 % пациентов можно диагностировать острый гепатит В только с помощью определения анти-HBcIgM [Балаян М.С, Михайлов М.И., 1999].
Анти-НВс IgG - маркер, свидетельствующий о перенесённой инфекции или контакте с ВГВ [Майер К.-П., 1999; Хашимова П.Р. и др., 1991].
Анти-НВс в отличие от анти-HBs не обладают протективными свойствами [Балаян М.С, Михайлов М.И., 1999; Gandhi R.T., Wurcel A., Lee Н. et al., 2005]. Диагностическая ценность анти-НВс важна в ситуации, когда эти антитела являются единственным детектируемым маркером в течение так называемого периода «окна», когда HBsAg уже не выявляется, а концентрация анти-HBs ещё не достигла необходимого для диагностики уровня. Это также может быть в случае, когда инфекция вызвана мутантным вирусом, не определяющимся в HBsAg-тесте [Bucholc В. et al., 2001].
HBeAg - маркер, ассоциированный с высокой инфекционностью сыворотки крови, активной репликацией ВГВ, имеет значение только для клиники, не для доноров. Анти-НВе - маркер, свидетельствующий о возможно завершённой репликации ВГВ (за исключением мутантных форм ВГВ) [Балаян М.С, Михайлов М.И., 1999]. Исследование HBeAg и анти-НВе целесообразно лишь при выявлении HBsAg-положительных проб сыворотки [Майер К.-П., 1999].
ДНК ВГВ - серологический маркер активной репликации вируса и активности инфекционного процесса.
На рис.3 представлена типичная динамика выявления серологических маркеров при гепатите В.
^--/
| Желтуха I Анти-НВс
s's'' "\ Анти-HBc-lgM ^
VI-
У "--—Si
У. N
| Симптомы}
Месяцы после попадания вируса
Рис. 3. Динамика выявления серологических маркеров при остром гепатите В
Вирус гепатита В отличается исключительно высокой инфекционностью. Заражение гепатитом В возможно при инокуляции очень малых объёмов крови от больного: 0,1 - 0,5 мкл. Одновременно с высокой инфекционностью ВГВ передаче возбудителя способствует высокая устойчивость вируса в условиях окружающей среды и в известных режимах дезинфекции [Hollinger F. et al., 1996; Соринсон СМ., 1997].
По данным литературы приблизительно 30 % населения земного шара или около 2 миллиардов человек имеют серологические маркеры текущей или прошедшей ВГВ-инфекции. 350 млн. из них являются хроническими носителями вируса [Ghendon Y.Z., 1993; Аммосов А.Д., 2003; Шамшева О.В., 2004].
В Российской Федерации гепатит В остаётся серьёзной медицинской и социальной проблемой [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Хотя в 2001-2004 гг. по сравнению с 1999-2000 гг. имело место отчётливое уменьшение показателей заболеваемости (в 2000 г. - 42,4, а в 2004 г. - 6,6 - 10,4 на 100 тысяч населения), но и сегодня эти показатели достаточно велики и заметно отличаются от тех, что регистрируют во многих странах Европы и США (1-4 на 100 тысяч населения) [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Хухлович П.А. и др., 2005; Кириллова Л.Д. и др., 2005; Тефанова В. и др., 2005].
Литературные данные свидетельствуют о том, что заражение гепатитом В может происходить с кровью, спермой, слюной, вагинальными выделениями, потом, слезами, мочой от острых и хронических больных через нарушения целостности кожных и слизистых покровов [Badur S. et al. 1992; Львов Д.К., 1997; Мартова О.В., 1999; Knutsson М. et al., 2000; Eijk A.A. et al., 2004]. По данным В.Н. Мигунова (1999) в структуре причин заболеваемости острыми вирусными гепатитами заражения, связанные с лечебно-диагностическими манипуляциями в медицинских учреждениях, составляют 17 %.
Высокий уровень инфицированности населения негативно сказывается на составе донорского контингента [Сомова А.В. и др., 2002; Barcena Marugan R et al., 2001; Martelli CM et al., 1991; Mosley JW et al., 1995; Weber В et al., 2001].
Учитывая, что потенциальные доноры, проходящие предварительное обследование [Гловацкая Е.Г., Кабанчук Н.А., 2000], отражают срез населения в целом, серьёзную опасность представляют лица, относящиеся к группе риска [Prakash С. et al., 2000; Тазаев В.Н., 2005] . Особую группу риска составляют больные наркоманией [Santana RO et al., 1998; Oliveira M.L. et al, 1999; Богач B.B., 2000], представительницы секс-бизнеса [Kilic G et al., 1993], медицинские работники, особенно лица часто контактирующие с кровью и/или её препаратами [Grazi G. et al., 1991; Khurana V. et al., 1997; Kralj N. et al., 1998;
Жибурт Е.Б. и др., 1998; Майер К.-П., 1999; Lu G. et al., 2000; Самоходская Л.М. и др., 2001; Широнина Н.Л. и др., 2002; Дроздова О.М., 2005; Kottiri B.J. et al., 2005].
Несмотря на эпидемиологический контроль и тщательный отбор доноров, по данным станций переливания крови (СПК) при лабораторном тестировании на HBsAg до 1,5% донорской плазмы ежегодно бракуется [Карякин А.В., 2005]. Однако исключение HBsAg-позитивных донаций не даёт полной гарантии вирусной безопасности, плазмы. Необходимо выявление других маркеров гепатита В.
Ряд исследователей изучали широту распространения маркеров гепатита В среди доноров.
Так Сомовой А.В. с соавт. (2002) была определена частота выявления маркеров вирусов гепатита В у различных категорий доноров, проходивших обследование в 2000-2002 г.г. В группе серонегативных по HBsAg доноров у 16,6% оказался положительным тест на анти-НВс, что свидетельствует о ранее перенесённой инфекции и вероятной реконвалесценции. У 20,5% лиц идентифицированы aHTH-HBs-антитела к ВГВ. В 3,8% случаев у доноров обнаруживались только анти-НВс.
Осечинский И.В. с соавт. (2003) у HBsAg-негативных доноров обнаружили 16,7 % лиц с анти-НВс и 25,8 % - с анти-HBs.
Бажайкиной О.С. с соавт. (2005) проведён анализ распространения HBsAg у безвозмездных доноров. Инцидентность острыми манифестными формами инфекции составила в 2004 г. 15,7±0,05%ооо.
По данным А.Л.Гураль (2005) частота выявления HBsAg и анти-НВс среди доноров крови составила 1,4 и 13,9 % соответственно.
Майнуловым В.А. с соавт. (2005) была определена следующая встречаемость серологических маркеров ГВ: HBsAg - 3,2 %, анти-HBs — 36,2 %, анти-НВс - 31,9 %.
Семёновым СИ. (2005) с соавт. HBsAg был выявлен у 8 %, а анти-НВс -у 44,1 % населения.
Согласно современным представлениям кровь, содержащая только анти-НВс, при переливании реципиентам вызывает в ряде случаев развитие посттрансфузионного гепатита и поэтому считается потенциально инфекционной [Allaine JP, Hewitt РЕ et al., 1999; Muhlbacher A et al., 2001]. С целью повышения вирусной безопасности ряд ведущих фирм в США, Германии, Японии такую кровь (плазму) отбраковывают [Сомова А.В. и др., 2002].
Действующая в настоящее время в России стандартная схема обследования доноров не предусматривает обязательное тестирование донорской плазмы на наличие антител к HBcAg [Ярославцева Н.Г. и др., 2002].
Действительно, некоторые авторы не находят подтверждения необходимости проведения скрининга на анти-НВс у доноров с целью значительного уменьшения риска возникновения посттрансфузионного гепатита [Allain JP, Reeves I et al., 1995]. В то же время другие исследователи считают, что данный параметр может служить единственным признаком субклинической формы гепатита В. У таких больных нельзя исключить продолжение инфекционного процесса [Thomas H.J., 1997]. Кроме того, у таких больных может обнаруживаться ВГВ ДНК. Известно, что почти у 10 % только анти-НВс-положительных пациентов имеется активная репликация ВГВ [Майер К.-П., 1999]. Так Barcena Marugan R et al. (2001) при изучении трансмиссии ВГВ от HBsAg-негативных/анти-НВс-позитивных доноров выявили, что ВГВ-инфекция была передана 100% реципиентов, не имеющих анти-HBs. Реципиенты с анти-HBs избежали инфицирования. В то же время анти-ИВБ-позитивные доноры (20,8%) не трансмиссировали ВГВ-инфекцию.
Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ), обобщив многолетний опыт применения вакцины против гепатита В, сделала вывод, что увеличение в популяции aHTH-HBs-позитивных лиц приведет к снижению заболеваемости и
распространения вируса гепатита В. В настоящее время во многих странах Европы, Азии и Америки проводят вакцинацию против гепатита В в рамках расширенной программы иммунизации детей [World Health Organization, 1992].
В России специфическую профилактику гепатита В начали с 1990 года. На основании приказа Минздрава СССР на начальном этапе (1990-1995 гг.) вакцинацию против ГВ проводили лишь в отдельных регионах среди лиц, составляющих группы высокого риска заражения ВГВ. В настоящее время вакцинация детей против гепатита В введена в национальный календарь прививок. Кроме того, вакцинации подлежат контингента, относящиеся к группам высокого риска заражения ГВ [Приказ Минздрава РФ № 229 от 27.06.2001; МайерК.-П., 1999; Соринсон СМ., 1997].
Одним из критериев эффективности иммунопрофилактики является характеристика иммунного ответа организма на вводимую вакцину, которая определяется концентрацией антител, качеством и длительностью их персистенции. Международный комитет по вакцинопрофилактике определил, что лица, ответившие на введение вакцины против гепатита В выработкой антител, при тестировании которых в РИА величина сигнала в 10 раз превышает уровень сигнала, зарегистрированного в негативном образце, защищены от последующего заражения гепатитом В. Дальнейшие исследования подтвердили, что такая концентрация антител может быть рассмотрена как защитная [CDC, 1982; Francis D.P. et al., 1982; Werner B.G. et al., 1985; Kassler H.A., 1985; Greub G., Frei P.C., 2001].
Учитывая эти данные, с целью стандартизации исследований по оценке напряженности иммунитета Всемирная организация здравоохранения ввела соответствующий международный стандарт, выраженный в международных единицах на литр (МЕ/л) или мили-международных единицах на миллилитр (мМЕ/мл) [WHO, 1977]. В качестве защитного (протективного) уровня определена концентрация в 10 МЕ/л или 10 мМЕ/мл [Frisch-Niggemeyer W. et al., 1986; Hall AJ.,1993; Consensus statement, 2000]. В то же время некоторые
специалисты, склонялись к более высоким уровням антител, которые, по их мнению, обеспечивают более длительный защитный эффект. В частности, в Великобритании защитным уровнем считается концентрация анти-HBs от 100 мМЕ/мл и выше [Department of Health Advisory Group on Hepatitis. HMSO, 1993, London.; Morgan DR., 1995; Allain JP, Hewitt PE et al., 1999].
Однако массовая вакцинация населения имеет и некоторые недостатки [Ayed М.В., 2001]. Есть данные, что вакцинация может спровоцировать образование мутантного штамма вируса. Так Howard CR, Allison LM. (1995) выявили в своих исследованиях, что случаи инфекции с наличием HBsAg и анти-HBs, были связаны с появлением ВГВ-вариантов. Karthigesu VD et al. (1999) обнаружили у вакцинированных детей анти-HBs и HBsAg одновременно. В этих случаях анти-HBs имели низкие титры. По их мнению, это связано с точечными мутациями в S-гене. Yukimasa N et al. (2000) анализировали генные мутации ВГВ у лиц, имевших HBsAg одновременно с анти-HBs. Все образцы были позитивными по ВГВ ДНК. Во всех случаях были обнаружены точечные мутации в S-гене, вызванные замещением положения аргинина на глицин в а-детерминанте [Соринсон С.Н., 1997]. Этот мутантный штамм был назван G145R мутантом. Heijtink RA et al. (2001) выявили, что G145R является основным мутантом вируса гепатита В, наблюдаемым в естественной инфекции, после иммунизации и терапии специфическим иммуноглобулином против гепатита В. Анти-HBs-otbct на вакцину rHBsAg с G145R мутантом был ниже по сравнению с ответом на вакцину rHBsAg дикого типа. В результате новый штамм ВГВ с изменённой структурой стал недосягаемым для тестирования [Баженов А.И. и др., 2005], что является важной проблемой при проведении скрининга [Лобзин Ю.В. и др., 2003]. Поэтому ряд авторов рекомендуют использовать тестирование на анти-НВс для контроля появления мутантов [Alhababi F. et al., 2003].
Таким образом, наличие вариантов вируса с мутациями антигенных детерминант, а также существование периода «серологического окна» может
создавать трудности при тестировании донорской плазмы на HBsAg методом ИФА. Положительные реакции на маркеры ГВ у повторно сдающих кровь доноров могут быть, в частности, обусловлены варьированием уровня виремии у хронических вирусоносителей, пропущенных при первичном обследовании из-за того, что использование только декретированных тестов на ВГВ не обеспечивает выявления всех лиц, перенёсших инфекцию [Осечинский И.В. и др., 2003]. Это является серьёзным фактором, повышающим риск вирусной контаминации донорской плазмы вирусом гепатита В. Возникает необходимость определения в плазме не только HBsAg, но и таких иммунологических маркеров ВГВ как анти-НВс и анти-HBs, а в ряде случаев и ДНК ВГВ.
1.2. Методы определения серологических маркеров
вируса гепатита В.
Использование для диагностики ВГВ современных методов анализа с высокой чувствительностью и специфичностью позволяет существенно снизить риск вирусного заражения при трансфузиях крови, плазмы и продуктов их переработки.
Методы выявления антигенных и антительных маркеров ВГВ условно разделяются на три поколения:
реакция преципитации в геле;
реакция встречного иммуноэлектрофореза; реакция связывания комплемента; реакция латекс-агглютинации; метод флюоресцирующих антител; иммуноэлектронная микроскопия;
3) реакция обратной пассивной гемагглютинации; радиоиммунный,
иммуноферментный анализы [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко
Г.Г., 2003]. Помимо ставших классическими вариантов твердофазного
иммуноферментного анализа, используются и другие его варианты, например, хемилюменесцентный вариант ИФА [Ireland D., Samuel D., 1989].
1.2.1. Метод иммуноферментного анализа.
Наиболее распространенным методом, который применяется практически повсеместно для детекции антигенных и иммунологических маркеров вируса гепатита В, является иммуноферментный анализ (ИФА). Метод ИФА основан на определении комплекса антиген-антитело за счёт введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей её детекцией с помощью соответствующего субстрата. В основе метода ИФА лежит определение продуктов ферментативной реакции при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями [Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999; Карпищенко А.И., 1999].
Метод ИФА обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами детекции антител:
- высокой чувствительностью, которая определяется способностью одной
молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;
возможностью использования минимальных объёмов исследуемого материала;
стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;
простотой проведения реакции;
наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учёта;
возможностью автоматизации всех этапов реакции;
- относительно низкой стоимостью диагностических наборов [Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999].
Для детекции HBsAg иммуноферментным методом используется схема «сэндвича». На твёрдую фазу адсорбируются антитела к HBsAg. В качестве анти-HBs в большинстве современных диагностических препаратов выявления HBsAg применяются моноклональные антитела, специфичность которых позволяет выявлять субтиповые и мутантные формы HBsAg [Мукомолов С.Л., Михайлов М.И., 1999]. При тестировании HBsAg используются различные варианты постановки реакции. Следует учитывать, что при одностадийном варианте «сэндвич»-метода, при котором добавление исследуемого материала и конъюгата производится одновременно, возможно снижение регистрируемой оптической плотности ферментативной реакции при тестировании образцов, имеющих высокую (более 100 нг/мл) концентрацию исследуемого HBsAg. Это происходит из-за образования комплексов антиген-антитело, находящихся в растворе («hook-effect»). Для исключения ложнопозитивных результатов, которые могут быть обусловлены неспецифическим взаимодействием компонентов реакции и сывороток крови, бактериальным загрязнением и другими факторами, используют тест нейтрализации, который является обязательным условием диагностических исследований [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003].
В настоящее время для применения на территории России рекомендован ряд отечественных ИФА-тест-систем для выявления HBsAg [Приказ Минздрава России от 21.10.2002. г. № 322], таких как «ИФА-HBsAg» (производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио», г. Н.Новгород); «ИФА-HBsAg/M» (производства НПО «Диагностические системы», Г.Н.Новгород); «Вектогеп В - HBsAg» (производства ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Чувствительность перечисленных тест-систем составляет 0,1 нг/мл.
Для детекции анти-HBs применяют одностадийный вариант «сэндвич»-метода ИФА, при котором добавление исследуемого материала и конъюгата проводится одновременно [Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999; Егоров A.M. и др., 1991]. Схема проведения ИФА для выявления анти-HBs включает адсорбцию на твёрдой фазе HBsAg, взаимодействия последнего с исследуемыми антителами и их выявление при помощи конъюгата, представляющего собой HBsAg, меченный ферментом. На заключительном этапе реакции наличие меченого HBsAg, связавшегося с тестируемыми анти-HBs, выявляется при помощи субстратного комплекса [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003].
В диагностических препаратах, в том числе в диагностических наборах, выпускаемых в России, используется HBsAg, представленный основными субтипами антигена: «ау» и «ad». При тестировании анти-HBs в ИФА могут регистрироваться ложнопозитивные результаты. Единичные работы, посвященные данному вопросу, указывают, что около 4 % позитивных результатов ложнопозитивны и не подтверждаются реакцией нейтрализации с высокоочищенным препаратом HBsAg [Viazov S.O. et al., 1980; Nath N. et al., 1982].
Принципиальным при выявлении анти-HBs является чувствительность. Существование принятого показателя защитного уровня анти-HBs при оценке поствакцинального иммунитета сделало правомочным трактовку результатов выявления антител в концентрациях менее 10 мМЕ/мл как негативный результат. В настоящее время вопрос о необходимости повышения чувствительности методов выявления анти-HBs остаётся открытым. [Greub G., Zysset F., Genton В. et al., 2001].
В нашей стране для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В используются отечественные коммерческие тест-системы «ИФА-АНТИ-HBs» с чувствительностью (8±2) МЕ/л производства НПО «Диагностические системы» (г.Н.Новгород) и «BeKToHBsAg-антитела-стрип»
(чувствительность не указана) производства ЗАО «Вектор-Бест» (г.Новосибирск).
Для определения анти-НВс в большинстве выпускаемых отечественных и зарубежных диагностических наборов избран вариант, при котором происходит «блокировка» HBcAg, адсорбированного на поверхности планшета или шарика. Данные наборы не обладают абсолютной специфичностью. Считается, что неспецифические реакции при выявлении анти-НВс определяются наличием в сыворотках крови различных концентраций фактора, взаимодействующего с конъюгатом или рекомбинантным HBcAg. [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Исследования, выполненные в различных регионах мира, установили, что показатель специфичности может колебаться от 99 до 90,1 % [Lee H.S. et al., 1987; Tordjeman M. et al., 1993].
Для повышения специфичности выявления анти-НВс M.J.Nelles с сравт. (1988) предложили тест нейтрализации. М.С. Балаян и М.И.Михайлов (1999) описали метод с использованием меченых и иммобилизованных антител, а также стандартного антигена. Общая схема проведения реакции заключается в следующем: исследуемый образец смешивают с раствором, содержащим фиксированное количество антигена. После завершения инкубации добавляют конъюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой обратно пропорциональна содержанию исследуемых антител в образце.
Следует отметить, что количественное выражение концентрации анти-НВс не актуально, поэтому коммерческие наборы для этой цели не производят. В последнее время появились сведения о разработке международного стандарта анти-НВс в мМЕ/мл [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003].
В настоящее время существуют отечественные коммерческие тест-системы для выявления суммарных антител к «соге»-антигену вируса гепатита
В: «ИФА-АНТИ-НВс» (производства НПО «Диагностические системы», Г.Н.Новгород) и «BeKToHBcAg-антитела-стрип» (производства ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск).
Таким образом, широкий спектр ИФА-тест-систем, представленных на
отечественном рынке, позволяет достаточно эффективно проводить
обследование доноров, больных и вирусоносителей. Недостатком
иммуноферментного анализа, особенно при выявлении антительных маркеров
ВГВ, является невозможность его использования для регистрации
присутствующего в плазме крови возбудителя [Ильина Е.Н. и др., 2001].
Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов.
1.2.2. Метод полимеразной цепной реакции.
В настоящее время наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим определять специфические нуклеиновые кислоты или их фрагменты с высокой степенью разрешения, является метод ПЦР, разработанный в 1980-х гг. [Mullis К.В., Faloona F.A.,1987; Mullis K.B.,1990].
В основе этого метода лежит универсальный принцип комплементарности нуклеиновых кислот, открытый Уотсоном и Криком в 1954 г. Комплементарное достраивание ДНК-матрицы осуществляется in vitro с помощью фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы которой находится в области 70-72 С. Эта реакция получила название амплификации ДНК. Многократное повторение циклов синтеза приводит к экспоненциальному увеличению числа копий специфического фрагмента ДНК ВГВ [Шахгильдян И.В.с соавт., 2003].
Преимуществом ПЦР является прямое определение наличия возбудителя, а не белков-маркеров, являющихся продуктами жизнедеятельности инфекционного агента, что позволяет этот метод эффективно использовать для диагностики не только острых, но и латентных инфекций, в том числе для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью.
Первым выпущенным промышленностью диагностическим набором для выявления ДНК ВГВ стала тест-система «Amplicor HBV Monitor» фирмы «Roche» [Lopez V.A. et al., 2002], чувствительность которой составляла 4x10 копий/мл. В России используются диагностические наборы, выпускаемые НПФ «Литех», ООО «Интерлабсервис», Центральным НИИ эпидемиологии МЗ РФ, ООО «Авиценна». Эти диагностические системы позволяют проводить качественное определение наличия возбудителя ВГВ в биологическом материале с чувствительностью 103-104 копий/мл [Ильина Е.Н., 2003].
В последние годы всё более широкое распространение получает метод ПЦР в реальном времени, позволяющий проводить количественное определение ДНК ВГВ [Valasek М.А., Repa J.J., 2005] . В настоящее время разработано несколько вариантов ПЦР в реальном времени, различающихся по детекции продуктов амплификации [Екимов А.Н. с соавт.].
Несмотря на теоретическую высокую чувствительность и специфичность метода ПЦР, могут регистрироваться ложнонегативные и ложнопозитивные результаты. Ложнонегативные результаты могут быть обусловлены потерей или разрушением ДНК ВГВ в ходе подготовки материала к реакции, наличием в образце ингибиторов (химических или белковых субстанций), влияющих на различные компоненты ПЦР, гепарина [Cuypers Н.Т. et al, 1992], высокий уровень криоглобулинов в сыворотке крови [Vanthiel D.H., 1992], несоблюдение теплового режима хранения и транспортировки исследуемого материала. Причинами получения ложнопозитивных результатов может быть
контаминация между пробами и продуктами предшествующей амплификации (ампликонами) [Шахгильдян И.В. с соавт., 2003].
Использование самого чувствительного варианта ИФА не даёт полной гарантии отсутствия ВГВ в донорской плазме, особенно в серонегативном периоде, длительность которого для ВГВ составляет от 37 до 81 дня [Русанов В.М., Левин И., 2004]. По данным Европейской ассоциации по фракционированию плазмы (EPFA) реальная концентрация генома вируса гепатита В в серонегативный период, определенная методом ПЦР, может составлять около 103 геном-эквивалент/мл [Rogers M.N.,1997].
Очевидно, что для снижения риска посттрансфузионных осложнений при лечебном применении крови, плазмы и продуктов их переработки, усилия специалистов должны быть направлены на решение комплекса задач, позволяющих максимально снизить риск контаминации исходной плазмы и обеспечить адекватный контроль продуктов ее переработки, в частности препаратов иммуноглобулинов.
1.3. Основные этапы обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.
Препараты иммуноглобулинов представляют собой раствор высокоочищенной иммунологически активной фракции IgG, получаемой из плазмы крови человека. Они являются эффективным средством профилактики и лечения многих инфекционных заболеваний и получили широкое применение в медицинской практике [Минакова Л.В. и др., 1986].
Лечебное действие иммуноглобулинов определено многообразием антител к антигенам различных бактерий, вирусов и других патогенных агентов [Анастасиев В.В., 2000]. При введении в организм иммуноглобулины-антитела включаются в процесс очистки организма от бактерий, вирусов и
других патогенных агентов через активацию системы комплемента [Koch Т. et al., 1997; Ottolini M.G. et al., 1999; Kreil Т., Eible M., 1997].
Инфекционная безопасность является ключевым требованием лечебного применения препаратов, приготовленных из донорской плазмы. Несмотря на впечатляющие достижения отбора и обследования доноров крови, повышение качества диагностических тест-систем, сохраняется риск заготовки крови от лиц с отсутствием клинико-лабораторных признаков гемотрансмиссивных инфекций. Поэтому в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения для приготовления иммуноглобулинов, как и других препаратов из плазмы крови, необходимо использовать физические и химические методы разделения белков, которые позволяют получать безопасные и эффективные препараты [Комитет экспертов ВОЗ, 1992]. Как известно, спиртовое фракционирование по Кону, а это основной метод получения иммуноглобулинов в России, эффективно удаляет большинство гемотрансмиссивных вирусов, в том числе гепатит В. Полагают, что при фракционировании этанолом происходит удаление вируса гепатита В по двум различающимся механизмам: фракционному отделению и инактивации [MorgenthalerJ.J.,1993].
Известно, что препараты иммуноглобулинов являются относительно безопасными продуктами в отношении вируса гепатита В. После введения обязательного скрининга донорской плазмы на HBsAg не зарегистрировано случаев трансмиссии гепатита В после применения внутримышечных иммуноглобулинов [Hellstern Р., 1994]. Описаны только единичные случаи инфицирования ВГВ после применения внутривенных препаратов, причиной которых были нарушения технологии [Bucholc В. et al.,2001; Hellstern P., 1994].
Одним из важных факторов, исключающих передачу ВГВ препаратами иммуноглобулинов, является присутствие в них антител к поверхностному антигену вируса гепатита В [Burbach GJ et al., 1997].
В отличие от антител к вирусу гепатита С и ВИЧ анти-HBs обладают вируснейтрализующей способностью. По этой причине эксперты ВОЗ [Комитет экспертов ВОЗ, 1992] рекомендовали, чтобы все партии иммуноглобулина содержали анти-НВБ-антитела в концентрации по крайней мере 0,1 МЕ/мл (100 мМЕ/мл). В ряде стран антитела к гепатиту В специально добавляют в иммуноглобулин, чтобы гарантировать, что минимальная концентрация достигнута [Brummeihuis Н., Over J., 1989; Tabor Е., Aronson D.L., Gerety R., 1980].
В большинстве стран мира уровень содержания анти-HBs в препаратах иммуноглобулинов нормируется. В соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи (2002) содержание анти-HBs в препаратах неспецифических иммуноглобулинов должно составлять не менее 0,5 МЕ/г белка.
Определение анти-HBs в иммуноглобулиновых препаратах, по мнению Bucholc В. et al. (2001), является важным элементом безопасности и эффективной защиты пациентов.
А.В. Сомова с соавт. (1999) изучали содержание протективных анти-HBs в отечественных препаратах иммуноглобулинов, выпускаемых различными станциями переливания крови и предприятиями по производству медицинских иммунобиологических препаратов. Исследованию подверглись 18 серий ИГ, среди них - нормальный, антистафилококковый и противоклещевой ИГ. Результаты титрования показали, что уровень анти-HBs в препаратах зависел как от вида ИГ, так и от предприятия-изготовителя.
В соответствии с рекомендациями ВОЗ для получения максимальных титров антител к широкому спектру патогенов, в том числе к вирусу гепатита В, препараты иммуноглобулинов должны изготавливаться из больших пулов плазмы, как правило, от 1000 до 60000 донаций [Tabor Е., 1999]. Формирование больших производственных пулов существенно повышает риск их контаминации различными патогенными агентами [Русанов В.М., Левин И., 2004].
Вирусный гепатит В традиционно представляет трудную проблему для производителей препаратов из плазмы крови [Singh В. et al, 2004] по ряду причин:
из-за широкого распространения этой инфекции среди населения, в связи с чем риск контаминации плазменного пула вирусом гепатита В существенно выше, чем, например, вирусом иммунодефицита ВИЧ. По данным Карякина А.В. (2005) при учёте частоты рисков и объёма кроводач в РФ выявлено, что только в 2003 году в лечебную сеть и на производство препаратов крови передано более 13 тысяч доз потенциально опасной в отношении ВГВ плазмы, а по данным Soldan К. et al. (2005) в Великобритании в период с 1996 по 2003 гг. в производство поступило 1,66 инфекционных донаций на миллион;
из-за длительного серонегативного периода;
из-за высокой устойчивости вируса к факторам внешней среды, в том числе к процедурам инактиваций вирусов;
- из-за малой инфицирующей дозы.
Главной задачей производителей является изготовление препаратов иммуноглобулинов из вирусбезопасной плазмы или плазмы с минимальной вирусной нагрузкой. Не менее важным элементом является также разработка эффективных технологий производства, предусматривающих инактивацию вирусов и мониторинг всех стадий технологического процесса, в том числе контроль готового продукта.
На уровень вирусной нагрузки в плазменных пулах существенное влияние оказывают критерии оценки пригодности доноров и перечень обязательных скрининговых тестов, которые не одинаковы в разных странах мира. В Европе и США требования к вирусной безопасности определены Комитетом медицинских продуктов (СРМР) и Управлением по контролю качества лекарственных препаратов и продуктов питания (FDA) [CPMP/BWP/268/95; DHHS, FDA, 1996]. В Европейской фармакопее
(монография 0853) описаны обязательные требования к плазме для фракционирования. В соответствии с этим в развитых странах мира для производителей препаратов крови действует строго документированная система, обеспечивающая скрининг донорской плазмы на разных этапах: от индивидуальных образцов до производственного пула и готового препарата (таблица 2).
Таблица 2 Скрининг донорской плазмы и готовых препаратов на серологические маркеры ВГВ в развитых странах мира
Как видно из таблицы, в развитых странах мира главный упор делается на контроль донорской плазмы, в том числе тестирование на анти-НВс для обнаружения хронических носителей ВГВ-инфекции с низким уровнем вирусемии, у которых не выявляется HBsAg при скрининге [Busch М.Р., 2004; Allaine J.P., 2004; Ramia S. et al., 2005; Silva CM. et al, 2005; Colomina-Rodrigues J. et al., 2005], а также мини-пул тестирование с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПНР) [CPMP/BWP/269/95; WHO HQ, 2001; Weusten J.J. et al., 2002; Kasper K.C., Silva СМ., 2003; Mine H., 2003; Yoshikawa A., 2005]. По мнению ряда авторов анти-НВс-тестирование в сочетании с ПНР на ВГВ ДНК уменьшает остаточный риск ВГВ-инфекции [Roth W.K. et al., 2002; Hennig H. et al., 2002; Kleinman S.H. et al., 2003; Dreier J. et al., 2004; Weber B. et al., 2005]
Кроме того, в ряде стран некоторые фирмы дополнительно проводят скрининг плазмы на анти-HBs с целью обеспечения необходимых титров этих антител в пулах, что также способствует снижению риска ВГВ-инфекции [Dodd RY, 1996; WHO HQ, 2001].
В России нормативная база, регулирующая работу в области вирусной безопасности препаратов из плазмы крови, не соответствует требованиям международных стандартов. Отмечен принципиально другой подход к проблеме обеспечения качества и безопасности готовых продуктов. Так, для подтверждения вирусной безопасности иммуноглобулина в отношении вируса гепатита В проводится контроль на HBsAg, в то время как количественное содержание антител в готовых препаратах не определяется.
Очевидно, что проведение серологических исследований в отношении каждой вирусной инфекции должно быть научно обосновано. При этом необходимо учитывать все факторы риска в зависимости от биологических особенностей вируса, распространённости его в популяции, устойчивости во внешней среде, способности к мутациям. Для решения первоочередных задач, стоящих перед производителями препаратов крови, необходимо постоянное
совершенствование методов анализа и алгоритма исследования донорской
плазмы.
Этому и посвящена данная диссертация.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы.
В работе были использованы следующие материалы: плазма донорская (п=8570), полученная со станций переливания крови Приволжского федерального округа;
пулы плазмы для фракционирования объёмом 5,0+0,5 л (п=443), производственные пулы (п=84), сформированные в цехе гаммаглобулинов филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио»; модельные пулы плазмы для фракционирования, контаминированные HBsAg (п=60);
образцы плазмы донорской (п=100), отбракованной по наличию HBsAg на 5 станциях переливания крови Приволжского федерального округа (гг.. Нижний Новгород, Дзержинск, Чебоксары, Канаш, Киров); образцы сыворотки крови иммунизированных против гепатита В детей, полученные в Областном вирусологическом центре г. Нижнего Новгорода (п=141);
коммерческие препараты иммуноглобулинов (195 серий) отечественных и зарубежных производителей, в том числе: 18 серий иммуноглобулина человека нормального, 144 серии иммуноглобулина человека нормального для внутривенного введения производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио» (г. Нижний Новгород), 4 серии иммуноглобулина для внутривенного введения «Иммуновенин» (г. Уфа), а также 23 серии иммуноглобулина для внутривенного введения зарубежного производства: «Пентаглобин», «Интраглобин» (Германия), «Октагам» (Австрия), «Хумаглобин» (Венгрия), «Ig VENA» (Италия).
раствор альбумина 10 % производства филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио» (г. Нижний Новгород) рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (rHBsAg) субтипов ау и ad (НІЖ «Комбиотех», г.Москва).
2.2. Методы.
2.2.1.1. Определение антигенных и антительных маркеров вируса гепатита В.
Антигенные и антительные маркеры вируса гепатита В определяли методом ИФА с помощью диагностических тест-систем отечественного производства: тест-системы иммуноферментной для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В «ИФА-HBsAg», тест-системы иммуноферментной для выявления «е»-антигена и антител к нему «ИФА-НВе» (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио», г. Нижний Новгород), тест-системы иммуноферментной для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В «ИФА-HBsAg/M», тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В «ИФА-АНТИ-HBs», тест-системы иммуноферментной для выявления антител к «соге»-антигену вируса гепатита В «ИФА-АНТИ-НВс», тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса IgM к «соге»-антигену вируса гепатита В «ИФА-АНТИ-НВс-М» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород), тест-системы иммуноферментной для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В «Вектогеп В - HBs-антиген», тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В «BeKToHBsAg-антитела-стрип», тест-системы иммуноферментной для выявления антител к «соге»-антигену вируса гепатита В «BeKToHBcAg-антитела-стрип», тест-системы
иммуноферментной для выявления антител класса IgM к «соге»-антигену
вируса гепатита В «BeKToHBcAg-IgM-стрип», тест-системы
иммуноферментной для выявления антител класса IgG к «соге»-антигену вируса гепатита В «ГепаБест aHTH-HBc-IgG-CTpnn» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), а также тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В зарубежного производства: «MONOLISA anti-HBs 3.0» (фирма «BIO-RAD», Франция) в соответствии с инструкциями по применению.
Регистрацию результатов проводили с помощью анализатора иммуноферментного «SUNRISE» фирмы TECAN (Австрия).
2.2.1.2. Количественное определение HBsAg.
Количественное определение HBsAg проводили методом ИФА с использованием отраслевого стандартного образца HBsAg вируса гепатита В «OCO-HBsAg» (ОСО 42-28-311-ОЗП). Разведения ОСО готовили в соответствии с инструкцией по применению. Калибровочный график строили по значениям ОП разведений ОСО в координатах: ось абсцисс - концентрация HBsAg в ОСО МЕ/мл, ось ординат - ОП ОСО в о.е. Используя калибровочный график, определяли значения концентрации HBsAg в исследуемых образцах с использованием программы Microsoft Excel.
Если значение оптической плотности (ОП) исследуемого образца выходило за границы диапазона от критического значения ОП (ОПкрит.) до ОП ОСО с концентрацией 2 МЕ/мл, эмпирически подбирали его разведение, которое готовили в растворе фосфатно-солевого раствора с твином (ФСР-Т). В этом случае полученное значение концентрации умножали на кратность разведения. Значения ОП неразвёдённых образцов ниже ОПкрит. считали отрицательными.
n РОССИЙСКАЯ 41 ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА
2.2.2. Методы получения компонентов тест-системы для количественного определения анти-HBs.
В качестве химических компонентов использовали фосфатно-солевой раствор (ФСР-Т), содержащий 0,9 % NaCl, 0,1 % Na2HP04, 0,1 % твин-80; раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ); цитратный буферный раствор (рН 3,9-4,1), содержащий 0,015 % перекиси водорода; 1 М раствор кислоты серной (стоп-регент).
Приготовление биологических компонентов тест-системы включало следующие стадии:
получение очищенного HBsAg;
получение иммуносорбента;
получение конъюгата;
получение контрольных отрицательного и положительных образцов.
2.2.2.1. Получение очищенного HBsAg.
В качестве исходного материала для очистки HBsAg использовали плазму крови доноров-антигеноносителей с титром HBsAg 1:2000 и выше, который определяли при помощи реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА) с использованием эритроцитарного диагностикума «РОПГА-HBsAg» (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио», г. Нижний Новгород) в соответствии с инструкцией по применению.
HBsAg получали двумя способами:
а) физико-химическим способом [Михайлов М.И., 1980], включающим
следующие этапы: прогревание плазмы; осаждение с ПЭГ-6000; пептический
гидролиз; обработка твином-80 (2%) с последующим
ультрацентрифугированием в линейном градиенте плотности сахарозы.
Очищенный данным способом HBsAg использовали для получения иммуносорбента.
б) разработанным нами методом осаждения иммунного комплекса, включающим следующие этапы: прогрев плазмы на водяной бане при температуре 60С в течение 1 ч для осаждения фибриногена; осаждение с помощью ПЭГ-6000 при конечной концентрации 4 %. Образовавшийся осадок удаляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Затем к 20 объёмам надосадочной жидкости добавляли 1 объём гипериммунной козьей антисыворотки против HBsAg. Через сутки образовавшийся осадок, состоявший из иммунных комплексов [HBsAg-aHTH-HBs], отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут и промывали от примесей других белков ресуспендированием в 0,9 %-ном растворе натрия хлорида с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Процедуру промывки иммунного комплекса повторяли 3 раза.
Промытый осадок растворяли в 2 %-ном растворе лимонной кислоты при рН 2,3, содержавшем пепсин кристаллический с активностью 3,200-4,500 единиц/мг белка (фирмы «Сигма», США) в конечной концентрации 1 мг/мл, выдерживали при температуре 37С в течение суток, затем рН смеси доводили до 7,0 добавлением 1 М раствора натрия гидроокиси. К раствору добавляли твин-80 до конечной концентрации 2 %, выдерживали при температуре (2-8) С в течение суток, затем осветляли центрифугированием при 18000 об/мин в течение 30 минут.
Полученный раствор ультрацентрифугировали на ступенчатом градиенте плотности 20 и 50 % растворов сахарозы при 27000 об/мин (70000 g) и температуре (18-22)С в течение 20 ч. Затем собирали зону над 50 % раствором сахарозы, содержавшую HBsAg, и диализовали против 0,9 %-ного раствора натрия хлорида при температуре (2-8) С в течение суток, после чего фильтровали через стерилизующую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.
Полученный данным способом препарат очищенного HBsAg имел вид слегка опалесцирующей жидкости желтоватого цвета.
Концентрацию HBsAg в очищенном препарате определяли спектрофотометрическим методом по формуле: Ei мг/мл, 2so им = 3,76 [Bourbonnais R. et al., 1975]. Полученный HBsAg содержал белок в концентрации 2-4 мг/мл и имел титр 1:200000-1:400000 в РОПГА. Препарат не взаимодействовал с антисывороткой к белкам сыворотки крови человека в реакции преципитации в геле и не содержал ДНК ВГВ при исследовании методом ПЦР. Очищенный данным способом HBsAg использовали для получения конъюгата.
2.2.2.2. Получение иммуносорбента.
Для изготовления иммуносорбента применялся метод «пассивной» адсорбции, при котором связывание антигена с поверхностью носителя обеспечивается за счёт гидрофобных взаимодействий [Стендифер Д.К., 1988]. В качестве твёрдого носителя использовали планшеты полистироловые для биохимических исследований отечественного производства «ГосНИИ «Медполимер», ООО «Биомедикал» (г. Москва) и планшеты фирмы «Nunc» (Дания). В лунки планшетов вносили по 150 мкл 0,9%-ного раствора NaCl, содержащего 1-8 мкг/мл HBsAg. Сорбцию проводили при комнатной температуре в течение 18-22 ч. После завершения сорбции избыток антигена отмывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре.
2.2.2.3. Получение конъюгата.
Конъюгат HBsAg с пероксидазой хрена RZ 3.0 (фирмы «Сигма», США) получали перйодатный методом [Егоров A.M., 1991].
К раствору, содержащему 4 мг пероксидазы хрена (RZ 3,0) в 1 мл НгО, добавляли 0,2 мл свежеприготовленного 0,02 М раствора перйодата натрия
NaJC>4 и перемешивали 20 минут при комнатной температуре. Полученный раствор диализовали против 0,001 М Na-ацетатного буфера (рН 4,4) в течение ночи при 4С. К модифицированной ПХ добавляли 20 мкл 0,2 М Na-карбонатного буфера (рН 9,5) и сразу же 8 мг антигена в 2 мл того же буфера. Раствор перемешивали два часа при комнатной температуре, добавляли 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора NaHB4 (4 мг/мл) и перемешивали два часа при 4С. Полученный конъюгат диализовали против физиологического раствора.
Конъюгат хранили в виде 10-кратного концентрата в 50%-ном растворе глицерина с добавлением нормальной сыворотки крови доноров до 10 %.
2.2.2.4. Получение контрольного отрицательного образца (К") и контрольных положительных образцов (К+ю , К+50 , K+ioo).
Для получения К" плазму донорскую нормальную, не содержащую маркеров вируса гепатита В, инактивировали прогреванием в термобане в течение 10 ч при температуре 60 С, затем добавляли трихлорметан (хлороформ) до конечной концентрации 10 %, выдерживали 1 ч на магнитной мешалке при комнатной температуре, затем ночь при температуре от 2 до 8 С и центрифугировали в течение 1 ч при 18000 об/мин. В качестве консерванта использовали фенол до конечной концентрации 0,2 %.
Для приготовления контрольных положительных образцов (К+ю , К+50 , К+юо) использовали разработанный нами раствор специального состава и иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения (производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «НППБП «ИмБио», г. Нижний Новгород), который добавлялся в матричный раствор до концентрации анти-HBs 10, 50 и 10Q МЕ/л.
Раствор готовили следующим образом: 5 г натрия хлорида; 0,5 г натрия фосфорнокислого 2-замещенного 12-водного; 1,25 г фенола, 50,0 г мальтозы
последовательно растворяли в 0,2 л воды очищенной при перемешивании на магнитной мешалке, добавляли 0,25 л нормальной донорской плазмы и доводили объём раствора до 0,5 л водой очищенной. Значение рН полученного раствора устанавливали 4,6.
В качестве стандарта для определения концентрации анти-HBs в контрольных положительных образцах (К+ю, К+50 и К+юо) использовали разведения отраслевого стандартного образца иммуноглобулина человека против вируса гепатита В (ОСО 42-28-320-00). Определение проводили традиционным способом с использованием калибровочного графика, построенного в программе Microsoft Excel.
2.2.3.1. Выявление ДНК ВГВ методом ПЦР.
ДНК ВГВ в плазме, содержащей HBsAg, и в модельных образцах определяли методом ПЦР с использованием диагностических систем производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва): «ДНК-сорб-Б» для выделения ДНК из исследуемого материала и «АмплиСенс-HBV» для амплификации консервативного участка генома ВГВ в соответствии с инструкцией по применению. Амплификацию проводили в режиме матричного регулирования температуры на приборе «Ампли-250» фирмы «Биоком» (г.Москва).
Выявление продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 2 %-ном агарозном геле, электрофореграммы просматривали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете и фотографировали на фотоплёнку «Микрат 300». Впоследствии обработка изображения проводилась при помощи компьютерной программы «Биотест» фирмы «Keklab» (г.Москва). В положительных пробах, содержащих ВГВ, в геле обнаруживались специфические полосы, соответствующие амплифицированному фрагменту
ДНК размером 470 пар нуклеотидов. В отрицательных пробах специфические полосы не выявлялись.
