Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что лепра - одно из самых древних среди известных инфекционных заболеваний человека, эффективной вакцины против нее до сих пор не существует. Научные исследования, направленные на разрешение этой проблемы, в значительной мере ограничиваются отсутствием воспроизводимых методов культивирования M.leprae in vitro. Только доказательство C.C.Shepard (1960) возможности локального размножения M.leprae в подушечках лапок мышей, а также создание в 1971 г. W.F.Kirchheimer и E.E.Storrs модели генерализованной лепры на девятипоясных броненосцах позволили начать экспериментальные работы по получению противолепрозной вакцины. Модель Shepard стала общепринятой системой для оценки протективных свойств вакцины, а экспериментально зараженные броненосцы явились источником для получения достаточных количеств бактериальной массы M.leprae,
В 1976 г. ВОЗ была создана Специальная Программа по иммунологии лепры (IMMLEP), конечная цель которой заключалась в разработке противолепрозной вакцины. В рамках этой Программы разрабатывались четыре основных подхода к созданию вакцины:
-
Использование культивируемых непатогенных микобактерий, в частности M.vaccae, M.W, M.ICRC (Stanford J.L. с соавт., 1984; Deo M.G. с соавт.,1983; Talwar G.P.,1983; Chirmule N.B. с соавт., 1988; Ganapati R.,1989; Chiplunkar Sh.,1993; Yadava A.,1993; Chaturvedi V. с соавт.,1995; Vallishayee R.S. с соавт., 1996; Gupta M.D. с соавт., 1992,1996).
-
Создание авирулентных форм M.leprae путем инактивации генов, кодирующих факторы вирулентности. Поскольку возбудитель лепры до сих пор не получен в культуре, и факторы вирулентности его не определены, этот подход в настоящее время является только теоретической предпосылкой (Mahan M.J. с соавт.„1993)
-
Разработка субъединичной вакцины на основе одного или нескольких белковых антигенов, специфичных для M.leprae. Исследования антигенов M.leprae и их эпитопов пока не привели к выявлению бесспорно протективных антигенов (Lamb F.I. с соавт., 1988; Nomaguchi Н. с со-авт.,1991; Vega-Lopez F. с соавт.,1993; Menz В. с соавт., 1993; Convit J. с соавт.,1993; Thole J.E.R. с соавт., 1995; Winter N. с соавт.,1995).
4. Повышение протективного противолепрозного эффекта вакцины БЦЖ различными методами, в частности с использованием методов генной инженерии, а также путем модификации дозы, режима вакцинации,
места введения вакцины (Bloom B.R. с соавт., 1989; Stover С.К. с соавт., 1991,1993; Aldovini А. с соавт., 1991,1993).
К настоящему времени в рамках Программы IMMLEP были испытаны в полевых условиях вакцина БЦЖ, а также вакцина Convit, представляющая собой комбинацию вакцины БЦЖ и убитых нагреванием МЛергае, выделенных из тканей экспериментально зараженных броненосцев (МЛергае А). Результаты испытаний вакцинации БЦЖ показали невысокую и вариабельную степень ее защиты (20-80 %), преимущественно направленной против олигобактериальных форм лепры (Noordeen S.K., 1986, Bagshawe А. с соавт., 1989). Комбинированная вакцина БЦЖ + МЛергае А не обеспечила более высокой степени защиты, чем дает одна лишь БЦЖ (Karonga Prevention Trial Group, 1996). Еще в 8-ом Отчете Специальной программы исследований и подготовки кадров по тропическим заболеваниям ВОЗ (1987) отмечалось несовершенство комбинированной вакцины Convit, ее дороговизна, отсутствие надежных методов стандартизации отдельных партий, невозможность полной очистки микобактерий от тканей броненосцев.
Следует отметить, что по данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется от 500 до 800 тысяч новых случаев заболевания лепрой, при этом количество вновь выявленных больных не имеет тенденции к снижению. Высокая заболеваемость в эндемичных по лепре странах и отсутствие на сегодняшний день высокоэффективной вакцины против лепры свидетельствуют об актуальности поиска новых кандидатов в противолепрозные вакцины.
Цель работы Выявление препаратов, обладающих выраженной про-тективной активностью при экспериментальной лепрозной инфекции. Задачи работы.
-
Изучить на модели экспериментальной лепры протективные свойства препаратов, приготовленных из 25 культивируемых штаммов микобактерий, выделенных от больных лепрой, экспериментально зараженных МЛергае животных, а также из почвы, поддерживаемых в музее культур НИИ по изучению лепры МЗ РФ.
-
Выяснить степень протективности синтетических и полусинтетических препаратов, полученных на основе специфического для МЛергае
синтетического антигена З.б-ди-О-метил-Р-В-глюкопиранозы при экспериментальной лепрозной инфекции.
-
Получить дополнительные данные о биологических свойствах ми-кобактерий, наиболее перспективных для разработки противолепрозных вакцин.
-
Изучить зависимость протективных свойств от доз, режимов и способов введения микобактериальных и синтетических препаратов.
Научная новизна исследования заключается в том, что протективные свойства препаратов из культивируемых штаммов микобактерий, выделенных в НИИ по изучению лепры, почвенных M.lufu, а также искусственных препаратов, полученных на основе отечественного синтетического углевода 3,6-ди-0-метил-(3-В-глюкопиранозы, изучены впервые.
Впервые установлено, что культивируемые штаммы микобактерий М.01 и М.011, выделенные из патологического материала от больных лепрой, а также M.lufu, изолированная из почвы, обладают наиболее выраженной способностью задерживать размножение М.іергае в подушечках ланок мышей, зараженных по методу Shepard.
При экспериментальной лепрозной инфекции в качестве модельных "вакцин" применялись искусственные препараты на основе специфического для М.іергае синтетического антигена в полностью синтетическом и полусинтетическом вариантах. Показано, что полностью синтетическая вакцина не способна задерживать локальное развитие лепрозной инфекции, а полусинтетические препараты обладают протективными свойствами, но менее выраженными, чем препараты из микобактерий.
Определены оптимальные дозы, режимы, способы введения микобактериальных и искусственных препаратов, позволяющие получать максимальные протективные эффекты при вакцинации мышей.
Получены данные по культурально-биохимическим и иммунохими-ческим характеристикам микобактерий, являющихся наиболее перспективными для разработки противолепрозных вакцин.
Теоретическая и практическая значимость работы. Обнаружение защитных свойств против экспериментальной лепры у культивируемых штаммов микобактерий M.lufu, М.01 и М.011 позволяет рекомендовать последние в качестве наиболее перспективных для разработки высокоэффективной противолепрознои вакцины. Данные по определению оптимальных доз, режимов и способов введения препаратов из M.lufu, М.01, М.011 жи-
вотным, а также культурально-биохимических и иммунохимических характеристик штаммов окажут помощь при дальнейших исследованиях по разработке противолепрозиой вакцины. Получен патент на изобретение «Способ иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции» №2135196.
Данные, установленные в ходе определения оптимальных доз антигена и режимов вакцинации животных синтетическими препаратами, при которых достигается наиболее выраженный протективный эффект, можно использовать для совершенствования полусинтетических препаратов с целью повышения их протективных свойств.
Основные положения, выносимые на зашиту.
-
Задержка развития локальной лепрозной инфекции в подушечках лапок мышей, зараженных по Shepard, возникающая в ответ на однократную вакцинацию животных препаратами из живых M.lufu, а также убитых М.01 и М.011, свидетельствует о наличии у данных штаммов ми-кобактерий протективных свойств, более выраженных, чем у живой вакцины БЦЖ.
-
Иммунизация полностью синтетическим препаратом ДМГ-ПАА-МДП не влияет на размножение M.leprae в лапках зараженных мышей. Полусинтетические препараты ДМГ-ПАА-БЦЖ и ДМГ-ДАД-БЦЖ обнаруживают протективные свойства только при многократном их введении мышам и значительно уступают по показателям протективности мико-бактериальным препаратам.
3. Близость культивируемых штаммов M.lufu, М.01 и М.011 по вы
раженности протективного действия, культурально-биохимическим свой
ствам, антигенному составу, белковым спектрам, а также антигенное род
ство с M.leprae, позволяют рекомендовать данные штаммы для разработки
противолепрозных вакцин.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Всероссийском съезде дерматологов и венерологов (Челябинск, 1989), 1-м Международном симпозиуме «Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях» (Москва, 1992), 15-ой конференции молодых ученых, посвященной 30-летию ЦНИИ эпидемиологии и микробиологии (Астрахань, 1992), юбилейной научной конференции Астраханского государственного медицинского института к 75-летию со дня основания (Астрахань, 1993), симпозиуме «Иммунодиагно-
етика и патогенез болезней, вызываемых микобактериями» (Астрахань 1994), научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию Академии медицинских наук (Москва, 1994), конференции «Эпидемиология, клиника, диагностика-, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней» (Тамбов, 1994), областных научно-медицинских обществах микробиологов, эпидемиологов, паразитологов (Астрахань, 1989, 1996, 1998), дерматовенерологов (Астрахань, 1998), конференции, посвященной 50-летию НИИ по изучению лепры (Астрахань, 1998), 15-м Международном конгрессе по лепре (Китай, 1998).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, утверждено 1 рацпредложение, получено 1 решение Роспатента на выдачу патента на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных данных, обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 208 литературных источников (44 отечественных и 164 зарубежных). Материалы диссертации изложены на ПО страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 6 рисунков.
