Введение к работе
Актуальность работы.
До настоящего времени стандартизация и унификация методов исследования коагуляционного звена гемостаза являются проблемой международного значения (Барроуклиф Т.В., 1995; Гаранина Е.Н. и савт.,1995; Тарасова Л.Н. и со-авт.,1996; Taberner D.A. et al., 1990; Gram J. et al.,1996). Одной из наиболее важных составляющих, обеспечивающих объективность результатов исследования гемостаза, является применение качественных лиофилизированных биологических диагностикумов с длительным сроком хранения (Andrew М. et al., 1995; Becker В. et al., 1994; Daka .J.N. et al.,1989; Ts'ao C, Neofotistos D., 1994; Barrowcliffe T.W., Kirkwood T.B.L./1980). Использование приборов также требует включения в тест-системы коммерческих лиофилизированных реагентов высокого качества, имеющих длительный срок годности (D*Angelo A. et al.,1989;Houbouyan L. et al.,1996; Poller L. et al.,1994).
Проведение противотромботической терапии опасно без лабораторного контроля, объективность которого зависит от качества и специфичности используемых методов исследования и тест-реагентов (Гаврилов О.К.,1981; Надь И., 1Э86; Кондратьева Т.Б. с соавт.,1995; Loeliger E.A.,Lewis S.M. 1981; Wagner H.E. et al., 1986,-Becker D. et al.,1993; Bophy M. et al.,1993). Основным методом контроля тер ший антикоагулянтами непрямого действия до сих пор остается тест Квика, выявляющий с тканевым (полным) тром-бопластином активность факторов лротромбинового комплекса (ПК), в том числе фактора V, который антикоагулянтами не угнетается (Banghman D.R.,Biggs R.,1973; Кудряшов Б.А.-, 1975). Более объективно степень изменения ПК при лечении антикоагулянтами отражает тест Оврена. Этот метод можно применять также при определении специфической активности концентрата факторов II+VII+IX+X (препарата PPSB) и как источник фибриногена при исследовании активности перечисленных прокоагулянтов в биологических жидкостях (Долгов В.В.с соавт.,1996; Тарасова Л.Н.,1986). Для воспроизведения метода в тест-систему включают субстрат, лишенный комплекса факторов II+VII+IX+X. Нередко используют натив-ные реагенты местного приготовления, хранящиеся в заг-юро-
женном состоянии не более 3 месяцев (Балуда В.П. с авт.,1980; Долгов В.В. с соавт.,1996).
Наличие коагулопатии может быть установлено лишь ': определении дефицита того или иного фактора. Для диффер цирования гемофилии А и В используют два типа методов і ределения антигемофильных факторов: одно- и двухстадийні В настоящее время предпочтение отдается одностадийным, і нованным на тесте АПТВ, который стандартизован по контаї ной и фосфолипидной фазам. В тест-системы одностадийі методов определения коагуляционной активности факто] VIII и IX (ф.ф.УШ:К и 1Х:К) необходимо включать соотв< ствующие субстраты, лишенные указанных прокоагулянтов содержащие избыток других. Оптимальным сырьем для полу ния таких субстратов является плазма больных гемофилией и В (Barrowcliffe Т.W.,1990). В большинстве отечестве ных лабораторий используют нативные субстраты, имеющие * продолжительный срок хранения в замороженном состоян* нередко не тестированные на активность факторов и налт ингибиторов.
Из-за большого количества используемых реактивов и ъ> тодов затруднительно сравнивать результаты исследовани проведенных не только в различных лабораториях, но неред - в разное время в одних и тех же (Левченко Л.В. с соавт 1989; Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., 1988; Баркаг 3.С.1991). В связи с этим в ряде стран с целью унификац и поьышения воспроизводимости методов проводили пересыо и сравнительное изучение их и реагентов. Подобные работы наиболее полном виде выполнены в Национальном институ биологических стандартов и контроля Великобритан (Barrowcliffe T.W., Kirk-wood T.B.L., 1978; Barrowclif Т.W.,1984; Bar-rowcliffe T.W. et al.,1983) и в Центральн лаборатории службы Красного Креста в Нидерландах (Ov J.,1984).
Вопросами унификации и стандартизации методов исслед вания антигемофильных факторов у больных гемофилией' и криопреципитате в нашей стране занималась проблемная кі миссия "Патология гемостаза" РАМН. Ее рабочая группа о< новными причинами ошибок при определении активности факті ров VIII и IX признала длительное хранение образцов в ра: веденном виде и использование нестандартных реагентов кефалинов и субстратов (Баркаган З.С.,1991; Елыкомс
В.А.,Цалихин А.Д.,1991). В связи с этим создание лиофилизированных субстратов, стандартизованных и имеющих длительный срок хранения, является актуальной задачей. Решение её позволит стандартизовать ряд основных методов исследования коагуляционного звена гемостаза, необходимых для практического здравоохранения. Цель исследования.
Разработка технологии получения субстратов, пригодных для выполнения методов исследования прокоагулянтов в тесте Оврена и одностадийных методах определения активности факторов VIII и IX.
Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать технологию получения субстратной плаз
мы без факторов II+VII+IX+X.
2. Изучить возможность использования плазмы крови
больных гемофилией А и В, взятой при проведении лечебных
процедур, в качестве сырья для изготовления субстратной
плазмы без фактора VIII:K и без фактора 1Х:К.
-
Разработать технологию получения субстратной плазмы без фактора VIII:К.
-
Разработать технологию получения субстратной плазмы без фактора IX:К.
5. Изучить возможность использования субстратов без
ф.фЛШіК и ІХ:К в одностадийных методах исследования ак
тивности этих прокоагулянтов.
Научная новизна.
Впервые разработана и запатентована технология получения лиофилизированной субстратной плазмы без факторов II+VII+X+IX для определения активности протромбинового комплекса в тесте Оврена (патент РФ N 2013778 от 30.05.1994г.).
Разработана технология получения лиофилизированных субстратов без J.VIIIiK и ф.1Х:К со сроком хранения до 2 лет; в качестве сырья использована кровь и плазма больных гемофилией А и В, полученная при проведении им лечебного кровопускания или плазмафереза. Впервые прослежено влияние консервирующих добавок на сохраняемость прокоагулянтов лиофилизированных субстратов при длительных сроках хранения.
Практическая значимость работы.
На основании полученных результатов составлена норм тивная документация:
"Типовой регламент производства плазмы субстрати без факторов II+VII+IX+X" и инструкция по применению, р комендованные к утверждению на комиссии по стандартизац ГНЦ РАМН (протокол N 3 от 25.11-94г.) и утверждены дире тором КНИИГПК 07.06.95г.
"Типовой регламент производства плазмы субстратной б фактора VIII:К (реактива)" и инструкция по применению, к торые рекомендованы к утверждению комиссией по стандарт; зации ГНЦ РАМН 25.11.94г., протокол N 3 и утверждены д: ректором института 07.06.95г.
"Лабораторный регламент производства плазмы субстра1 ной без фактора IX:К" и инструкция по применению, утве] жденные на Ученом совете КНИИГПК 19.07.97г., протокол N В стадии разработки и утверждения технические условия і реагент "Плазма субстратная для определения активное фактора.IX:К". На комиссии .по лабораторным реагентам Комі тета по' новой медицинской технике МЗ РФ принят проект ТУ определены базы медицинских испытаний (протокол N 2 < 30.03.1998г.).
Использование созданных лиофилизированных субстрате освобождает исследователей от необходимости получения н< тивных реагентов с меым сроком хранения и позволяет стаї дартизовать некоторые методы исследования коагуляционноз звена гемостаза.
Апробация работы. Материалы работы изложены на Всесоюзне конференции "Физиология и патология гемостазг (г.Полтава,1991), научно-практической конференции "Клині ческая лабораторная диагностика - состояние и перепекти вы"(г.С-Петербург,1996), III Всероссийском съезде гематс логов и трансфузиологов (г.С-Петербург, 1996), а тага итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии переливания крови (1990-1998).
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Ва защиту выносятся следувяцие положения:
1. Технология получения субстратной плазмы без факте ров II+VII+IX+X для определения активности протромбинової комплекса в тесте Оврена.
-
Технология получения субстратной плазмы без факторе VIII:К и субстратной плазмы без фактора IX:К для дифференциальной диагностики гемофилии А и В.
-
Обоснование пригодности разработанных реагентов дл; стандартизации некоторых методов исследования коагуляци-онного звена гемостаза.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 13"i страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, указателя цитируемой литературы, который содержит 177 наименований работ, в ток числе 76 отечественных и 101 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 2 графиками.
