Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная клиническая трансфузиология основана на применении компонентов крови, однако лейкоцитные концентраты не получили до сих пор широкого распространения в лечебной практике. Лей ко концентрат с заместительной целью может использоваться при миело-токсических агранулоцитозах, возникающих на фоне высокодозной химиотерапии больных онкогематологическими заболеваниями, а также при лейкопениях различного генеза, сопровождающихся септицемией, лихорадкой и клиническими признаками тяжелой локальной или ген фал и зо ванной инфекции (РумянцевА.Г.,Аграненко В.А., 1997; Алексеев НА .,2002).
Трансфузия аутологичных или донорских лейкоцитных концентратов позволяет заместить утрэненную функцию клеточного звена иммунитета особенно в тех случаях, когда иммуностимулирующая терапия неэффективна или противопоказана(Попович A.M., Гусев СВ., 1995;Балашов ДН.,2002).
Одной из причин, затрудняющих применение лейкоцитов, является отсутствие эффективного метода их низкотемпературного консервирования. Ранее предложенные криопротекторы- глицерин, полиэтил єно ксид (ПЭО-400) -не в полной мере обеспечивают защиту лейкоцитов во время замораживания. Диметилацетамид (ДМАЦ), ПЭО-400 - не нашли применения в России, т.к. отсутствует их производство в нашей стране. Ди метил сульфоксид (ДМСО) не разрешен для внутривенного введения Фармакологическим комитетом МЗ РФ.
Лечебная доза лейкоцитов, по данным разных авторов, составляет в среднем 2,5 х 1010 клеток. Выделение такого количества клеток достаточно сложно и возможно с помощью фракционаторов крови, которые позюляют решить проблему получения больших количеств лейкоцитов (до 5,0 х Ю10) от одного донора.
Ограничение применения л ей ко концентр эта в клинической практике связано с низкой устойчивостью нативных лейкоцитов, особенно гранулоцити в, при хранении в условиях положительных температур. Установлено, что у этих клеток, ввиду быстрого истощения энергетического потенциала через
короткий промежуток времени нарушаются морфофункциональные свойства, в частности, уже через 24-48 часов после кроводачи полностью исчезает способность кфагоцитозу (Цуцаева А.А.И соавт., 1983).
Температуры, близкие к 0С, не нашли применения для хранения лейкоцита в, т.к в этом диапазоне клетки быстро теряют структуру и разрушаются без постоянного поддержания энергетических затрат и в связи с накоплением продуктов метаболизма (Lin P.S., Lionetti F.S ; 1980; АбезгаузН.Н., Мартьиова В.А., 1981). Длительное хранение лейкоцитов в функционально полноценном состоянии достигается при использовании ультранизких температур в условиях медленного замораживания (1-3С/мин) под защитой криофилактиков и стабилизирующих добавок. Наиболее изученными, по данным JA. Cavins , LDjerassi, (1968); Н.Н. Абезгауз, В.Н. Трошиной (1981); СВ. Ермолович, В.А. Аграненко (1996), являются способы консервирования гранулоцитов при температурах от - 150С до - 196С с ДМАЦ. Указанный метод криоюнсерви-рования обеспечивает сохранность гранулоцитов (по резистентности к витальным красителям) до 70 - 80 % и их функциональную полноценность до 50% от исходной. Отмеченные способы требуют применения дорогостоящего оборудования и жидкого азота, что делает технологию криоконсервирования сложной и экономически затратной. Методики консервирования лейкоцитов при температурах до -80С в настоящее время не разработаны.
Исходя из вышеуказанных фактов, очевидна актуальность создания нового эффективного метода крио кон сервирован и я концентрата лейкоцитов и в разработке крио консерванта, который был бы нетоксичен, обеспечивал достаточную морфологическую и функциональную сохранность клеток и не требовал их отмывания послеразмораживания.
Цель исследования
Целью настоящей работы явилось создание метода криоконсервирова-ния лейюцитного концентрата при температуре-80С с использованием элек-тро морозил ьни Ю в.
Задачи исследования
-
Разработать лекарственную форму криоконсерванта для замораживания лейкоцитов, содержащего вещество гексаметиленбистетраоксиэтилмоче-вину (ГМБТОЭМ), нетребуюшуюотмыванияпослеоттаиваниябиообъекта.
-
Разработать способ консервирования лейкоцитов путем нелинейного быстрого двухступенчатого замораживания до -80Спри использовании предложенного ограждающего раствораи электро морозильников.
3. Изучить функциональные и морфологические свойства лейкоцита в,
криоконсервированных по предложенному методу, в процессе хранения и
поел ераз мораживания.
4. Провести биологические испытания предложенного консерванта. Оп
ределить переносимость экспериментальными животными внутривенного вве
дения лей ко цитов, консервиро ванных замораживанием по новому способу.
Научная новизна. Разработан и экспер и ментально изучен оригинальный крио консервант для замораживания лейкоцитов на основе криофилакти-ческого вещества ГМБТОЭМ, не требующий отмывания после оттаивания клеточной суспензии.
Создана новая программа нелинейного быстрого двухступенчатого замораживания до -30 С с помощью аппарата Криостат и электро морозильника на-80С. Предложен метод замораживания биопродукта в отечественных полимерных контейнерах одноразового применения "Компопласт 300", упакованных в холдеры оригинальной конструкции и определены условия их дальнейшего хранения в низкотемпературном электрохолодильнике.
Экспериментально обоснованы режимы консервирования и хранения лейкоцитов, обеспечивающие морфологическую и функциональную сохранность л ей ко концентрата при -80С, установлена переносимость взвеси лейкоцитов, криоконсервированных по ноюму способу, при внутривенном введении лабораторным животным.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных биологических, физических, морфологических, функциональных,
цитохимических экспериментальных исследований подтверждают выраженный криозащитный эффект нового криоконсерванта на основе ГМБТОЭМ для лейкоцитов при низкотемпературном замораживании.
Показано, что при использовании установленной оптимальной концентрации оригинального криопоротектора клетки после размораживания сохраняют свои морфо функциональные свойства и ультраструктурную организацию на достаточном уровне. Биологические свойства примененного консерванта для лейкоцитного концентрата позволяют рекомендовать его дальнейшего изучения в клинических условиях.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Оригинальный криоконсер вант для лейкоцитов на основе отечественного криопротектора ГМБТОЭМ нетоксичен, апирогенен и не требует отмьь ванияотсуспензии клетокпослеееоттаивания.
-
Предложенный криоконсер вант на основе ГМБТОЭМ позволяет обеспечить высокую сохранность и функцию лейкоцитов при низкотемпературном замораживании по нелинейной программе и хранении при -80С в электроморозильнике.
-
Новый способ низкотемпературного консервирования при 80С может быть рекомендован для замораживания лейкоцитов человека в полимерных контейнерах "КомпопластЗОО" и последующих клинических испытаний.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях в ГУ КНИИГПК(1997,1998, 1999, 2000), 25-ом Международном конгрессе по переливанию крови (Осло, Норвегия 1998), республиканской конференции «Актуальные вопросы трано фузиологии» (Киров, 2000), научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С. Петербург, 2000), съезде Российского общества физиологов им И Л. Павлова ( Казань 2001), а также заседаниях Кировского областного научного общества гематологов и трансфузио-логов(1999,2000).
Личное участие автора в получении результатов. Автором лично разработан новый крио консервант, проводилась заготовка л ей ко цитно го концентрата, определена морфологическая и функциональная сохранность клеток до замораживания и после оттаивания, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов.
Объем и структура диссертации. Диссертация представляет собой рукопись объемом 99 страниц компьютерного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 171 наименований, в том числе 114 отечественных и 57 зарубежных источников. Работа иллюстрирована23 таблицами и 6 рисунками.
Похожие диссертации на Низкотемпературное (-80°C) консервирование лейкоцитных концентратов : Экспериментальное исследование
![Консервирование тромбоцитов замораживанием по экспоненциальной программе при - 80[О]С (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4408/184042.png "Консервирование тромбоцитов замораживанием по экспоненциальной программе при - 80[О]С (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Кузнецов Константин Васильевич")
