Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ
ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА И
ВОЗМОЖНОСТЯХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ) 13
Факторы генетической предрасположенности 13
Иммунный статус больных рассеянным склерозом 17
Изменения соотношения и количеств лимфоцитов различных субпопуляций у больных PC 17
Продукция цитокинов в ЦНС 21
Продукция цитокинов клетками периферической крови 28
Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови... 31 1.2.4 Особенности различных типов течения и вариантов PC 31
1.3 Иммуномодулирующая терапия 39
Влияние препаратов IFN-P-lb на иммунологическую реактивность.. 40
Влияние кополимера-1 на иммунологическую реактивность 44
Эффекты метилпреднизолона 50
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
Общая характеристика больных 53
HLA-типирование 62
Иммунофенотипирование 62
Определение цитокинового статуса 63
Индукция пролиферации мононуклеаров 65
Методы статистической обработки полученных результатов 66
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 68
Антигены комплекса гистосовместимости у больных рассеянным склерозом 68
Параметры иммунитета у больных в различные фазы процесса 74
Параметры клеточного иммунитета 74
Изменения показателей цитокинового звена иммунитета 82
Изменения пролиферативной активности лимфоцитов 90
3.3 Параметры иммунитета у больных с благоприятным и неблагоприятным
вариантами рассеянного склероза 92
Параметры клеточного иммунитета 94
Изменения показателей цитокинового звена иммунитета 98
Иммуногенетическая рестрикция продукции цитокинов при рассеянном склерозе 103
Изменение иммунологических параметров на фоне проведения иммуномодулирующей терапии интерфероном-бета-lb, кополимером-1 и метилпреднизолоном НО
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 122
ВЫВОДЫ 138
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 140
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 141
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АПК - антигенпредставляющая клетка
АПТ - активная стадия прогредиентного течения PC (хроническое
прогрессирование)
БРС - благоприятный вариант PC
ГКГ - главный комплекс гистосовместимости
ГЭБ - гемато-энцефалический барьер
ИФ А - иммунноферментный анализ
МАГ - миелин-ассоциированный гликопротеин
ММП - матриксные металлопротеиназы
МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин
МП - метилпреднизолон
мРНК (mRNA) - матричная рибонуклеиновая кислота
МРТ - магнитно-резонансная томография
НРС - неблагоприятный вариант PC
ОБМ - основной белок миелина
ОРТ - обострение ремиттирующего PC
ПК - периферическая кровь
ПЛП - протеолипидный протеин
РРТ - ремиссия ремиттирующего PC
PC - рассеянный склероз
СМЖ - спинномозговая жидкость
СПТ - стабилизация прогредиентного PC
ТКР - Т-клеточный рецептор
ФГА (РНА) - фитогемагглютинин
ЦНС - центральная нервная система
ЭАЭ (ЕАЕ) - экспериментальный аллергический энцефаломиелит
APL - altered peptide ligand
BDNF - brain-derived neurotrophic factor
CD - кластер дифференцировки
5 CMV - цитомегаловирус CNTF - ciliary neurotrophic factor EBV - вирус Эпштейн-Барра EDSS - расширенная шкала степени инвалидизации FasL - Fas-лиганд
FITC - флюоресцеинизотиоционат, флюоресцирующий краситель HLA - лейкоцитарный антиген человека HTLV - человеческий Т лимфотропный вирус
ICAM - адгезионная молекула, опосредующая межклеточные контакты IFN - интерферон IGF-1 - insulin-like growth factor IL - интерлейкин LIF - leukaemia inhibitory factor NGF - nerve growth factor NK-клетки - естественные киллерные клетки PBS - фосфатно-солевой буфер РЕ - фикоэритин, флюоресцирующий краситель TGF - трансформирующий ростовой фактор Th (Тх) - Т-хелперы TNF - фактор некроза опухолей TRAIL - TNR-related apoptosis inducing ligand
VCAM - адгезионная молекула, опосредующая прилипание клетки к стенке сосуда VLA - антиген поздней активации, интегрин
Введение к работе
Рассеянный склероз (PC) - хроническое прогрессирующее заболевание центральной нервной системы, проявляющееся рассеянной неврологической симптоматикой и патоморфологически характеризующееся образованием очагов разрушения миелина в белом веществе головного и спинного мозга (Гусев Е.И. и соавт., 1997). Обычно заболевание начинается в молодом возрасте и, в типичных случаях, изначально имеет ремиттирующее течение, с наличием периодов обострений и ремиссий. В дебюте заболевания ремиссии сопровождаются полным регрессом неврологической симптоматики, однако в течение 10 лет около 40% больных с ремиттирующим течением входят в прогредиентную фазу (McDonnell G.V., Hawkins S.A., 2002). В 10-15% случаев наблюдается первично-прогредиентное течение PC, когда заболевание характеризуется неуклонным нарастанием неврологического дефицита, при этом периоды хронического прогрессирования могут чередоваться с периодами стабилизации (Головкин В.И., 2003). Неуклонное прогрессирование, приводящее к инвалидизации людей трудоспособного возраста, и «омоложение» контингента больных определяют важность проблемы своевременной диагностики и лечения больных PC не только в медицинском, но и в социально-экономическом аспекте (Зинченко А.П., 1973, Хондкариан О.А. и соавт., 1987, Гусев Е.И. и соавт., 1997, Завалишин И.А., Головкин В.И., 2000).,
В патогенезе воспаления и демиелинизации при PC большое значение имеют аутоиммунные механизмы, в запуске которых важную роль играет генетическая предрасположенность, реализуемая под воздействием патогенных факторов внешней среды (Arnason B.G.W., 1996).
Наличие генетической предрасположенности к PC в настоящее время не вызывает сомнений, данные многочисленных популяционных и особенно миграционных исследований убедительно подтверждают участие
7 наследственных факторов в развитии заболевания (Бадалян Л.О. и др., 1987, Ebers G.C., Sadovnick A.D., 1994, Compston D.A.S. et al., 1995). Установлено, что генетические факторы могут не только обуславливать предрасположенность к PC, но влиять на особенности клинической картины, патогенеза, течения PC и прогноз заболевания (Gorodezky С. et al., 1986; Hillert J. et al., 1992; Runmarker В et al., 1994; Dyment D.A. et al., 1997). Наиболее сильные ассоциации прослеживаются с генами и антигенами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II: гаплотипом DRB1*1501-DQA1*0102-DQB10602 и антигеном HLA-DR2 (Dhib-Jalbut S. et al., 1990, Hillert J., Olerap O, 1993, Ghabanbasani M.Z. et al., 1995).
Предполагается, что триггерным фактором, реализующим генетическую предрасположенность к PC и запускающим иммунопатологический процесс, является вирусная инфекция, проявляющая свое действие в периферических органах иммунной системы и активирующая Т клетки, которые, в свою очередь преодолевая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), проникают в ЦНС, где разрушают миелин и олигодендроциты (Arnason B.G.W., 1996). При этом гиперреактивность иммунной системы в ответ на действие триггерного фактора играет ключевую роль. Влияние вирусов на иммунную систему может проявляться как неспецифической антигенной стимуляцией, так и, благодаря молекулярной мимикрии и перекрестному реагированию, - запуском аутоиммунных реакций в отношении компонентов миелина (Гусев Е.И. и др. 1997).
Развитие реакции клеточно-опосредованной гиперчувствительности замедленного типа, реализующейся при участии Т хелперов 1 типа, предваряет развитие клинической симптоматики и сопровождается повышением продукции провоспалительных цитокинов, что наблюдается за 2 недели до появления первых неврологических симптомов (Beck J. et al., 1988).
Выраженность иммунопатологических реакций определяется активностью антигенпредставления в ткани, активностью адгезии клеток к
8 эндотелию сосудов, степенью активации Т клеток, которая при ответе на некоторые антигены может иметь поликлональный характер. Решающее значение в развитии иммунопатологического процесса в ЦНС имеет баланс активационных и супрессорных цитокинов, их растворимых рецепторов и ингибиторов (Столяров И.Д., Осетров Б.А., 2002).
Предшествующее обострению преобладание продукции
провоспалительных цитокинов, продуцируемых преимущественно Т хелперами 1 типа: IL-1, IFN-y, TNF-cc, и оказывающих, помимо иммунорегуляторного, прямое повреждающее действие на миелин и олигодендроциты, сменяется нарастанием продукции противовоспалительных цитокинов, секретируемых Т хелперами (Тх) 2 типа: IL-4, IL-10, TGF-J3 (Lu C.Z. et al., 1993, Rieckman P. et al., 1994, Navikas V. et al., 1995), что ограничивает повреждение собственных тканей организма и снижает активность иммунопатологического процесса.
Получены данные, свидетельствующие о том, что особенности уровней продукции цитокинов у больных PC отражают не только стадию процесса, но также тип течения PC (Sharief М.К. et al., 1991) и тяжесть демиелинизирующего процесса (Arnason B.G.W., 1996). Были сделаны предположения о наличии связи между преобладанием Txl или Тх2 иммунного ответа и предрасположенностью к развитию различных клинических форм PC: азиатского (оптикомиелита) или классического PC (Yamamura Т., 2002).
За последние годы достигнут значительный прогресс в понимании механизмов развития демиелинизирующего процесса при PC и разработке терапевтических подходов, способных влиять на патологический процесс при PC. Появление нового направления в лечении PC - профилактики обострений и предотвращения прогрессирования заболевания - стало следствием многочисленных исследований, посвященных роли цитокинов в патогенезе PC, в результате чего стало возможным применение цитокиновых препаратов для лечения больных PC. Широко применяемыми с этой целью препаратами являются интерфероны, наибольшая эффективность была продемонстрирована
9 при применении интерферонов-бета-lb. Важным достижением последних лет в терапии PC принято считать появление препарата другого класса - кополимера-1, успешное применение которого связывают с его способностью вырабатывать толерантность Т лимфоцитов к основному белку миелина (ОБМ). При обострении заболевания продолжают использовать кортикостероиды, предпочтение отдается коротким курсам в высоких дозах. Однако, несмотря на широкое применение препаратов данной группы, ключевые моменты вызываемых ими изменений иммунологических параметров до настоящего времени остаются неясными (Hohlfeld R., 1997; Nicoletti F. et al., 1999; Losy J. et al., 2002), отсутствуют надежные прогностические признаки эффективности проводимой иммуномодулирующей терапии.
Несмотря на активное изучение иммунопатогенеза PC многие особенности развития иммунопатологического процесса при различных вариантах PC, иммунологические маркеры прогноза PC, механизмы реализации генетической предрасположенности, остаются неясными. В связи с "омоложением" контингента больных PC, ранней инвалидизацией пациентов, расширением зоны высокой частоты встречаемости рассеянного склероза, высокой стоимостью современного лечения, необходимостью проведения комплексных реабилитационных мероприятий, особую актуальность приобретает уточнение механизмов развития иммунопатологического процесса, характерного для различных вариантов PC, изучение механизмов действия и возможных предикторов клинической эффективности современных иммуномодулирующих препаратов.
В связи с вышеизложенным была сформулирована цель исследования: На основании изучения распределения антигенов HLA, особенностей параметров клеточного иммунитета и цитокинового профиля у пациентов с различными вариантами течения PC выявить диагностически значимые параметры, маркеры прогноза и предикторы клинической эффективности иммуномодулирующей терапии.
10 Для достижения цели были сформулированы следующие задачи исследования:
Изучить распределение антигенов главного комплекса гистосовместимости у больных PC.
Изучить параметры клеточного иммунитета и цитокинового статуса у больных с ремиттирующим и прогредиентным PC в различные фазы патологического процесса: обострения/активного течения и ремиссии/стабилизации.
Изучить особенности клеточного иммунитета и цитокинового профиля у пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением PC.
Изучить корреляционные взаимосвязи между иммунологическими и иммуногенетическими показателями у пациентов с PC.
Оценить влияние иммуномодулирующей терапии интерфероном-бета-1Ь, кополимером-1, метилпреднизолоном на изученные иммунологические показатели.
Выделить и охарактеризовать иммунологические предикторы клинической эффективности иммуномодулирующей терапии. Научная новизна.
Проведенное исследование позволило установить связь антигенов системы HLA и их сочетаний с заболеваемостью PC среди жителей Северозападного региона. При этом обнаружены связи, специфические для изученной популяции.
Выявлены особенности экспрессии активационных маркеров и продукции цитокинов лимфоцитами периферической крови пациентов с различными типами течения PC и в различные фазы патологического процесса.
Впервые сопоставлены особенности HLA фенотипа больных PC с паттернами секреции цитокинов и количественными характеристиками субпопуляций лимфоцитов.
Впервые проанализированы иммунологические параметры при
благоприятном и неблагоприятном вариантах PC, выявлены и охарактеризованы критерии неблагоприятного прогноза.
Изучены изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета при назначении иммуномодулирующей терапии, выявлены предикторы клинической эффективности иммунокорригирующей терапии.
Практическая значимость.
Выявленные особенности распределения антигенов системы HLA, изменения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови больных PC, продукции цитокинов и пролиферативной активности клеток могут быть использованы при дифференциальной диагностике PC как с другими заболеваниями, так и внутри этой нозологической формы. Оценка показателей продукции цитокинов может быть использована для уточнения стадии и активности иммунопатологического процесса при выборе метода терапии.
Изучение изменений субпопуляционного состава лимфоцитов и уровней продукции цитокинов позволяет прогнозировать не только развитие клинической симптоматики, обострение и ремиссию, но также развитие патологического процесса в долгосрочной перспективе.
Оценка продукции про- и противовоспалительных цитокинов перед назначением иммуномодулирующей терапии позволяет правильно выбрать метод иммунокоррекции и прогнозировать его эффективность; мониторирование иммунологических показателей в ходе лечения дает возможность судить о наличии эффекта от проводимой терапии.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Заболеваемость рассеянным склерозом среди жителей Северо-западного
региона ассоциируется с антигенами главного комплекса
гистосовместимости. Существуют антигены ГКГ предрасполагающие к
развитию рассеянного склероза, а также антигены, оказывающие
протекторное действие в отношении развития заболевания. Особенности
12 продукции провоспалительных цитокинов связаны с HLA фенотипом больного и определяют характер течения заболевания (благоприятное или неблагоприятное).
Изменение иммунологических показателей периферической крови больных PC зависит от стадии процесса и типа течения PC. У больных с ремиттирующим течением наблюдается выраженная цикличность в характере иммунного ответа - при обострении преобладает продукция цитокинов Txl типа, которая сменяется повышенной продукцией Тх2 цитокинов, что является компенсаторным механизмом и способствует наступлению ремиссии. Для больных с прогредиентным течением данная цикличность не характерна: наблюдаются признаки смешанного Тх1/Тх2 иммунного ответа, причем функциональная способность клеток иммунной системы у этих пациентов снижена.
Препараты, обладающие иммуномодулирующими свойствами и используемые в терапии рассеянного склероза (интерферон-бета-lb, кополимер-1, метилпреднизолон) отличаются по своим эффектам на параметры иммунитета. Положительный клинический эффект при использовании интерферона-бета-lb и метилпреднизолона сопровождается изменениями иммунологических параметров периферической крови.
