Содержание к диссертации
Введение
ВВЕДЕНИЕ 3-7
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8-41
Глава I. Биологическое действие тритерпенових гликозидов голотурий .... 8-25
ГЛАВА 2. Адъювантная активность тритерпенових гликозидов (сапонинов) 26-41
ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42-58
Глава I. Материалы 42-44
Глава 2. Методы 45-58
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 59-156
Глава I. Оценка токсичности тритерпенових гликозидов из голотурий 59-77
Глава 2. Иммуномодулирующая активность три терпенових гликозидов из голоту
рий по отношению к растворимим и корпускулярним антигенам 78-97
Глава 3. Стимуляция тритерпеновими гликозидами из голотурий неспепифической
устойчивости к бактериям 98-134
Глава 4. Иммуномодулирующее действие тритерпенових гликозидов из голотурий при
иммунизации бактериальними вакцинами 135-156
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 157-166
ВЫВОДЫ v 167-168
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 169-201
- Биологическое действие тритерпенових гликозидов голотурий
- Адъювантная активность тритерпенових гликозидов (сапонинов)
- Оценка токсичности тритерпенових гликозидов из голотурий
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Рациональное комплексное использование биологических ресурсов Мирового океана включает в себя, поїжмо выработки продуктов питания, максимальное вовлечение в производство непищевых отходов в качестве не только кормовых и технических продуктов, но и продукции медицинского назначения. Острая потребность практической медицины в источниках биологически активных веіпеств (БАВ), на основе которых разрабатываются новые препараты медицинского, назначения, служит стимулом для интенсивного изучения БАБ гидробионток,- К настоящему времени проведен фармакологический скрининг БАБ не более 1% морских организмов (26), однако получен уже ряд биологически активных соединений с оригинальной, зачастую уникальной химической: ; структурой и фармакологическим эффектом, на порядок превосходящим активность соединений аналогичной природы, выделенных из наземных организмов (1(77). многие из них находят применение в медицинской практике (15).
Среди разнообразнейших по своему химическому^строению и фармакологическому действию БАБ гидробионтов имеются соединения, обладающие иммунотропным действием. Например, препараты, полученные из оболочников EcteinascLdia turbitata , вызывают у экспериментальных животных снижение продукции антител, увеличение времени отторжения кожного трансплантата, замедление или отмену бласттрансформации лимфоцитов, вызванную ФГА, а также изменение некоторых других показателей иммунитета* Б основе имглуномодулирукшего действия данных соединений лежит стимуляция популяции Т-супрессоров. Кроме того они выступают как активаторы макрофагальной системы (246);
Каррагинан-полисахарид из некоторых видов бурых водорослей вызывает супрессию гиперчувствительности замедленного типа, ин-гибирует C-I компонент комплемента, оказывает цитотоксическое действие на макрофаги (98, 112, 120, 260). Липополисахариды из сине-зеленых водорослей Spirulina platensis (14), липиды из печени акул-рестим и рестимЗ(39, 169), эндокапептид зледоизин, выделяемый из моллюсков (193), напротив, оказывают, выраженное стимулирукшее действие, усиливая фагоцитарную активность микро-и макрофагов и способствуя элиминации из организма инфецируше-го агента.
Богатейшим источником БАБ являются также иглокожие, в частности, голотурии или морские огурцы - многочисленная группа обитателей Мирового океана. Зарубежными исследователями, а также в нашей стране в Тихоокеанском институте биоррганической химии ДВНЦ АН СССР под руководством члена-корреспондента АН СССР Г.Б.Елякова из голотурий выделены и идентифицированы гомарин, карнитин, допамин и норадреналин, гистамин, стерины, пептиды, жирные кислоты, терпеноиды, ароматические соединения, сапонины и другие биологически активные вещества (26). Из них наибольший интерес представляют тритерпеновые гликозйды (сапонины), обладав юшие широким спектром биологического действия - цитостатической, нейротропной, гемолитической, цитотоксической, антифунгальной и другими видами активности.
Б научной и патентной литературе отсутствуют данные об им-мунотропной активности тритерпенових гликозидов животного происхождения, за исключением некоторых работ Lasley et al. (190, 191), в которых показано, что тритерпеновий гликозид голотурии а in vitro стимулирует в определенных дозах фагоцитарную активность и миграционную способность лейкоцитов человека. Б то же время известно, что тритерпеновые гликозиды (сапонины) растительного проиехождения на протяжении многих лет используются в ветеринарии в качестве иммунологических адъювантов вакцин против ряда вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний. Хотя механизм их действия практически не изучен, сапонины включаются в большинство вакцин против ящура, производимых во всем мире. Однако, несмотря на ярко выраженный адъювантный эффект использование коммерческих препаратов сапонинов встречает практические затруднения. Главным образом,это связано с тем, что производство зарубежными фирмами сапонинов не предусматривает их применения в качестве иммунологических адъювантов. Основным назначением выпускаемых препаратов сапонинов является их использование в качестве детергентов и эмульгаторов (в лабораторной практике, пишевой и парфюмерной промышленности и т.д.), что и определяет предъявляемые к ним требования. Сапонины широко- представлены в растительном мире, но только немногие из них обладают иммуностимулирующим действием. Поэтому коммерческие препараты сапонинов, представлявшие собой смесь сапонинов из различных сапониносодержаших растений, отличаются нестабильностью состава и, как следствие этого, различной иммуностимулирующей активностью, а также содержанием большого количества балластных вешеств и целым рядом побочных эффектов.
Выбранный нами объект исследования - тетрациклические тритерпеновые гликозиды (сапонины), из дальневосточной голотурии Cucumaria japonica (кукумариозид) привлекли к себе внимание значительно большей фармакологической активностью, чем гликози- ды растительного происхождения, которая обусловлена существенными отличиями химического строения; надежной сырьевой базой и возможностью его получения из отходов пишевой промышленности; отработанными схемами выделения и идентификации»
Его иммунотропное действие не было исследовано.
В связи с этим цель данной работы состояла в изучении способности отечественного препарата кукумариозида, получаемого из дальневосточной голотурии С. japonica , модулировать иммунный ответ и стимулировать неспецифическую устойчивость к бактериям.
В задачи экспериментальных исследований входило изучение следующих вопросов:
Острая и хроническая токсичность кукумариозида.
Модуляция кукумариозидом иммунного ответа на корпускулярные (эритроциты барана) и растворимые (бычий сывороточный альбумин) антигены.
Иммуномодулирушее действие кукумариозида при введении с бактериальными вакцинами,
Стимуляция кукумариозидом не специфической устойчивости К Salmonella typhimurium.
Научная новизна и практическая значимость. В итоге проведенных исследований получены следующие оригинальные результаты. Установлено, что кукумариозид обусловливает выраженную модуляцию иммунного ответа на корпускулярные антигены. В зависимости от дозы и сроков введения кукумариозид усиливает протективное действие бактериальных вакцин и ускоряет очищение организма животных от возбудителя. При введении за 14 и 21 день до заражения кукумариозид без вакцины стимулирует неспецифическую устойчивость мышей к Salmonella typhimurium, активирует макрофаги перитонеального экссудата и повышает их устойчивость к цитопа-тогенному действию сальмонелл. Токсические дозы кукумариозида значительно превышают дозы, необходимые для модуляции иммунного ответа и неспецифической стимуляции антибактериальной устойчивости. Одним из основных механизмов стимулирующего действия кукумариозида является, по всей вероятности, активация клеток мононуклеарной фагоцитарной системы.
Перечисленные положения выдвигаются на зашиту.
Практическое отсутствие токсичности кукумариозида в дозах, обеспечивающих выраженную модуляцию иммунного ответа и стимуляцию неспецифической антибактериальной устойчивости, обусловливает перспективность применения этого препарата в иммунологических исследованиях и вакцинно-сывороточном деле. Кукумарио-зид в нетоксичных концентрациях может найти применение в медицинской и ветеринарной практике для усиления протекгивного действия бактериальных вакцин и стимуляции неспецифической устойчивости к микроорганизмам, способным к паразитированиго в клетках мононуклеарной фагоцитарной системы.
По результатам данного исследования получено авторское свидетельство на изобретение В 1066602 от 15 сентября 1983 г. "Средство для изучения состояния иммунной" системы на экспериментальных моделях" с формулой изобретения "Применение тритерпенових гликозидов в качестве средства для изучения состояния иммунной системы на экспериментальных моделях".
Совокупность полученных результатов можно квалифицировать как новое решение актуального для практической и теоретической медицины вопроса о расширении арсенала эффективных нетоксичных иммуномодуляторов и стимуляторов неспецифической антибактериальной резистентности.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическое действие тритерпенових гликозидов голотурий
Тритерпеновые гликозиды широко представлены в растительном мире (25); У животных эти вещества обнаружены в настояшее время только у представителей типа иглокожих.
Тритерпеновые гликозиды (ТГ) локализуются в жизненно важных органах и тканях, которые активно функционируют или содержат большое количество интенсивно делящихся клеток: хлоропласти, меристематические участки, семена растений и яйцеклетки голотурий. В зависимости от физиологического состояния организма содержание и скорость биосинтеза гликозидов изменяется в достаточно больших пределах. В литературе имеются данные, указывающие на то, что соединения этого класса несут важные регуля-торные функции, включаясь в метаболизм в процессе роста или развития организма (10).
ТГ, получаемые из иглокожих, сейчас интенсивно изучаются. Большие успехи достигнуты в последние годы в расшифровке химической структуры этих соединений (34, 85, 146, 147, 166). В то же время многие аспекты биологического действия ТГ пока раскрыты далеко не полностью. Проведен ряд исследований, направленных на изучение цитостатического (119, 205, 206, 209, 222, 256, 257), нейротропного (140, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 165, 235, 261, 262), гемолитического (II, 44, 69, 70, 71, 208, 263), цитотоксического (5, 101, 102, 103, 178, 234), антифунгального (6, 8, 9, 80, 94, 95, 96, 187, 188, 245) действия ТГ из иглокожих. Многочисленные представители ТИПа ИГЛОКОЖИХ ( Echinoderma ta) широко представлены в Мировом океане. Б СССР иглокожие встречаются в Балтийском, Черном морях. Б Баренцевом, Карском, Чукотском и Охотском морях они составляют основную часть донных животных (35) и служат предметом промысла.
Тип иглокожих насчитывает около 6500 видов, объединенных в пять классов. Особое место среди них занимают представители класса голотурий или морских кубышек ( Hoiothutioide (147). Из пяти отрядов этого класса наибольший интерес в плане получения биологически активных веществ (БАБ) представляют два. К первому относятся голотурии отряда щитовидношупальцевых ( Aspi-dochirota ) семейства настоящих голотурий ( Hoiothuriidae рода Holotlmra Bohadschia, Actinopyga ), а также семейства сти-ХОПОДИД ( Sticbopodidae ), ВКЛЮЧашеГО В Себя РОД Stichopus, к которому относится дальневосточный трепанг stichopus japoni-cus . Второй отряд древовидношупальцевых ( Dendrochirota ) интересен представителями семейства МОРСКИХ огурцов ( Cucumariaidae)»
Особенно необходимо отметить род Cucumaria , к которому принадлежит промысловый японский морской огурец Cucumaria japonica . Это крупная голотурия длиной до 30-40 см темно-бурой или фиолетовой окраски, ведущая малоподвижный образ жизни и встречающаяся на глубине от 5 до 50 м и даже 200 м у берегов Японии, Сахалина, Курильских островов и в других районах Японского, Охотского и Берингова морей. Плотные мускулистые стенки тела С. japo-nica , толщина которых более 5 см, являются сырьем для приготовления пресно-сушеной или варено-соленой кукумарии, а также кормовой муки и консервов. Запасы С. japonica в наших дальне 10 восточных морях велики, Б водах нашего Приморья на отдельных участках за одно траление поднимают 12-15 ц этой голотурии. Средний вес каждого животного 350-500 г (35). В настоящее время в ряде стран ведутся работы по искусственному разведению ценных видов голотурий. Кроме того, в нашей стране разрабатывается метод получения биологически активных веществ из отваров, остающихся после приготовления варено-солевой кукумарии, и не представлявших ценности для пищевой промышленности. Таким образом, существует надежная сырьевая база для получения биологически активных веществ из голотурии Сдаропіса.
Адъювантная активность тритерпенових гликозидов (сапонинов)
Адъювантное действие сапонинов растительного происхождения известно давно. В 1926 г.Ramon (225), предложивший термин "адъювант" для веществ, добавляемых к антигену для усиления его иммуногенности, наряду с веществами самой разнообразной природы, впервые испытал сапонины в качестве адъювантной добавки к дифтерийному и столбнячному анатоксину.
В 1932 г. Galea и Izortzanls (158), используя сапониновый адъювант, добились значительного усиления иммунного ответа морских свинок к слабоиммуногенной вакцине против яшура.
В 1938 г. Николаенко (58, 59) предложил применение в СССР сапонинсодержашей противояшурной вакцины для крупного рогатого скота. Однако несовершенные методы инактивации вируса явились препятствием широкому внедрению этой вакцины в производство (28).
В 1951 г. под руководством Espinet (148) начато массовое производство адсорбированных на гидроокиси алюминия противоящур-ных вакцин с добавкой коммерческих препаратов сапонинов в качестве адъювантов.
В настоящее время сапонины находят широкое применение в ветеринарии в качестве адъювантов вакцин против ряда вирусных и бактериальных инфекций - яшура (55, 138, 161, 197, 211, 253), чумы крупного рогатого скота и свиней (137, 167, 174), болезни Ауески (III), вирусного гепатита утят (199), бактериоидозов (143), сибирской язвы (173) и др. Так, например, добавление сапонинового адъюванта Quil -А в концентрации 2 мг/мл к вакцине против вирусного заболевания - чумы свиней, приводило к .значительному повышению резистентности животных (135), У вакцинированных комплексной вакциной животных, зараженных через 12 недель, отсутствовали клинические симптомы заболевания и отмечена полная выживаемость. В группах, где иммунизацию производили вакциной с неполным адъювантом Фрейнда, у части животных наблюдались типичные симптомы заболевания. Таким образом, сапонин Quil -А оказался более эффективным адъювантом, чем неполный адъювант Фрейнда.
Увеличение титра антител отмечено при вакцинации с сапониновым адъювантом утят против вирусного гепатита (199).
Применение сапонина Quil -А способствовало эффективной иммунизации баранов против заболевания, вызываемого Bacterioides nodo-sus (143). Показано значительное увеличение титра антител по сравнению с контролем без адъюванта.
Кроме того, сапонины растительного происхождения используются как адъюванты вакцин против некоторых паразитарных заболеваний животных (139, 167, 168, 184, 227, 247, 202). Усиления про-тективного действия вакцины против трипаносомоза, вызываемого Trypanosoma cruzi , достигали добавлением к вакцине 50 мкг Quil -А сапонина. Выживаемость вакцинированных с адъювантом животных на 28 день после заражения составляла, в зависимости от дозы антигена, 50-100$ при полной гибели в контроле. Введение сапонина Quil -А без вакцины не оказывало защитного действия (167). Паразитемия у мышей, иммунизированных антигеном Т. cruzi с сапонином, была приблизительно в 3 раза ниже, чем в контроле. Сравнение адъювантного действия Quil -А, п-гексадециламина, пол-. ного и неполного адъюванта Фрейнда показало, что наибольшим про-тективным действием по отношению к заражению Т. cruzi и Т. congolense обладает антиген с сапонином, обеспечивая 83$-нуго выживаемость животных (184). Сапонин или вакцина в испытанных концентрациях, вводимые раздельно, защитным действием не обладали (167, 184).
Добавление сапонина SPL в дозе 100 мкг на животное к антигену Plasmodium gallinaceum, применявшемуся в качестве противомалярийной вакцины, приводило к увеличению количества цыплят, освободившихся от паразита в течение 6 недель после заражения (227).
Оценка токсичности тритерпенових гликозидов из голотурий
На первом этапе исследований нами проведено изучение токсического действия кукумариозида, которое включало в себя установление острой и хронической токсичности препарата, его гемолитического действия, а также патоморфологическое обследование внутренних органов животных в различные сроки после введения им кукумариозида на светооптическом и электронно-микроскопических уровнях.
Б экспериментах по установлению острой токсичности кукумариозида нами показано, что средняя токсическая доза препарата (ТДзд), вызывавшая гибель в течение 3-х дней 50$ мышей линии СБА или гибридов первого поколения р1 (СБА х C57BI/6) весом 14-17 г при внутрибрюшинном введении составляет 426,6+0,02 глкг на мышь (табл.1) или 28,4 мкг на кг веса животного.
Определение хронической токсичности кукумариозида показало, что дозы препарата меньшие, чем средняя токсическая в 1,5-2,0 раза (300-200 мкг на мышь) при том же способе введения гибели животных не вызывают, однако у мышей отмечено замедленное нарастание массы тела по сравнению с интактными животными. Отставание в приросте массы тела мышей, получивших кукумариозид в дозе 200 мкг на мышь наблюдается на 6-16 сутки после его введения (рис.4, кривая І). Б эти сроки масса тела опытного животного, в среднем, была меньше массы тела интактного животного на 2,53 + 0,46 г. Максимальные отличия в весе (в 3,4-4,4г) отмечены на 10-12 сутки после введения кукумариозида
