Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Клиническая характеристика обследуемых 37
2.2. Методы исследования 40
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 54
Глава 3. Результаты собственных исследований 55
3.1. Оценка соматического статуса девочек в исследуемых группах 56
3.2. Акушерский анамнез матерей пациенток, перинатальный и социально-бытовой анамнез 58
3.3. Появление вторичных половых признаков у девочек с ВГКН 60
3.4. Становление менструальной функции у девочек с ВГКН 62
3.5. Гормональный профиль, степень компенсации ВГКН 68
3.6. Результаты инструментального обследования девочек с ВГКН
3.7. Цитологическое исследование содержимого влагалища 75
3.8. Результаты иммуногистохимического послеоперационного исследования материала у девочек с ВГКН после феминизирующей и интроитопластики 81
Глава 4. Обсуждение результатов 90
Выводы 110
Практические рекомендации по оптимизации диспансерного наблюдения
больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников 112
Список сокращений 114
Список литературы
- Методы исследования
- Статистическая обработка результатов исследования
- Становление менструальной функции у девочек с ВГКН
- Цитологическое исследование содержимого влагалища
Методы исследования
ВГКН – врожденная гиперплазия коры надпочечников, которая ранее называлась адреногенитальным синдромом, является клиническим синдромом или симптомокомплексом, развитие которого связано с нарушением секреции глюкокортикостероидов вследствие врожденного дефекта ферментов, ответственных за биосинтез этих гормонов. Снижение образования кортизола приводит к повышенной секреции АКТГ и последующей гиперплазии коркового слоя коры надпочечников [214]. Для синдрома врожденной гиперплазии коры надпочечников характерна триада признаков: низкий уровень кортизола и высокое содержание АКТГ в плазме крови, двухсторонняя гиперплазия коры надпочечников [35]. Ренин-ангиотензиновая система остается интактной. Врожденная гиперплазия коры надпочечников ведет к нарушениям в биосинтезе стероидов разной степени тяжести. Эти ферменты контролируют биосинтез гормонов не только в надпочечниках, но и в гонадах [216].
ВГКН может быть подразделена на следующие формы: недостаточность 21-гидроксилазы (классическая и неклассическая формы), недостаточность 11-бета-гидроксилазы (также классическая и неклассическая формы), недостаточность 3-бета-гидроксистероидной дегидрогеназы, недостаточность 17-альфа-гидроксилазы (с недостаточностью 17 и 20-лиазы и без нее), недостаточность 20, 22 десмолаз (т.н. липоидная гиперплазия коры надпочечников) и недостаточность метилоксидазы 1 и 2 типов [46; 187].
Недостаточность 21-гидроксилазы (недостаточность P450c21) встречается наиболее часто из всех вышеперечисленных ферментных нарушений коры надпочечников, составляя до 95% всех ферментных дефектов в структуре
ВГКН. Ген, кодирующий 21-гидроксилазу (P450c21), локализуется на коротком плече 6-й хромосомы (6p) и представлен в виде активного гена CYP21 или в виде неактивной копии CYP21P, вблизи локуса HLA, кодирующего 4-й компонент системы комплемента, а именно С4А и С4В [187]. В большинстве случаев недостаточности 21-гидроксилазы выявлены мутации в гене CYP21, которые возникают вследствие взаимодействия нормального аллеля с неактивной копией CYP21P, в результате этого взаимодействия происходят разного рода делеции, которые и обуславливают большинство всех мутаций CYP21 [218]. В результате недостаточности 21-гидроксилазы блокируется конверсия 17-гидроксипрогестерона в 11-деоксикортизол, что приводит к снижению образования кортизола и накоплению предшественников кортизола: 17-гидроксипрогестерона, прегненолона, 17-гидроксипрегненалона и прогестерона, которые в сетчатом слое коры надпочечников в высоких количествах конвертируются в надпочечниковые андрогены: дегидроэпиандро-стерон, d4-андростендион и тестостерон. Клинически недостаточность 21-гидроксилазы протекает в двух основных формах: классической (вирильной и сольтеряющей) и неклассической (менее выраженной, «взрослой») [216].
Описание основных форм ВГКН Вирильная форма классической ВГКН связана с частичной недостаточностью 21-гидроксилазы. Как правило, при этом наблюдается компенсация функции коры надпочечников в результате повышения секреции АКТГ, т.е. уровень кортизола снижен относительно незначительно или находится на нижней границе нормы. Повышенная секреция АКТГ, однако, приводит к усиленному образованию андрогенов, прогестерона и гидроксипрогестерона, что угнетает сользадерживающую активность альдостерона. Компенсаторно повышается уровень ренина в плазме, который увеличивает секрецию альдостерона. Таким образом, вследствие напряжения компенсаторных механизмов (увеличение секреции АКТГ по системе обратной связи) относительно нормализуется уровень кортизола и альдостерона, но в то же время повышается и уровень андрогенов, по большей части андростендиона. Сам по себе андростендион малоактивен, но в периферических тканях он активно конвертируется в тестостерон, который и является главной причиной вирилизации [220].
Сольтеряющая форма синдрома недостаточности 21-гидроксилазы. Более глубокая недостаточность 21-гидроксилазы, при которой наблюдаются низкие уровни кортизола и альдостерона, которые не корригируются избыточным образованием АКТГ, в отличие от описанной ранее вирильной формы недостаточности 21-гидроксилазы. Вследствие этого на первый план выходят симптомы острой надпочечниковой недостаточности. Уровень ренина в сыворотке в таком случае повышен, повышается уровень ангиотензина в крови, который способствует усиленной экскреции натрия с мочой. Отмечается гипертрофия юкстагломерулярного аппарата почки. Наряду с этим также резко выражены симптомы вирилизации, особенно у плодов женского рода, что проявляется полным заращением половой щели, появлением мошоночно-подобного образования – признак псевдогермафродитизма [45].
Клиника новорожденных с сольтеряющей формой заключается в вышеописанных изменениях половых органов, пигментации кожи, снижении массы тела при избыточной массе тела и дегидратации организма [217]. На 5–10 день развивается картина острой надпочечниковой недостаточности: рвота, боль в животе, диарея, апатия. В отсутствие адекватного лечения у таких новорожденных развивается сердечно-сосудистая недостаточность и наступает смерть вследствие гипогликемии.
Неклассическая форма 21-гидроксилазной недостаточности (ген HLA B14 или B47 в сочетании с CYP21B) [216] может наступить в любом возрасте и с различными симптомами гиперандрогенизма, за исключением псевдогермафродитизма. Эта форма ВГКН развивается из-за мягкой формы 21-гидроксилазной недостаточности и диагностируется путем определения базального количества 17-гидроксипргестероона в крови после стимуляции АКТГ. В норме после такого стимуляционного теста количество гидроксипрогестерона не превышает 300–330 нг/100мл. У больных с неклассической формой его уровень может повышаться до 1500 нг/100мл [129]. Прочие формы ВГКН вызывают нарушения синтеза ферментов разных звеньев стероидогенеза, помимо 21-гидроксилазы, но встречаемость их крайне мала: порядка 5% всех случаев ВГКН.
Статистическая обработка результатов исследования
Основными эндокринными последствиями ВГКН являются снижение секреции глюкокортикоидов и часто минералкортикоидов, надпочечниковый гиперандрогенизм и нарушение анатомии и физиологии надпочечников: как коркового слоя, так и мозгового [153; 216].
Терапия классической формы 21-гидроксилазной ВГКН часто несбалансированна, и пациенты имеют риск возникновения ятрогенного гиперкортизолизма и/или гиперандрогенизма, которые и обусловливают развитие множества проблем в терапии ВГКН. Достижение и поддержание адекватного уровня андрогенов – гораздо большая проблема, нежели простое предотвращение надпочечникового криза. В настоящий момент основными целями лечения ВГКН являются адекватное восстановление уровня глюкокортикоидов, и, что безусловно очень важно, уровня минералкортикоидов для предотвращения надпочечниковых кризов и для подавления избыточной секреции кортикотропин-рилизинг-гормона и АКТГ [206; 36]. Эти мероприятия по системе обратной связи обеспечивают снижение концентрации циркулирующих надпочечниковых андрогенов и различных стероидных предшественников.
Серьезными минусами современной терапии ВГКН являются, во-первых, невозможность стабильного контроля заболевания без применения сверхдоз глюкокортикоидов и сложности в подавлении АКТГ аденогипофиза. Подростковый возраст пациенток создает дополнительные трудности для адренокортикального подавления даже в условиях оптимальной ЗГТ и высокой комплаентности пациентки [140; 141; 154; 216].
Основные ограничения в проведении стандартной терапии надпочечников для больных ВГКН: 1) невозможность полного воспроизведения естественного суточного паттерна выделения кортизола; 2) гиперреактивность гипертрофированных надпочечников к изменениям уровня АКТГ и увеличение андрогенной продукции вследствие небольших АКТГ-изменений при снижении гипофизарной супрессии [206]; 3) сложность в супрессии АКТГ аденогипофиза из-за сниженной чувствительности последнего к глюкортикоидам: развивается неэффективность отрицательной обратной связи [36; 206]; 4) увеличенные концентрации надпочечниковых андрогенов и стероидных предшественников с разной долей успеха конкурируют с экзогенными глюкортикоидами и минералкортикоидами за одни и те же рецепторы, предрасполагая пациентку с классической формой ВГКН к более высокому риску развития стресс-индуцированного сольтеряющего криза [156].
Вработе E.Charmandari, C.G.Brook было обнаружено, что клиренс общего и свободного кортизола значительно выше у подростков с ВГКН, чем у детей и взрослых [49]. Также отмечено, что объем распределения также значительно выше у подростков и взрослых, чем у детей. Не было выявлено существенных отличий во времени полуэлиминации кортизола среди этих возрастных групп. Также важно отметить, что сравнение мужчин и женщин во всех возрастных группах показало существенно более быстрый клиренс свободного кортизола у последних.
Интересен патогенетический механизм этих изменений. Клиренс экзогенного кортизола в первую очередь зависит от ферментов органов, т.н. А-кольца, которые представляют собой по большей части цитозольные и митохондриальные ферменты печени, такие как цитохром P450, 5a/5b-редуктазу, 3a/3b-оксидоредуктазу и 11b-гидроксистероид дегидрогеназу [99]. Наибольшее влияние имеет клиренс именно А-кольца печени, а не почек, где, кстати, тоже происходит частичная экскреция кортизола, но в небольших количествах, около 1% всего клиренса. Из всех перечисленных ферментов наибольший интерес представляет повреждение 11b-гидроксистероид дегидрогеназы, которая переводит неактивный кортизон в кортизол и потенциально увеличивает уровень активных глюкокортикоидов [170]. Было отмечено снижение активности 11b-HSD1 в условиях повышения концентрации соматотропина и ИРФ-1 [76; 132]. Именно в пубертатном периоде у девочек-подростков отмечается усиление оси соматотпропина и ИРФ-1. Концепция того, что происходит снижение активности 11b-HSD1 при увеличении активности этих гормонов, была подтверждена [48] путем измерения метаболитов кортизола в моче подростков ВГКН, и было выяснено, что происходит значительное выделение последних, например, тетрагидрокортизона. Как было указано выше, клиренс кортизола также происходит за счет почечной экскреции. Почечный клиренс лекарств складывается из фильтрации, секреции и реабсорбции. Соматотропин и ИРФ-1 влияют на почечную фильтрацию путем прямого действия ИРФ-1 на почечные сосуды, ускоряя кровоток в них за счет снижения резистентности сосудов [92; 123].
На увеличение гиперандрогенизма ось самотропин-ИРФ-1 действует путем влияния на ферменты стероидогенеза, изменяя их активность. Во-первых, происходит увеличение активностей 17,20-лиаз и снижение активности 3b-гидроксистероид дегидрогеназы, а также повышение 17а-гидроксилазы [33; 127].
Подростки с классической формой ВГКН имеют значительной более высокий уровень инсулина в крови, что становится еще одним результатом процессов, которые происходят в пубертатном периоде. Это, вероятно, становится результатом того, что длительная надпочечниковая гипофункция усугубляется в пубертатном периоде и не происходит должного подавления секреции инсулина через бета-адренорецепторы [49].
Становление менструальной функции у девочек с ВГКН
У девочек пубертатного возраста оценку гормональных показателей проводили с учетом стадии достигнутого полового развития [1; 195]. Молекулярно-генетическое исследование на наличие наиболее распространенных мутаций в гене CYP21 с использованием аллель-специфической ПЦР проводилось в лаборатории генетики и клинической иммунологии ФГБУ ЭНЦ. Характер менструального цикла (МЦ) – возраст менархе, регулярность, продолжительность цикла – оценивался путем интервьюирования девушек и по данным «менструального календаря». Нерегулярный менструальный цикл по типу ановуляции или недостаточность лютеиновой фазы цикла констатировались при длительности менструального цикла короче 21 дня или длиннее 42 дней. Первичная аменорея диагностировалась в случае отсутствия менструаций в возрасте старше 15 лет, вторичная аменорея – в случае отсутствия менструации в течение 6 месяцев и более. Состояние менструального цикла (овуляцию, оценку фолликулогенеза и функции желтого тела) у пациенток с нарушением менструальной функции обследовали по тестам функциональной диагностики, в том числе – проведением базальной термометрии в течение 4 месяцев.
Всем пациенткам также был проведен ряд лабораторных исследований. Клинический анализ крови, где определялся уровень гемоглобина, количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, время свертывания крови. Биохимический анализ крови, в котором определяли: сахар, АлТ, АсТ, общий белок, билирубин, фибриноген, протромбиновый индекс, электролиты, проводимые по общепринятым методикам. Девочкам пубертатного возраста осуществляли цитологическо е исследо вание влагалищного содержимого. В исследование вошли 17 девочек-подростков с классическими формами ВДКН (сольтеряющая форма (СТ) – 8 девочек, простая вирильная форма (ПВ) – 9 девочек). Все пациентки регулярно обследовались в детском отделении ФГБУ ЭНЦ с периодичностью 1–2 раза в год.
Пациентки были разделены на 2 группы в зависимости от степени компенсации заболевания. В группу I вошли 9 девочек, имеющих удовлетворительную компенсацию или субкомпенсацию заболевания. К этой группе были отнесены пациентки с показателем 17-гидроксипрогестерона (17-ОHП) менее 50 нмоль/л, отсутствием или слабо выраженными клиническими симптомами гиперандрогении в течение последних 3 лет и пациентки с показателем 17-OHП более 50 нмоль/л, но отсутствием симптомов гиперандрогении и регулярным менструальным циклом. В группу II были включены 8 девочек в состоянии длительной декомпенсации заболевания. К этой группе были отнесены пациентки с показателем 17-OHП более 50 нмоль/л и выраженными признаками гиперандрогении в течение последних 3 лет и более. В группе I были выделены 2 подгруппы в зависимости от фазы менструального цикла, в которую был получен мазок влагалищного содержимого для цитологического исследования: подгруппа ФФ – фолликулиновая фаза цикла (6 девочек), подгруппа ЛФ – лютеиновая фаза цикла (3 девочки) (таблица 7).
Группу сравнения для группы I составили 12 здоровых девочек-подростков, сопоставимых по возрасту (16 (14,75; 16) лет) и стадии полового развития по Таннеру (4–5), имеющие регулярный менструальный цикл. Пациентки группы контроля также были разделены на 2 подгруппы в зависимости от фазы менструального цикла: фолликулиновая фаза (КонтрФФ) – 6 девочек, лютеиновая фаза (КонтрЛФ) – 6 девочек.
Критериями исключения из данного исследования являлись невозможность получения материала для цитологического исследования ввиду особенностей строения наружных половых органов (наличие узкого урогенитального синуса, рубцовые изменения интроитуса после перенесенной феминизирующей пластики), получение неполноценного материала для цитологического исследования (малоклеточность мазка, наличие в материале большого количества элементов крови и/или воспаления).
Костный возраст пациенток определялся в соответствии с общепринятой методикой W. Greulich, S. Pyle S (1959).
Всем пациенткам было проведено цитологическое исследование вагинального эпителия. Образцы были получены с помощью желобоватого зонда с латеральных стенок средней трети влагалища. После получения материала образцы были высушены на воздухе, окраска стекол выполнена по методу Романовского в модификации Паппенгейма. Цитологическое исследование было проведено на микроскопе Zeiss Primo Star путем подсчета 200 клеток в нескольких полях зрения (используемые объективы – 10 (для выбора поля зрения) и 100 (для подсчета эпителиальных клеток). После подсчета количества поверхностных (с пикнотичными ядрами, КП), промежуточных (ПР) и базально-парабазальных (ПБ) клеток был вычислен процент каждого типа. Для статистической обработки данных были использованы общепринятые показатели: кариопикнотический индекс (КПИ) – процент всех клеток с кариопикнозом из числа всех поверхностных и зрелых промежуточных клеток, атрофический индекс (АИ) – процент парабазальных и базальных клеток из общего числа клеток и индекс созревания (ИС), который был вычислен по формуле: ИС = (% ПР 0.5)+% КП [22, 24]. Девочкам пубертатного и препубертатного возраста осуществляли иммуногистохимическое исследование послеоперационного материала.
В исследование вошли 22 пациентки с классическими формами ВГКН (сольтеряющая форма (СТ) – 18 девочек, вирильная форма (ПВ) – 4 девочек).
Пациентки были разделены на 2 группы в зависимости от возраста (таблица 8). В I группу вошли 10 девочек в возрасте от 1 до 5 лет. К этой группе отнесены девочки после феминизирующей пластики наружных половых органов. В группу II были включены 12 девочек в возрасте от 11 до 18 лет. К этой группе отнесены пациентки после интроитопластики.
Цитологическое исследование содержимого влагалища
Неоднократно было показано, что во влагалище происходят значительные структурные изменения в ответ на воздействие половых гормонов. Различные трофические эффекты эстрогенов, прогестинов и андрогенов были отмечены в нескольких типах клеток различных слоев (эпителий, собственная пластинка и мышечный слой) стенки влагалища. Однако механизмы возникновения этих изменений в настоящее время являются до конца не изученными. Вероятно, что изменения в экспрессии рецепторов половых стероидов играют ключевую роль в регуляции трофических эффектов [168]. Биологические эффекты эстрогенов опосредуются связыванием лиганда с одним из двух рецепторов эстрогена ER или ER. Оба типа рецепторов экспрессируются в различных тканях организма. ER экспрессируется прежде всего в матке, печени, почках и сердце, в то время как экспрессия ER прежде всего выражена в яичниках, предстательной железе, легких, желудочно кишечном тракте, мочевом пузыре, кровеносной и центральной нервной системе. Однако отмечается и коэкспрессия этих 2 типов рецепторов в ряде тканей, включая молочную железу, яичники, щитовидную железу, надпочечники и кости. Несмотря на активное изучение, в настоящее время роль эстрогенов в эмбриональном развитии женских наружных половых органов остается неясной. Эстрогеновые рецепторы обнаруживаются в половых органах как мужских, так и женских эмбрионов, однако, в отличие от рецепторов андрогенов, инактивация генов рецепторов эстрогена не приводит к существенному влиянию на эмбриональное развитие наружных гениталий женского или мужского пола [75; 134].
Присутствие ERб во влагалище было продемонстрировано как на животных моделях, так и у человека. С помощью методов гибридизации insitu и иммуногистохимии было продемонстрировано, что ER экспрессируется в вагинальном эпителии, мышечной оболочке и стромальных клетках влагалища, но не в кровеносных сосудах стенки влагалища. Наличие ER во влагалище человека также было подтверждено с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), хотя этот метод не позволяет определить конкретную локализацию рецептора в ткани. Отмечено, что плотность ER уменьшается от шейки матки к вульве, в то время как никаких различий не было выявлено между плотностью рецепторов в передней и задней стенке влагалища [168].
Несмотря на рост числа опубликованных исследований, касающихся роли андрогенов в формировании женских половых органов, относительно мало известно об экспрессии и распределении рецепторов андрогенов (АР) во влагалище и их регуляции стероидными гормонами. С помощью иммуногистохимии АР были обнаружены в эпителии, гладкой мускулатуре, эндотелии сосудов и строме влагалища [42]. В отличие от результатов относительно ER, было продемонстрировано, что плотность АР увеличивается от шейки матки к вульве, а различий в плотности рецепторов в передней и задней стенке влагалища не было обнаружено [32].
Таким образом, ER и AР обнаружены в эпителии влагалища, стромы и гладкомышечных клетках человека. Чтобы исследовать чувствительность рецепторов влагалища, вульвы и слизистой малых половых губ к эстрогенам и андрогенам, нами было проведено иммуногистохимическое исследование образцов ткани, полученных от пациенток с ВГКН.
Необходимо отметить, что в доступной нам литературе (поиск по ключевым словам в системе Pubmed «adrenal hyperplasia, congenital», «immunohistochemistry», «receptors, estrogen», «receptors, androgen») не удалось найти исследований, посвященных изучению экспрессии рецепторов эстрогенов и андрогенов при ВГКН.
В ходе проведенного нами исследования было получено 22 образца ткани от пациенток с ВГКН, которые были проанализированы на наличие экспрессии эстрогеновых и андрогеновых рецепторов с использованием моноклональных антител против ER, ER и АР соответственно. Клетки, экспрессирующие эти рецепторы, выявлялись по характерному коричневому окрашиванию ядер, в то время как ядра клеток, в которых отсутствовала экспрессия стероидных рецепторов, были синего цвета (рисунок 18). Клетки, экспрессирующие ER, обнаружены в эпителии всех образцов и были преимущественно расположены в парабазальной части эпителия и вдоль базальной мембраны, в которой большинство клеток были ER-положительными (рисунок 19).
Эстрогены регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток в эпителии влагалища; это отражается обилием рецепторов эстрогена в базальном и парабазальном слое. Полученные нами данные о распределении ER согласуются с результатами исследований зарубежных авторов [31; 196]. Наличие эстрогеновых рецепторов в вагинальных стромальных клетках также демонстрирует, что стромально-эпителиальные взаимодействий регулируются эстрогенами влагалищного эпителия. Кроме того, в исследовании, проведенном Y.Sajjad и S.M.Quenby (2004), было выявлено интенсивное иммуногисто-химическое окрашивания рецептора эстрогена в зачатках внутренних половых губ женских эмбрионов, что позволило авторам сделать вывод о потенциальной возможности прямого действия эстрогенов на ткани уже во втором триместре беременности.
