Генетические маркеры прогнозирования преэклампсии Халфорд-Князева, Инесса Павловна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Введение 11

1.2 Этиология и патогенез преэклампсии 12

1.3 Генетические исследования преэклампсии в мире 29

1.4 Заключение 38

ГЛАВА 2 Контингент, материалы и методы исследования

2.1 Объем исследования и контингент обследованных женщин и их новорожденных 39

2.2 Методы исследования 40

ГЛАВА 3. Клиническая характеристика обследованных женщин и их новорожденных 60

ГЛАВА 4 Результаты генетического исследования

4.1 Анализ полиморфных маркеров исследованных генов 83

4.2 Анализ комбинаций полиморфных маркеров исследованных генов 91

4.3 Многофакторные модели риска развития преэклампсии 98

4.4 Анализ полиморфных маркеров исследованных генов среди женщин с изолированным «отечным синдромом», с протеинуриеи и/или артериальной гипертензией и женщин группы контроля 107

ГЛАВА 5 Обсуждение результатов исследования 110

Выводы 126

Практические рекомендации 128

Список использованной литературы 129

• Генетические исследования преэклампсии в мире
• Объем исследования и контингент обследованных женщин и их новорожденных
• Анализ комбинаций полиморфных маркеров исследованных генов
• Анализ полиморфных маркеров исследованных генов среди женщин с изолированным «отечным синдромом», с протеинуриеи и/или артериальной гипертензией и женщин группы контроля

Введение к работе

Актуальность темы.

Преэклампсия (ПЭ), или гестоз - осложнение беременности, развивающееся после 20-й недели и характеризующееся полиорганной недостаточностью. В основе синдрома ПЭ лежит генерализованная эндотелиальная дисфункция, ведущая к расстройству общего кровообращения во время беременности. В мире ПЭ осложняет течение беременности в 2 - 8%, и является одной из главных причин заболеваемости и смертности матери и плода (khan K.S. et al., 2006; Duley L., 2009; Berg C.J. et al., 2009; Steegers E.A. et al., 2010). В структуре причин преждевременных родов во всем мире на долю ПЭ приходится до 15% (Duley L., 2009; Berg C.J. et al., 2009). В РФ частота заболеваемости ПЭ на редкость стабильна и варьирует от 22,2% до 17,8% за последние десять лет (Радзинский В.Е., 2012). Уровень заболеваемости новорожденных на фоне ПЭ колеблется от 64 до 78%, а перинатальная смертность составляет 18-30%о (Радзинский В.Е., 2012). По данным ВОЗ, у каждого 5-го ребёнка, родившегося от матери с ПЭ, в той или иной степени происходит нарушение физического и психоэмоционального развития, значительно выше уровень заболеваемости в младенческом и раннем детском возрасте.

До настоящего времени, несмотря на достигнутый высокий уровень ряда медицинских технологий, многие вопросы, посвященные проблеме ПЭ, остаются малоизученными, спорными и противоречивыми. Излечить ПЭ невозможно, поэтому цель терапии - предотвратить прогрессирование имеющегося заболевания и уменьшить выраженность клинических симптомов. Эффективность коррекции данного состояния значительно выше при начальных стадиях заболевания. Следовательно, актуален поиск методов прогнозирования и ранней диагностики ПЭ, оценки вероятности развития ПЭ еще до беременности, чтобы своевременно провести комплекс профилактических мероприятий и предгравидарную подготовку (Irminger- Finger I. et al., 2008; Kalkunte S. et al., 2009).

Причина ПЭ остаётся до сих пор до конца не ясной и зависит от множества факторов. В основе патогенеза ПЭ лежит патологическая инвазия трофобласта, связанная с нарушением трансформации мышечного слоя спиральных артерий миометрия, в результате чего развивается острая дисфункция эндотелия спиральных артерий и системный эндотелиоз, происходит системный сосудистый спазм и формируется системный воспалительный ответ. Эти процессы сопровождаются нарушением в работе систем гемостаза, ангиогенеза, ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) (Поздняков И.М. и соавт., 2008; Mutze S. et al., 2008; Wang Z. et al., 2009; Wang A et al., 2009; Myatt L., Webster R.P., 2009).

ПЭ рассматривают как генетически детерминированную недостаточность процессов адаптации материнского организма к новым условиям существования, которые возникают с развитием беременности (Национальное руководство «Акушерство», 2007). Роль генетических

факторов в развитии ПЭ составляет более 50%, и вклад материнских генов в этот процесс превышает генетическую компоненту плода (Cnattingius S. et al., 2004; Goddard K.A. et al., 2007; Roten L.T. et al. 2009). К настоящему времени изучено более 50 генов, предположительно связанных с развитием ПЭ (Chappell S., Morgan L., 2006), однако полностью определить спектр генов, ответственных за развитие ПЭ, еще не удалось.

68% женщин с ПЭ имеют отеки (Sibai B., 2005), однако, в большинстве стран отечный синдром как критерий диагноза ПЭ не рассматривается, так как отеки возможны и при физиологическом течении беременности. В тоже время, выраженные отеки могут служить предвестником дальнейшего развития ПЭ, поскольку отражают повышенную проницаемость эндотелия сосудов и недостаток белка в плазме крови, что может быть связано с дисфункцией эндотелия и экскрецией белка почками.

Цель исследования.

Оценить роль полиморфизма генов белков, связанных с регуляцией артериального давления (АД), участвующих в плацентации, связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия, вовлеченных в системный воспалительный ответ, в прогнозировании риска развития ПЭ.

Задачи исследования:

1. Изучить и сравнить частоты встречаемости аллельных вариантов генов белков, связанных с РААС - ACE (I/D), AGT (M235T); участвующих в плацентации - VEGF (С936Т), MMP9 (c(-1562)t); связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия - NOS3 (G894^ intron 4a/b), CYBA (С242Т), MTHFR (C677T); вовлеченных в системный воспалительный ответ -MBL2 (G161A codon 54), у беременных с ПЭ и в группе контроля.

2. Изучить взаимосвязь носительства комбинаций вышеуказанных генов с формированием предрасположенности к развитию ПЭ и выявить комбинации аллельных вариантов генов, обладающие наибольшей прогностической ценностью.

3. Определить группы риска развития ПЭ по данным различных сочетаний генотипов полиморфизмов исследованных генов.

Научная новизна.

^ В результате проведенного исследования расширены представления о роли ряда генов белков, связанных с РААС, участвующих в плацентации, связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия, вовлеченных в системный воспалительный ответ, в развитии ПЭ и расширены представления о патогенезе данного осложнения. ^ Впервые проанализирована встречаемость различных комбинаций генотипов аллельных вариантов изученных генов у женщин с ПЭ в сравнении с женщинами с нормально протекающей беременностью.

^ Впервые изучен синергический эффект различных сочетаний «функционально неблагоприятных» генотипов, а также антагонистический эффект различных сочетаний «благоприятных» и «неблагоприятных» генотипов данных генов при развитии ПЭ. ^ Доказана возможность использования определения носительства мутантного аллеля 161А гена MBL2, мутантного аллеля D гена АСЕ и мутантного генотипа 235ТТ гена AGT в качестве информативных маркеров прогнозирования развития ПЭ.

Практическая значимость.

Определение комбинаций генотипов генов ACE, MBL2, AGT может быть использовано в качестве предгравидарного прогнозирования и доклинической диагностики ПЭ. Это позволит выделить группы риска развития ПЭ и провести раннее оздоровление женщин до и во время беременности с целью улучшения исхода беременности и родов.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. 1. Носительство аллельных вариантов генов белков, связанных с регуляцией АД (ACE, AGT), и белков, участвующих в развитии системного воспалительного ответа (MBL2), ассоциировано с развитием ПЭ с отечным синдромом.

   2. Оценка сочетаний генотипов генов (пары ACE-MBL2 и MBL2-AGT), а также подсчет количества одновременно выявляемых мутаций (пара ACE- MBL2) более точно определяют вероятность развития ПЭ.

   3. Носительство полиморфных маркеров разных генов имеет не только значимость, но и разнонаправленность действия (не только негативное, но и протективное) на вероятность развития ПЭ.

   4. Определение в крови мутантных аллельных вариантов генов ACE, MBL2 и AGT с применением балльной шкалы оценки результатов генотипирования аллельных вариантов данных генов, может быть применено для выявления степени риска развития ПЭ.

   5. Отечный синдром ассоциирован с тремя выявленными полиморфизмами, тогда как протеинурия и артериальная гипертензия (АГ) не связаны с полиморфизмами ACE i/D и AGT M235T, что может указывать на влияние других полиморфизмов в развитии АГ и протеинурии.

   Внедрение результатов исследования.

   Результаты исследования используются в учебном процессе; для оценки данных генотипирования пациенток с ПЭ; при выполнении государственного контракта № 16.512.11.2030 от 14 февраля 2011 г. с Министерством образования и науки РФ по теме «Разработка метода дифференцированного выявления генетических маркеров аллельных вариаций генов материнской и фетальной ДНК, ведущих к нарушению роста и развития плода, в крови матери».

   Апробация работы.

   Основные положения работы доложены и обсуждены на совместном заседании сотрудников кафедры биохимии и молекулярной медицины, кафедры акушерства и гинекологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии РУДН (8 июня 2012).

   Материалы диссертации доложены на 13м международном конгрессе по контраверсиям в акушерстве, гинекологии и вопросах бесплодия (Берлин, Германия, 2010).

   Публикации.

   По теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ в отечественной и зарубежной печати, из них 3 - в журналах, включенных в перечень ВАК РФ.

   Структура и объем диссертации.

   Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 21 отечественный и 144 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 25 рисунками.

   Генетические исследования преэклампсии в мире

   Процессы ангиогенеза являются основополагающими для формирования плаценты и ее правильного функционирования. Согласно данным большинства исследователей неполноценное ремоделирование спиральных артерий и последующая недостаточная инвазия трофобласта лежат в основе таких осложнений, как невынашивание беременности, преэклампсия, ФПН [17].

   Для обеспечения должного питания растущего эмбриона происходит активное развитие сосудистой сети эндометрия с участием таких ростовых факторов как сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor - VEGF), плацентарный фактор роста (placental growth factor -P1GF), основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor -bFGF), трансформирующий фактор роста-бета (transforming growth factor-beta GF-P), ангиопоэтины 1 и 2 типов (angiopoetin 1 et 2 - Ang-1 и Ang-2), а также MMPs.

   Наиболее значимое воздействие на ангиогенные процессы эндометрия оказывает VEGF, продуцируемый стромальными клетками в пролиферативную фазу [61]. При гипоксии происходит снижение экспрессии P1GF и повышение экспрессии VEGF, в то время как при повышенном содержании кислорода экспрессия P1GF повышается, a VEGF - снижается [116, 125].

   При физиологическом течении беременности связывание P1GF или VEGF с их рецептором - фмс-подобной тирозинкиназой 1 (fins-like tyrosine kinase-1 -Flt-1), который также называется VEGFR1, стимулирует ангиогенез и васкулогенез в плаценте. При аномальном ее развитии взаимодействие P1GF или VEGF с растворимой (soluble) формой Flt-1 (sFlt-1) инактивирует оба белка, препятствуя их связыванию с рецепторами на поверхности клетки, что ведет к состоянию ангиогенного дисбаланса и дисфункции эндотелия, блокаде ангиогенеза. Во время преэклампсии в плазме матери снижается концентрация свободного VEGF и P1GF, а концентрация sFlt-І и растворимого эндоглина (soluble endoglin - sEng) повышается [19, 53, 58, 63, 94, 104, 137, 144].

   Механизм увеличения sFlt-І в плаценте при преэклампсии неизвестен. Есть новые данные о причастности чувствительного к оксидативному стрессу протеина Gadd45ot (Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 alpha - индуцибельный задержкой развития и ДНК-повреждением белок гена GADD45 альфа), который повышается и активирует р38-киназу у беременных женщин с преэклампсией, коррелируя с увеличением sFlt-І. Оксидативный стресс, вызванный ишемией/реперфузией, воспалением, гипертонией, приводит к увеличению продукции Gadd45a, который активирует р38-киназу и в итоге повышает секрецию sFlt-І в эндотелиальных клетках [153]. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение роли Gadd45a в этиологии преэклампсии, и возможности использования ингибиторов р38 в качестве дополнения к терапии преэклампсии.

   Беременность служит тестом сосудистого стресса, выявляя женщин с нарушением неоваскулогенеза. Предшествовавшая дисфункция материнских сосудов под действием плацентарных факторов ответственна за развитие преэклампсии у этих женщин [104]. Согласно сосудистой теории, недостаточная плацентация вследствие нарушения ремоделирования сосудов приводит к сниженной маточно-плацентарной перфузии, чередующейся с реперфузией, в результате происходят процессы гипоксии/реоксигенации, стимулирующие продукцию sFlt-І и sEng, вызывая развитие преэклампсии. Недостаточная плацентация может скорее быть предпосылкой плацентарного оксидативного стресса, чем гипоксии, и эндотелиальная дисфункция может являться частью системного воспалительного ответа [58]. Следовательно, полиморфизм генов, кодирующих сосудистые ростовые факторы, потенциально может играть роль в процессах нарушения ангиогенеза.

   Эндотелий сосудов играет ключевую роль в поддержании нормального их функционирования посредством синтеза вазоактивных субстанций, в первую очередь оксида азота (N0) и эндотелина, регулирующих сосудистый тонус, агрегацию тромбоцитов и пролиферацию гладкомышечных элементов сосудистой стенки [12].

   Причинами эндотелиальной дисфункции могут быть различные факторы: ишемия/реперфузия тканей, оксидативный стресс, свободнорадикальное повреждение, дислипопротеинэмия (гиперхолестеринемия), активация цитокинового каскада при системных воспалительных процессах, гипергомоцистеинемия (ГГЦ), гипергликемия и инсулинорезистентность, АГ, эндогенные интоксикации (почечная недостаточность, панкреатит и др.), экзогенные интоксикации (курение и др.) [6]. Вследствие этого повышение функциональной активности молекул адгезии и хемокинов (макрофагальный хемоаттрактант пептид-1, ингибитор-1 активатора плазминогена) вызывает активацию воспалительных реакций, вазоконстрикцию и изменение параметров гемостаза.

   Объем исследования и контингент обследованных женщин и их новорожденных

   Из данных анамнеза анализировали: жалобы, возраст, вредные привычки, наследственность (наличие заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринной систем, преэклампсии в анамнезе у ближайших родственников женского пола), экстрагенитальные заболевания (сердечно-сосудистой системы, почек, нейро-эндокринные и системные аутоиммунные заболевания), а также гинекологические заболевания. Изучали характер менструальной функции (возраст менархе, время установления регулярного менструального цикла, продолжительность менструальных кровотечений, длительность одного менструального цикла, болезненность и интенсивность менструаций). Изучали репродуктивный анамнез.

   Лабораторные исследования включали анализы крови клинический и биохимический, гемостазиограмму, содержание глюкозы в плазме крови; анализы мочи общий, по Зимницкому, по Нечипоренко. Оценивали многоводие и маловодне по методу Phelan J.P (1987) [111]. 2.2.4 Молекулярно-генетическое исследование.

   АЛ Сбор и хранение образцов. Производили забор 5 мл периферической крови матери в стерильную вакуумную пробирку VACUETTE EDTA. Кровь хранится не более недели при 4С или неограниченно долго при минус 20С. Так как оптимальные результаты получаются при использовании свежей не замороженной крови, то выделение ДНК производилось через 6-12 часов после забора крови. Предварительно кровь разливали в эппендорфы по 700 мкл, чтобы избежать ненужного замораживания/оттаивания, которое сильно снижает выход и качество ДНК.

   Выделение геномной ДНК человека из цельной крови на сорбенте. В работе использовался набор «ДНК-сорб-Б» («АмплиСенс», Москва). В 1,5-мл эппендорфы со 100 мкл крови комнатной температуры добавлялось по 300 мкл прогретого при 65С лизирующего раствора. Полученная смесь перемешивалась на вортексе, прогревалась на термошейкере 10 мин при 65 С при 850 об/мин, далее центрифугировалась 5 сек. при 10000xg. Для выделения ДНК использовалась полученная надосадочная жидкость, перенесенная в новую пробирку. В каждую пробирку с полученной надосадочной жидкостью добавлялось 25 мкл ресуспендированного сорбента. Пробирки перемешивались на вортексе и отстаивались 5 минут. Далее сорбент осаждался центрифугированием при 3000xg в течение 30 сек., супернатант удалялся с помощью вакуумного отсоса и отдельного наконечника для каждой пробы. В пробирки с осажденным сорбентом добавлялось по 300 мкл раствора для отмывки 1, смесь перемешивалась на вортексе до полного ресуспендирования сорбента и опять цетрифугировалась при 3000xg в течение 30 сек. Полученный супернатант удалялся и добавлялось по 500 мкл раствора для отмывки 2. Смесь перемешивалась до полного ресуспендирования сорбента и центрифугировалась 30 сек. при lOOOOxg. Далее супернатант удалялся, процедура отмывки раствором 2 повторялась, затем супернатант удалялся полностью. Пробирки с открытыми крышками помещались на 7 минут в термостат для подсушивания сорбента при 65С. Затем добавлялось по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, полученная смесь прогревалась в термошейке 5 минут при 65 С с перемешиванием. Далее пробирки центрифугировались 1 минуту при 12000xg. Полученный супернатант, содержащий очищенную ДНК в концентрации около 50 нг/мкл, использовался для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

   Проведение генетического исследования нуклеотидных изменений полученных образцов ДНК включало в себя определение аллельных вариаций генов материнской ДНК, ведущих к нарушению процессов плацентации и развитию преэклампсии, включая гены факторов ангиогенеза и межклеточного взаимодействия, факторов, вовлеченных в развитие дисфункции эндотелия и системного воспалительного ответа, а также факторов, участвующих в регуляции артериального давления.

   С помощью ПЦР в режиме «реального времени» (real time) на амплификаторе Roto r-Gene-3 000 фирмы Corbett Research определяли полиморфность гена AGT М235Т. Полиморфность гена АСЕ i/D 287bp определяли также с помощью real time ПЦР, но на амплификаторе ДТ-96 фирмы ООО «НПО ДНК-Технология».

   Полиморфные аллели С677Т гена MTHFR, G894T гена NOS3, 4ab гена NOS3, С242Т гена CYBA, С936Т гена VEGF, С(-1562)Т гена ММР9, G161A гена MBL2 определялись методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) при помощи амплификатора «Mastercycler gradient» («Eppendorf», Германия). Полиморфность гена NOS3 4а/Ь определяли с помощью метода аллельспецифичной ПЦР при помощи амплификатора «Mastercycler gradient» («Eppendorf», Германия).

   Последовательности праймеров и температуры плавления были проверены при помощи программы «BLAST» (NCBI, США).

   ПЦР проводили на термоциклере Master Cycler Gradient фирмы Eppendorf с применением соответствующих праймеров и 10 мкл ПЦР-смеси фирмы «Интерлабсервис», содержащей 2 мМ MgCl2, ДНК-полимеразу Taq и краситель «Крезоловый красный».

   Методика постановки ПЦР реакции для выявления аллельных вариантов гена метилентетрагидрофолатредуктазы, MTHFR (полиморфизм С677Т).

   Определение полиморфизма С677Т гена MTHFR проводили методом ПЦР с последующей рестрикцией и определением длины фрагментов рестрикции в агарозном геле (метод ПДРФ) с использованием следующих праймеров:

   MTHFR S: 5 GA AGG AG A AGG TGT CTG CGG GA-3 MTHFR AS: 5 -AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3 ПЦР проводили в смеси объемом 25 мкл, включавшей по 6 пмоль каждого праймера, 250 мкМ каждого dNTP, 1 мкл (около 50 нг) геномной ДНК и 10 мкл ПЦР-смеси фирмы «Интерлабсервис».

   После горячего старта и первой денатурации (95С, 5 мин.) проводили амплификацию из 35 циклов, каждый из которых включал: денатурацию (95С, 10 сек.), отжиг праймеров (65С, 12 сек.), элонгацию (72С, 12 сек.). После 35-го цикла проводилась заключительная элонгация (72С, 2 мин.). Длина конечного продукта составляет 198 п.о.

   Анализ комбинаций полиморфных маркеров исследованных генов

   При объективной оценке телосложения оценивался индекс массы тела по Брею: масса тела (кг)/рост (м)А2, измеренные до беременности. Средние значения ИМТ в сравниваемых группах не выходили за пределы нормальных показателей, за исключением тяжелой преэклампсии, где среднее значение ИМТ входит в категорию повышенной массы тела (25,87±1,96 и 21,11±2,58, р=0,0040). Основная группа и группа контроля, а также женщины с преэклампсией различной степени тяжести, в сравнении с женщинами контрольной группы, имели статистически достоверную разницу средних значений ИМТ (р 0,05), таблица 3.7.

   Одним из показателей, по которым оценивают течение беременности, является общая прибавка массы тела во время беременности. Для сравнения было решено оценивать прибавку массы тела к сроку 36 недель гестации. Как видно из таблицы 3.8, отмечаются статистически значимые отличия прибавки массы тела во время беременности, при сравнении основной группы с контрольной (р 0,05). С утяжелением преэклампсии среднее значение прибавки массы тела увеличивается.

   При анализе наличия преэклампсии в предыдущую беременность у 35 из 57 (61,4%) повторнородящих женщин основной группы была выявлена преэклампсия в анамнезе. В группу сравнения включались женщины с отсутствием преэклампсии в предыдущую беременность.

   В анамнезе все беременные имели указания на различные инфекционные заболевания (ветряная оспа, краснуха, корь, эпидемический паротит, скарлатина, ангина, ОРВИ, коклюш, инфекционный мононуклеоз), которые с равной частотой встречались среди пациенток основной и контрольной групп.

   Сопутствующие экстрагенитальные заболевания выявлены в 69,8% беременностей, осложненных преэклампсиеи и выраженными отеками, что в 1,2 раза больше, чем в контрольной группе. Превалировали заболевания мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит, хронический цистит) - у 20 (17,2%), иммунной системы (аллергические реакции -нарушение, вовлекающее иммунный механизм, неуточненное (МКБ X -D89.9)) - у 29 (25,0%), миопия различной степени тяжести - у 40 (34,5%). Анемия отмечалась у 6 пациенток (5,2%) основной группы, что в сравнении с контрольной группой явилось статистически значимым, так как в группе контроля пациентки с анемией отсутствовали. С равной частотой встречались хронический бронхит, заболевания сердца (пролапс митрального клапана, аритмия), заболевания желудочно-кишечного тракта. Сочетания нескольких заболеваний - у 29,3% беременных с преэклампсиеи и выраженными отеками, а индекс сопутствующей преэклампсии соматической заболеваемости составил 1,13+1,04 (Мср±сд) для каждой пациентки. В контрольных группах преобладали заболевания желудочно-кишечного тракта - у 19 (19,0%), аллергические реакции - у 18 (18,0%), миопия различной степени - у 29 (29,0%), однако заболевания почек встречались в 1,9 раза реже, а аллергические реакции в 1,4 раза реже, нежели у беременных основной группы. Сочетания нескольких заболеваний - у 19,0% беременных группы контроля. Индекс соматической заболеваемости в контрольной группе составил 0,86±0,94. Структура сопутствующих экстрагенитальных заболеваний представлена в таблице 3.9.

   Менструальная функция обследованных пациенток оценивались по следующим показателям: возраст менархе; время, через которое установился регулярный менструальный цикл; продолжительность менструации, болезненность, количество выделений; регулярность и продолжительность менструального цикла. Менархе в основной группе варьировало от 9 до 17 лет и составило в среднем 13,08+1,30 лет, в отличие от группы контроля -13,31 ±1,28 лет (р=0,2137). На момент исследования анализ длительности становления регулярного менструального цикла, продолжительности менструального цикла (28,21±2,64 дней в основной группе и 28,94±2,76 дней в группе контроля) и менструаций (4,82±1,23 дней в основной группе и 6,34±0,69 дней в группе контроля) не выявил статистически достоверной разницы между группой преэклампсии и группой контроля (р 0,05). Однако при преэклампсии и отеках обращает внимание достоверно более высокая частота обильных менструаций и дисменореи - у 16,4% (19) и у 22,4% (26) соответственно, по сравнению с группой контроля - 5,0% (р=0,0088) и 10,0%) (р=0,01717) соответственно.

   Возраст начала половой жизни между группами достоверно не отличался и составил в среднем 17,47+2,06 лет и 17,74±2,52 лет для основной и контрольной групп соответственно (р=0,1935). Сравнение применявшихся методов контрацепции (табл. 3.10) выявило наиболее частое использование барьерных методов - каждая вторая пациентка из контрольной группы и почти каждые две пациентки из трех с преэклампсией и выраженными отеками. Комбинированные оральные контрацептивы (КОК) применяли 20,0% из группы с неосложнённой беременностью; внутриматочную контрацепцию (ВМК) - 4,0%; в основной группе данные методы использовались соответственно в 1,2 и 2,3 раз реже. Заслуживает внимания высокая частота coitus interruptus - 14,0% женщин из группы контроля и 11,2% среди женщин из основной группы, или отсутствие применения какого-либо метода контрацепции вообще (7,8% в основной группе и 5,0% в группе сравнения).

   Гинекологические заболевания в анамнезе выявлены у 50,0% пациенток, беременность которых осложнена преэклампсией и выраженными отеками, в группах с неосложнённой беременностью - у 43,0% (р 0,05). Статистически достоверная разница касалась только миомы матки, в основной группе она обнаружена у 5,2% пациенток, тогда как в контрольной группе ни у одной из женщин (р 0,05). Частота же инфекций передаваемых половым путем, вагинитов, сальпингоофоритов, эндометритов, нарушений менструального цикла, доброкачественных заболеваний шейки матки, эндометриоза и других гинекологических заболеваний достоверно не отличалась при сравнении женщин обеих групп (табл. 3.11), частота сочетания нескольких гинекологических заболеваний среди сравниваемых групп не отличалась. Индекс гинекологической заболеваемости у беременных основной группы составил 0,70±0,84, в контроле 0,63±0,90.

   Анализ полиморфных маркеров исследованных генов среди женщин с изолированным «отечным синдромом», с протеинуриеи и/или артериальной гипертензией и женщин группы контроля

   Полученные комбинации генотипов можно использовать как отдельный фактор при подсчете общей суммы баллов перинатального риска, используемой для оценки общего состояния беременной женщины с определением тактики ведения данной беременности. Таким образом, сочетаниям генотипов первой группы (низкий риск) можно присвоить 0 баллов, 2-ой группы (средний риск) -1 балл, 3 группе (высокий риск) - 2 балла. Комбинации с суммарным баллом 7,5 можно отдельно выделить как очень высокий риск развития преэклампсии (3 балла).

   РЕЗЮМЕ: При однофакторном анализе полиморфных маркеров исследованных генов у женщин обеих групп выявлены достоверные отличия в носительстве полиморфизмов АСЕ i/D, AGT М235Т, MBL codon 54. Носительство мутантной аллели полиморфизма codon 54 гена MBL2 или полиморфизма i/D гена АСЕ в 2,2 раза увеличивает шанс развития преэклампсии и отечного синдрома, в то время как мутантный генотип полиморфизма М235Т гена AGT в 2 раза снижает шанс развития данных осложнений. Также мы можем указать на значение дозы гена полиморфизма MBL2 codon 54, где при наличии двух мутантных аллелей (мутантный генотип) увеличивается шанс развития преэклампсии и отечного синдрома в 3 раза (неполное доминирование).

   При анализе сочетаний диплотипов исследованных генов мы обнаружили, что комбинации аллельных вариантов генов АСЕ и MBL2 (iD/161AA), MBL2 и AGT (161АА/235МТ) достоверно чаще встречаются среди пациенток с преэклампсией и отечным синдромом, в отличие от женщин группы контроля (р=0,0394 и р=0,0219 соответственно). Комбинации аллельных вариантов генов АСЕ и MBL2 (ii/161GG), MBL2 и AGT (161GG/235TT) встречаются достоверно наиболее редко среди пациенток с преэклампсией и отечным синдромом, по сравнению с женщинами группы контроля (р=0,0222 и р=0,0038 соответственно). Гомо- или гетерозиготное носительство одновременно двух мутантных аллелей D и 161А генов АСЕ и MBL2 (генотипы iD/161GA, iD/161AA, DD/161GA, DD/161AA) в 2,2 раза чаще встречалось среди женщин с преэклампсией и отечным синдромом. Мутантный генотип 235ТТ гена AGT при сочетании с гетеро- или гомозиготным мутантным генотипом гена АСЕ в 1,5 раза реже наблюдается у женщин основной группы по сравнению с контролем (р 0,05). А при сочетании с гетеро- и гомозиготным мутантным генотипом гена MBL2 мутантный генотип 235ТТ гена AGT теряет свою протективную роль, однако снижает патогенное действие мутантной аллели 161А гена MBL2 (р 0,05).

   При многофакторном анализе полиморфных маркеров исследованных генов выбрана модель логистической регрессии с участием следующих аллельных вариантов генов: АСЕ (iD+DD), MBL2 (161GA+161AA), AGT (235ТТ), где MBL2 (161GA+161AA) имеет наибольший коэффициент значимости, a AGT (235ТТ) - наименьший. На основании данной модели нами были сформированы 3 группы комбинаций генотипов исследованных генов, где достоверные отличия по наличию полученных комбинаций были выявлены в 1 группе (21,5% у женщин основной группы и 41,0% у женщин группы контроля, р=0,0029), в 3 группе (35,4% у женщин основной группы и 17% у женщин группы контроля, р=0,0033). Причем три комбинации из 3-ей группы с баллом 7,5 встречались только среди женщин основной группы (7,8% против 0% у женщин группы контроля, р=0,0040).

   На основании полученных данных многофакторного анализа полиморфных маркеров исследованных генов были выделены комбинации низкого, среднего, высокого и очень высокого риска развития преэклампсии и отечного синдрома. Так, шанс развития преэклампсии и отечного синдрома среди женщин 1-й группы составил 0,40 при 95% ДИ [0,22-0,72] (низкий риск). Во второй группе шанс развития данных осложнений равнялся 1,05 (средний риск). Шанс развития преэклампсии и отечного синдрома в 3-й группе составил 2,67 при 95%о ДИ [1,39-5,11] (высокий риск). Комбинации с суммарным баллом 7,5 можно отдельно выделить как очень высокий риск развития преэклампсии и отечного синдрома.

   Анализ ассоциаций исследованных полиморфных маркеров у женщин с изолированным отечным синдромом и с протеинурией и/или АГ.

   Среди женщин с изолированным выраженным отечным синдромом по сравнению с женщинами группы контроля были выявлены: достоверно более высокий процент гетеро- и гомозиготных носительниц мутантной аллели D гена АСЕ (84,0% и 63,0% соответственно, ОШ=3,08, 95% ДИ [1,30 - 7,32], р=0,0084); достоверно более высокая частота встречаемости мутантной D-аллели гена АСЕ (53,0% и 40,5%, р=0,0487); достоверно реже встречалось гомозиготное носительство мутантной 235Т-аллели гена AGT (12,0% и 29,0%, ОШ=0,33, 95% ДИ [0,13 - 0,88], р=0,0240); достоверно более высокий процент гетеро- и гомозиготных носительниц мутантной аллели 161А гена MBL2 (42,0% и 22,0%, ОШ=2,57, 95% ДИ [1,22 - 5,38], р=0,0132). Частота встречаемости мутантной 161А-аллели гена MBL2 была достоверно выше как среди женщин с изолированным отечным синдромом, так и среди женщин с

   Похожие диссертации на Генетические маркеры прогнозирования преэклампсии

   Клиническое значение выявления тромбофилии, маркеров воспаления и эндотелиопатии для прогнозирования и профилактики повторной преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты и отслойки хориоПанфилова, Ольга Юрьевна

   Клиническое значение контроля маркеров эндотелиопатии, воспаления и системы гемостаза в прогнозировании и профилактике осложненного течения многоплодной беременностиМакацария, Наталия Александровна

   

   Прогнозирование овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий с использованием молекулярно-генетических маркеровВладимирова Инна Владимировна