Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы 10 стр.
1.1. Применение альтернативных методов в токсикологических исследованиях в зарубежной и отечественной практике 10 стр.
1.2. Применение суспензии сперматозоидов быка в качестве альтернативного тест-объекта для изучения токсичности и опасности ксенобиотиков 16 стр.
1.3. Гигиеническая безопасность поверхностно-активных веществ, моющих и чистящих средств на их основе 22 стр.
Глава 2. Объекты и методы исследования собственные исследования 30 стр.
Глава 3. Токсикометрические параметры моющих и чистящих средств 45 стр.
3.1. Изучение острой токсичности при пероральном поступлении в организм моющих и чистящих средств 45стр.
3.2. Изучение местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз лабораторных животных 47 стр.
Глава 4. Особенности цитотоксического действия моющих и чистящих средств на суспензию сперматозоидов быка 52 стр.
4.1. Определение параметров токсического действия моющих и чистящих средств на суспензию сперматозоидов быка 52 стр.
4.2. Установление возможности прогнозирования опасности моющих и чистящих средств для теплокровных по данным исследований на суспензии сперматозоидов быка 58 стр.
Глава 5. Межлабораторные сравнительные испытания по оценке токсичности моющих и чистящих средств на суспензии сперматозоидов быка воспроизводимость результатов исследований 67 стр.
Глава 6. Исследование ПАВ 75 стр.
6.1.Определение сорбции поверхностно-активных веществ на посуде после их применения 75 стр.
6.2. Исследование цитотоксичности поверхностно-активных веществ и их композиций, входящих в рецептуры моющих и чистящих средств 78 стр.
Глава 7. Влияние составленных рецептур жидких чистящих средств на организм лабораторных животных 88 стр.
Глава 8. Обсуждение результатов исследований 99стр.
Выводы 112 стр
Список литературы 114 стр.
Приложения 134 стр
- Применение суспензии сперматозоидов быка в качестве альтернативного тест-объекта для изучения токсичности и опасности ксенобиотиков
- Объекты и методы исследования собственные исследования
- Изучение местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз лабораторных животных
- Установление возможности прогнозирования опасности моющих и чистящих средств для теплокровных по данным исследований на суспензии сперматозоидов быка
Введение к работе
Актуальность исследований
В условиях постоянного увеличения количества новых химических веществ, поступающих в обращение, актуальной проблемой является их изучение в целях получения информации о потенциальной опасности веществ и разработки профилактических мероприятий, предусматривающих предотвращение неблагоприятного воздействия на организм человека и окружающую среду [Потапов А. И. и соавт., 2002 г.].
Среди комплекса факторов окружающей среды, подлежащих гигиеническому контролю, большого внимания заслуживают товары бытовой химии (ТБХ) в связи с их массовым производством и использованием, разнообразием компонентов, входящих в состав рецептур, а также с возможным прямым воздействием на организм человека [Воло-щенко О. И. и соавт., 1988]. Эти обстоятельства требуют гигиенического изучения современных моющих и чистящих средств на основе поверхностно-активных веществ (ПАВ).
Выявление и предотвращение неблагоприятного воздействия на организм токсического фактора является одной из главных задач профилактической токсикологии, основным приемом которой служат экспериментальные методы исследований. Применяя общепринятые методы токсикологических исследований для оценки опасности моющих и чистящих средств на лабораторных животных, токсикологи не имеют достаточных возможностей удовлетворить запросы практики, поэтому возникает необходимость оптимизации существующих методических подходов. Кроме того, этические аспекты, материальные и временные затраты ограничивают область применения лабораторных животных в токсикологических исследованиях, поэтому является актуальным поиск адекватных альтернативных тест-систем и научное обоснование их прогнозирующей способности.
Методы, альтернативные исследованиям на теплокровных животных, получили признание и широкое распространение в мире, где в соответствии с принятыми законодательными актами произошли изменения в подходах оценки безопасности продукции [Hartung Т., Bremer S., Casati S., Coecke S. et.al., 2003].
В отечественной практике активно развиваются исследования возможности применения альтернативных биологических моделей и
имеются положительные результаты использования альтернативных методов для оценки токсичности полимерных материалов, парфюмерно-косметической продукции, воды, почвы, воздуха и других объектов окружающей среды [Лаппо В. Г., Перова Н. М. и соавт., 2003; Кокшарева Н. В., Трахтенберг И. М. и соавт., 2003; ДядищевН. Р., Рыбалкин С. П., 2003].
В ходе накопления материала было показано, что результаты исследований скрининговой оценки токсичности на альтернативных биологических тест-объектах играют вспомогательную роль на этапе идентификации опасности потенциально вредных факторов [Кожевникова И. Ф., Морылев И. В. и соавт.; Завьялов Н. В., Клочкова С. И. и соавт., 2003]. Вместе с тем на данный период времени остаются нерешенными вопросы разработки методических подходов по оценке токсичности моющих и чистящих средств с применением суспензионной культуры подвижных клеток (спермы быка) и возможность прогнозирования их токсичности и опасности для теплокровных животных. Особую значимость эти исследования приобретают при проведении гигиенических и токсикологических оценок, а также сертификации соответствия продукции при осуществлении Госсанэпиднадзора в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения.
Работа выполнялась в рамках отраслевой программы Минздрава России «Системная разработка мероприятий по гигиенической безопасности России (2001—2005 гг.)».
Цель работы: гигиеническое обоснование прогнозирования токсичности и опасности бытовых моющих и чистящих средств, поверхностно-активных веществ для теплокровных с применением альтернативного метода на суспензии сперматозоидов быка.
Задачи исследования:
Провести токсиколого-гигиенические исследования образцов моющих и чистящих средств на лабораторных животных по оценке острой пероральнои токсичности, местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаза, кожно-резорбтивного и сенсибилизирующего действия.
Изучить цитотоксическое действие моющих и чистящих средств, ПАВ на суспензии подвижных клеток — сперматозоидах
быка. Провести оценку остаточных количеств ПАВ на обрабатываемых изделиях.
Выявить корреляционную связь показателей токсичности и опасности моющих и чистящих средств для изучаемой альтернативной биологической модели и теплокровных, разработать критерии оценки токсичности in vitro.
Установить воспроизводимость результатов исследований, полученных на суспензии сперматозоидов быка при скрининге моющих и чистящих средств в межлабораторных исследованиях.
Показать эффективность альтернативного метода с применением суспензии сперматозоидов быка при оценке токсичности моющих и чистящих средств и определить оптимальные регламенты применения препаратов бытовой химии.
Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:
-установлены параметры цитотоксического действия моющих, чистящих средств и ПАВ на суспензию сперматозоидов быка;
выявлена достоверная корреляционная связь между показателями острой токсичности моющих и чистящих средств для теплокровных животных и для суспензии сперматозоидов быка;
обоснована прогнозирующая способность альтернативного метода при оценке токсичности и опасности моющих и чистящих средств и его применение в качестве скрининга на предварительном этапе ток-сиколого-гигиенических исследований с целью сертификации соответствия продукции в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия;
-установлен единый механизм формирования острой пер-оральной токсичности для теплокровных и суспензии сперматозоидов быка, что явилось научной основой для оценки степени их опасности по общему принципу согласно гигиенической классификации вредных веществ.
Практическая значимость работы:
Обоснованы с позиций гигиенической безопасности оптимальное содержание в рецептурах моющих и чистящих средств анионных и неионогенных ПАВ; регламенты применения изученных ТБХ (двукратный режим споласкивания, для применения в быту 1 % рабочий раствор), при которых остаточные количества ПАВ на посуде
ниже утвержденных ПДК; прогнозирующая способность суспензии подвижных клеток сперматозоидов быка для оценки токсичности и опасности моющих и чистящих средств в рамках токсиколого-гигиенических исследований;
Материалы выполненных исследований:
использованы при разработке методических рекомендаций «Оценка токсичности товаров бытовой химии (ТБХ). Экспресс-метод оценки токсичности моющих и чистящих средств с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота», MP № 29 ФЦ/4746 от 27.12.01 г.;
внедрены в работу 38 токсикологических подразделений ФГУЗ ЦГиЭ Роспотребнадзора;
внедрены и используются в учебном процессе медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования ММА им. И. М. Сеченова на циклах повышения квалификации.
Результаты исследований использованы при подготовке материалов по токсиколого-гигиенической оценке 67 образцов моющих и чистящих средств, на основании которых выданы соответствующие санитарно-эпидемиологические заключения (заключения Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 2001—2006 гг.).
Проведенный выборочный анализ воспроизводимости результатов оценки моющих средств в 10 лабораториях центров гигиены и эпидемиологии подтвердил адекватность использования метода задачам токсиколого-гигиенического исследования.
Результаты работы доложены и обсуждены на:
Втором съезде токсикологов России 10—13 ноября 2003 г. (г. Москва);
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Суздаль, 2005 г.);
Научно-практической конференции «Гигиеническая наука и санитарная практика в творчестве молодых» (ФГУН ФНЦГ им. Ф. Ф. Эрисмана, 2005 г.).
Апробация работы проведена на межотдельческой конференции Федерального научного центра гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана 8 февраля 2007 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ в журналах, сборниках научных трудов, материалах научно-практических конференций.
Структура и объем диссертации: Работа изложена на 151 странице, состоит из введения, аналитического обзора литературы, характеристик объектов, методов и объемов исследований, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов, указателя литературы, включающего 187 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 33 рисунками, включает 8 приложений.
Основные положения, выносимые на защиту:
Сравнительный анализ параметров острой токсичности моющих и чистящих средств для теплокровных и суспензии сперматозоидов быка.
Гигиеническое обоснование прогнозирования опасности моющих и чистящих средств для организма млекопитающих на основании альтернативного метода с применением суспензии сперматозоидов быка.
Зависимость уровня токсичности и опасности моющих и чистящих средств от процентного соотношения ПАВ в рецептуре, от их физико-химических свойств.
Обеспечение воспроизводимости результатов в межлабораторном эксперименте при скрининге моющих и чистящих средств.
Применение суспензии сперматозоидов быка в качестве альтернативного тест-объекта для изучения токсичности и опасности ксенобиотиков
Анализ данных литературы показал, что культуры клеток млекопитающих отличаются высокой чувствительностью к действию ксенобиотиков и являются достаточно адекватными моделями при изучении токсического действия, причем основная часть работ выполнена на суспензии сперматозоидов быка [120-124].
Сперматозоиды могут существовать вне организма в средах простого состава достаточно длительное время без изменения своих функциональных свойств. Общая длина сперматозоида быка - 65-75 мкм.
Спермий состоит из головки, которая составляет 51% общей массы сперматозоида, шейки, тела и жгутика. В головке сперматозоида находится гаплоидное ядро, прикрытое акросомой - особой структурой, ограниченной мембраной, функционально ее можно рассматривать как увеличенную лизосому. В короткой шейке спермия расположена пара центриолей, лежащих под прямым углом друг к другу. Микротрубочки одной из них удлиняются, образуя осевую нить жгутика, которая проходит вдоль всей остальной части сперматозоида. Тело сперматозоида расширено за счет содержащихся в нем многочисленных митохондрий, собранных в спираль вокруг жгутика. Митохондрии доставляют энергию для сократительных механизмов, обеспечивающих движения жгутика. Основную массу спермы составляет вода - 85-98%, 2-5% - сухое вещество, при этом 49% сухого вещества составляет белок (в сперме быков). В сперме быков преобладают хлористые, лимоннокислые соли натрия и калия.
Основное назначение половых клеток - продвижение к месту оплодотворения, то есть подвижность сперматозоидов можно рассматривать как интегральный показатель их физиологического, биохимического и морфологического статуса [63].
Для движения сперматозоидов характерно прямолинейное вращательно-поступательное. Жгутик совершает ритмические волнообразные движения, при этом волна изгибания распространяется от основания к концу. С течением времени сила движения сперматозоидов ослабевает и движение переходит в манежное (по кругу с большим радиусом), затем в колебательное.
Главным источником энергии для поступательного движения сперматозоидов является аденозинтрифостфат (АТФ), синтез которых осуществляют митохондрии. Митохондрии представляют собой окруженные двойной мембраной органеллы, их основная функция связана с окислением органических соединений и использованием освобождающейся при распаде этих соединений энергии в синтезе молекул АТФ. Поэтому митохондрии часто называют энергетическими станциями клетки. Повреждение структурной основы митохондрий токсическим агентом приводит к нарушению их энергообразующей функции.
Сперма быка содержит относительно большие количества Сахаров, поэтому по характеру обмена веществ относится к гликолитическому типу (анаэробное окисление). В процессе гликолиза происходит неполное окисление субстрата, гликолетический процесс слагается из ряда ферментативных реакций, в результате которых глюкоза оказывается расщепленной на две молекулы молочной кислоты, которая накапливается в сперме и сдвигает ее реакцию в кислую сторону, рН — 5,9-7,3. Образовавшиеся в результате гликолиза триозы, и в первую очередь пировиноградная кислота, вовлекаются в дальнейшее окисление, происходящее в митохондриях. При этом используется энергия расщепления всех химических связей, что приводит к выделению С02 , потреблению кислорода и синтезу большого количества АТФ.
Двигательная функция сперматозоидов сохраняется до тех пор, пока в клетке митохондрии синтезируют АТФ. При одновременном выключении дыхания и гликолиза по мере израсходования АТФ падает интенсивность движения сперматозоидов, а с исчерпанием запаса АТФ полностью подвижность прекращается. Для восстановления подвижности сперматозоидов необходимо создание условий для гликолиза или дыхания, так как в плазме спермы АТФ не содержится и АТФ не может проникать через оболочку спермия. [5, 14, 94, 102].
Таким образом, можно предположить, что действие токсикантов на сперматозоиды нарушает энергетический обмен клетки, вызывая прекращение работы митохондрий, что приводит к изменению двигательной активности сперматозоидов.
В литературе имеются данные по изучению токсичности материалов, используемых при сборе спермы животных и искусственном оплодотворении [114, 116, 130,131,149,150,157]. Был определен токсический эффект на сперматозоидах таких материалов, как шприцы, бутылки для хранения образцов спермы и хирургических перчаток [144,150]. Установлено, что наиболее чувствительным методом определения токсичности, по сравнению с методом дифференциальной окраски, является оценка подвижности спермиев [157].
Разными исследователями была изучена цитотоксичность некоторых химических веществ с различными механизмами токсического действия на суспензию сперматозоидов быка. Оценка токсического действия проводилась по времени подвижности сперматозоидов [36,67,82,167]. На основании результатов исследований был сделан вывод, что токсический ответ может быть получен независимо от вида механизма токсического действия исследуемых соединений.
В последствие суспензионная культура клеток сперматозоидов быка была предложена в качестве инвитровой модели для оценки токсичности индивидуальных химических веществ, полимерных материалов и вытяжек из них [166-170,174]. Количественная оценка цитотоксического потенциала химических веществ проводилась по двигательной активности сперматозоидов, напрямую зависящей от нарушения клеточных структур и функций. Данный метод по своей чувствительности сопоставим с исследованиями цитотоксичности на такой культуре клеток, как HeLa (постоянная линия клеток человека - карцинома шейки матки). Измерение прекращения двигательной активности сперматозоидов является конечным результатом воздействия токсикантов и позволяет определить общее цитотоксической действие изучаемых химических соединений. Указанная биологическая модель может использоваться для скринингового тестирования, первичной оценки токсичности химических веществ и может быть рекомендована для включения в батарею тестов in vitro для оценки токсичности [174].
Объекты и методы исследования собственные исследования
Для достижения основной цели настоящей работы была разработана и реализована программа научного исследования возможности прогнозирования токсичности и опасности моющих и чистящих средств, ПАВ для теплокровных на основании скринингового тестирования на суспензии сперматозоидов быка. Направление, объем и методы исследования представлены в таблице 2.1. Объектами исследования являлись: - 67 образцов чистящих и моющих средств (средства для мытья посуды - 17 образцов, универсальные чистящие средства для любых поверхностей - 33 образца, порошкообразные моющие средства — 5 образцов, жидкие моющие средства - 4 образца, вспомогательные средства для обработки белья - 8 образцов), Приложение 1; исследованы экспериментальные составы жидких моющих средств (3 образца), которые были разработаны в лаборатории ЗАО «НИЦБЫТХИМ» на основе вышеперечисленных ПАВ (составленные рецептуры жидких моющих средств - в Приложении 3). - Изучены также наиболее перспективные и широко применяемые представители поверхностно-активных веществ, которые широко используются в быту в составе моющих и чистящих средств: анионные ПАВ додецилсульфат натрия, линейный алкилбензосульфонат, альфа-олефинсульфонаты, сульфоэтоксилаты, неионогенные ПАВ - неонол АФ 9-12, оксиэтилированные жирные спирты (Lutensol А07) (в Приложении 2 приведены физико-химические свойства и токсикометрические показатели изучаемых ПАВ);
Исследования образцов моющих и чистящих средств на животных проводились в общем плане работ по санитарно-эпидемиологической экспертизе товаров бытовой химии на базе ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве» и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области». Экспериментальные исследования воздействия моющих и чистящих средств на организм лабораторных животных проводили в остром опыте при однократном пероральном поступлении. Испытания выполнены на 606 половозрелых беспородных мышах в соответствии с МУ № 1109-73 «Методические указания по гигиенической оценке и санитарному контролю за применением, хранением и продажей населению предметов бытовой химии». В желудок вещества вводили с помощью металлического зонда в виде водных растворов утром натощак. Контрольные животные одновременно с опытными в равных объемах получали растворитель. Наблюдения за общим состоянием и весом животных проводилось в течение двух недель.
Обработку полученных данных и расчет ЛД50 проводили при помощи пробит-анализа по методу Литчфилда — Уилкоксона и по методу Беренса [26,75]. Исследование местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз проводили на 536 морских свинках согласно МУ № 2102-79 «Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи» [76], МУ 2196-80 «Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны» [77]. С целью выявления местного раздражающего действия на кожу при однократных аппликациях на подготовленный участок кожи размером 6x5 см наносили испытуемое вещество в нативном виде в дозе 20 мг/см2 (при среднем весе морской свинки 240 г соответствует 2500 мг/кг). Испытания проводили на морских свинках, статистическая группа составляла 8 здоровых особей. Исследуемые экспериментальные составы моющих средств (3 образца) наносились однократно и повторно на выстриженный участок кожи в нативном виде и в виде 1% раствора в дозе 20 мг/см , что соответствует 2500 мг/кг и 25 мг/кг при средней массе тела крыс 125 г. При определении раздражающего действия на кожу правый бок животного служил для аппликации изучаемого вещества, левый — для контроля. Для исключения слизывания вещества с кожи животных помещали в индивидуальные домики. Время экспозиции составляло 4 часа. По окончании экспозиции остатки вещества удалялись теплой водой. Реакция кожи регистрировалась визуально по окончанию экспозиции, через 1 час и 24 часа после однократной аппликации [76]. Функциональное состояние кожи оценивали по степени эритемы с помощью колориметрических линеек С.В.Суворова и по отеку кожи путем измерения толщины кожной складки (в мм). Показатели степени эритемы и отека суммировались для каждого животного, после чего вычислялся средний суммарный балл для группы экспериментальных животных. Для исследования действия образцов моющих и чистящих средств на слизистые оболочки глаза жидкие вещества вводились животным в конъюктивальный мешок правого глаза в количестве 1-2 капель средства в рабочей концентрации. Слезно-носовой канал при этом на 1 минуту прижимался пальцем. Левый глаз животного являлся контролем. О раздражающем действии моющих и чистящих средств на слизистую оболочку глаза судили по наличию гиперемии и отечности. Наблюдения за состоянием слизистой оболочки глаза проводили визуально в течение двух недель [77, 97].
Изучение местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз лабораторных животных
Для изучения возможности прогнозирования опасности и токсичности чистящих и моющих средств методом in vitro в качестве альтернативной биологической модели использовали кратковременную суспензионную культуру клеток - сперму быка, замороженную в парах жидкого азота [16,17].
О функциональном состоянии сперматозоидов судили по интегральному показателю - двигательной активности сперматозоидов, критерием оценки которой служил индекс токсичности Is. В ходе работы было проведено 275 инвитровых исследований 67 образцов чистящих средств для различных поверхностей и моющих средств. В исследованную группу чистящих средств (№№1-51) входили: средства для мытья посуды, для изделий из стекла, фарфора и фаянса, универсальные средства специального назначения (для чистки духовок, СВЧ-печей, средства для уборки кухни, для чистки ковров и т.п.). В группу моющих средств (52-67) входили: синтетические стиральные средства (порошкообразные и жидкие), вспомогательные средства для обработки белья (Приложение 1).
Моющие и чистящие средства в нативном виде имеют высокую цитотоксичность в дозах, не являющихся при этом токсичными при контакте с целостным организмом млекопитающих, поэтому для выявления токсичности на клеточном тест-объекте необходимо было найти для каждого образца максимальную концентрацию раствора, которая не оказывала бы цитотоксического действия на суспензионную культуру клеток - сперму быка. Для этого готовились растворы из исследуемых образцов моющих и чистящих средств и экспериментально были определены следующие концентрации: 0,1%, 0,067%, 0,05%, 0,04%, что соответствует разведениям (г/мл): 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500.
Изменение двигательной активности сперматозоидов быка во времени под воздействием веществ, содержащихся в растворе, регистрировали с помощью анализатора изображений АТ-05. Оценка цитотоксичности каждого раствора моющих и чистящих средств проводилась по индексу токсичности Is.
Значения индекса токсичности, полученные в данном исследовании моющих и чистящих средств, представлены в таблице 4.1., зависимость значений индекса токсичности от концентрации растворов исследуемых препаратов - в Приложении 5.
Индекс токсичности может принимать значения от 0 до 100% и выше, чем ниже значения индекса токсичности, тем сильнее цитотоксическое действие оказывает испытуемый образец. Также и значения индекса токсичности намного превышающие 100% предполагает наличие цитотоксического действия.
По данным, представленным в таблице 4.1, выявлена зависимость значений индекса токсичности от концентрации испытуемых растворов моющих и чистящих средств (Приложение 5). При действии растворов в концентрации 0,1% наблюдается наиболее выраженный цитотоксический эффект, индекс токсичности составлял менее 70%. При воздействии на суспензию сперматозоидов растворов исследуемых средств в концентрации 0,04% двигательная активность сперматозоидов сохранялась на уровне двигательной активности в контроле. Для большинства образцов моющих и чистящих средств концентрация 0,04% является максимальной, при которой наблюдается наименьший цитотоксический эффект.
При сопоставлении данных, полученных при исследованиях цитотоксичности на суспензии сперматозоидов быка и острого действия при внутрижелудочном введении (ЛД50), острого местного раздражающего действия на животных (таблицы 3.1, 4.1 и 4.2), можно предположить, что для суспензии сперматозоидов быка оптимальной концентрацией исследуемых растворов является 0,04%, т.е. соотношение массы испытуемого образца (г) к объему (мл) дистиллированной воды 1:2500. При данной концентрации растворов чистящих и моющих средств, ЛД50 которых более 5000 мг/кг, значения индекса токсичности Its вытяжек от 70% до 119% (обр. №№ 1, 30). Чистящие и моющие средства, ЛД50 которых ниже 5000 мг/кг и/или обладают раздражающим действием на кожу (2 и 3 класс), при данной концентрации имели значения индекса токсичности Its ниже 70% или выше 119%. Значения индекса токсичности Its образцов чистящих средств № 1,2, 18, 52 и 42 (70%, 72%, 71%, 65% и 61% соответственно) находятся близко друг от друга, но токсическое действие на целостный организм животного проявляется по-разному: для образцов №№ 1 и 2 ЛД50 при внутрижелудочном введении составляет более 5000 мг/кг и раздражающее действие отсутствует, образец №№ 18 - ЛД50 более 5000 мг/кг и обладает слабым раздражающим действием, образцы №№ 52 и 42 - ЛД50 менее 5000 мг/кг. Можно предположить, что нижняя граница интервала значений индекса токсичности при исследовании 0,04% растворов моющих и чистящих средств находится в диапазоне 65-72%. При анализе значений индекса токсичности образцов №№ 14, 30, 36 (Its равен 119%, 117% и 117% соответственно), ЛД50 при внутрижелудочном введении составляет более 5000 мг/кг и образца № 41 (Its равен 147%), ЛД50 которого составляет менее 5000 мг/кг следует, что верхняя граница значений индекса токсичности находится в диапазоне 117-147%.
Установление возможности прогнозирования опасности моющих и чистящих средств для теплокровных по данным исследований на суспензии сперматозоидов быка
Для обоснования оптимальных параметров оценки токсичности моющих и чистящих средств альтернативным методом с применением суспензии сперматозоидов быка проведен корреляционный анализ данных, в результате которого определен интервал значений индекса токсичности и оптимальная концентрация растворов моющих и чистящих средств, при которых коэффициент корреляции имеет максимальное значение. Проведено более точное сопоставление экспериментально полученных данных по острой токсичности при пероральном введении лабораторным животным и сперматозоидах быка и по острому раздражающему действию на кожу. Результаты исследований на животных являлись приоритетными. Массив экспериментальных данных был представлен в альтернативной форме: 0 - среднесмертельная доза ЛД50 более 5000 мг/кг, 1-среднесмертельная доза ЛД50 менее 5000 мг/кг. Значение индекса токсичности задавали как «скользящее», условно принимаемое за критерий токсического действия для сперматозоидов быка. Алгоритм преобразования результатов испытаний на сперматозоидах быка в альтернативную использовали следующий: где Its - значения индекса токсичности в альтернативной форме. Далее строили зависимость r= f (Itsiim) задаваемых предельных значений индекса токсичности от результатов исследований на целостном организме животных.
Коэффициент корреляции между двумя выборками с качественной изменчивостью вычисляли по формуле [87]: где a, b, с, d - классы корреляционной решетки (табл. 4.3) Для каждого предельного значения индекса токсичности Is строили корреляционную решетку и вычисляли коэффициент корреляции. Предельное значение индекса токсичности ItSHm задавалось через каждые 5%. По полученным данным была построена зависимость r= f (ItSHm) в двух интервалах: 0 Its 100% и 100% Its оо (рис. 4.1 - 4.3) для 0,04, 0,05, 0,067 % растворов моющих и чистящих средств. Значения индекса токсичности, при которых наблюдается максимум функции r= f (ItShm) соответствует границам интервала значений индекса токсичности. Концентрация испытуемых растворов моющих и чистящих средств, при которой наблюдается максимальное значение коэффициента корреляции, является оптимальной. Нетоксичными признаются вытяжки в интервале ІпіпТ " Its S Itsiimmax Проведенный анализ данных показал, что максимальные значения коэффициента корреляции наблюдаются при концентрации моющих и чистящих растворов - 0,04%, где интервал значений индекса токсичности составляет 70% - 132% (таблица 4.4). Данные значения можно считать границами интервала значений индекса токсичности, в пределах которого растворы моющих и чистящих средств, признаются малоопасными. По аналогии нами было проведено сопоставление экспериментально полученных данных на сперматозоидах быка и по острому раздражающему действию на кожу лабораторных животных.
Результаты исследований на животных являлись приоритетными. Массив экспериментальных данных был представлен в альтернативной форме: 0 - не оказывает раздражающего действия на кожу, 1- оказывает раздражающее действие на кожу. Значение индекса токсичности задавали как «скользящее», условно принимаемое за критерий токсического действия для сперматозоидов быка. По результатам вычислений была построена зависимость г= f (Itsiim) в двух интервалах: 0 Its 100% и 100% Its оо (рис. 4.4 - 4.6). По данным, представленным в таблице 4.5, следует, что максимальные значения коэффициента корреляции наблюдаются при 0,04% концентрации моющих и чистящих средств и соответствуют 70% и 130% индекса токсичности (г = 0,59 и 0,31 соответственно). Полученные при сопоставлении данных исследований острого действия на кожу лабораторных животных и цитотоксического действия на сперматозоиды быка коэффициенты корреляции свидетельствуют о слабой связи. Данные корелляционного анализа токсикометрических показателей (табл.4.4 и 4.5) свидетельствуют о более высокой связи индекса токсичности и результатами острой пероральной токсичности на лабораторных животных, чем при сопоставлении с результатами местного раздражающего действия на кожу животных. Таким образом, используя экспериментально установленные оптимальные условия приготовления растворов чистящих и моющих средств и границы интервала значений индекса токсичности, из 67 образцов, исследованных на суспензии сперматозоидов быка, выявлено 17 образцов данной продукции (5,12, 22, 39, 40, 41, 42, 46-54, 67), значение индекса токсичности которых лежит вне интервала 70 - 132 %. 12 образцов №№ 5, 12, 22, 39, 40, 41, 42, 50, 51, 52, 53, 54 при исследованиях на животных имели ЛД50 ниже 5000 мг/кг и оказывали умеренное или выраженное раздражающее действие на кожу при однократном нанесении (таблица 4.2). Для 5 образцов №№ 46, 47, 48, 49, 67 при исследованиях на лабораторных животных ЛД50 составляла более 5000 мг/кг и не выявлено раздражающего действия на кожу, исследования на суспензии сперматозоидов быка выявили цитотоксическое действие. Анализ рецептур образцов данных препаратов выявил, что в состав включены натрия гидроокись или органические кислоты, которые возможно вызывают сдвиг рН раствора, тем самым оказывая цитотоксическое действие на суспензию сперматозоидов быка, для которой характерна среда рН 5,9-7,3 [102]. Для 3 образцов №№ 18, 21, 35 значения индекса токсичности находятся в интервале 70-132%, при исследованиях на теплокровных ЛД50 составила более 5000 мг/кг, при однократном нанесении на кожу выявлено слабое раздражающее действие, цитотоксичность для данных образцов при установленных условиях эксперимента не была выявлена. В результате проведенных исследований установлено, что суспензия сперматозоидов быка обладает достаточно высокой чувствительностью к воздействию моющих и чистящих средств в диапазоне концентраций растворов 0,1% - 0,04% (таблица 4.1, приложение 5). Таким образом, на основании экспериментально установленных параметров оценки моющих и чистящих средств на суспензию сперматозоидов быка выявлено токсическое действие 17 образцов - 25.4 %. Установлена корреляционная связь между индексом токсичности, вычисленным по результатам in vitro, и ЛД50 при пероральном поступлении и раздражающим действием на кожу теплокровных для изученных 67 препаратов, что послужило обоснованием для прогнозирования опасности моющих и чистящих средств при их тестировании на суспензии сперматозоидов быка и явилось научной основой для оценки их степени опасности по общему принципу согласно гигиенической классификации вредных веществ. Определены и обоснованы оптимальные условия и критерии оценки опасности моющих и чистящих средств на данной альтернативой биологической модели. В результате проведенных исследований научно обоснованы методические подходы оценки токсичности при скрининговом тестировании моющих и чистящих средств на суспензии сперматозоидов быка.
