Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 12
1.1. Тритикале как модель для изучения взаимодействия генов при отдаленной гибридизации 12
1.1.1. Особенности интрогрессии ценных признаков при отдаленной гибридизации на примере пшеницы 14
1.1.2. История создания культуры тритикале 23
1.1.3. Классификация тритикале 24
1.1.4. Цитогенетическая характеристика тритикале 27
1.1.4.1. Мейотическая нестабильность 28
1.1.5. Генетические особенности тритикале 32
1.2. Характеристика форм тритикале с чужеродным генетическим материалом 39
1.2.1. Замещения хромосом у тритикале 39
1.2.2. Транслокации хромосом у тритикале 49
1.2.3. Дополнения хромосом у тритикале 54
1.2.4. Влияние замещений и транслокаций на количественные признаки 56
1.3. Цитогенетические методы идентификации хромосом 57
1.3.1. Дифференциальное окрашивание и его использование для идентификации хромосом 59
1.3.2. Флуоресцентная in situ гибридизация и ее использование в цитогенетических исследованиях растений 64
1.4. Использование молекулярных маркеров для идентификации хромосом растений 67
1.5. Томат как модельный объект генетических исследований. возможности использования томата для изучения взаимодействия генов 74
1.5.1. Томат как модельный объект в генетических исследованиях 74
1.5.2. Дополненные линии томата с хромосомами S. lycopersicoid.es 75
1.5.3. Формирование листа томата - как модель взаимодействия генов 77
1.5.3.1. Особенности строения растения и способы регуляции его развития 77
1.5.3.2. Строение побега и побеговых апикальных меристем растения 80
1.5.3.3. Морфология листа высших растений 81
1.5.3.4. Этапы развития листа 83
1.5.3.5. Влияние отдельных генов на морфогенез листа томата 85
1.5.3.6. Способы и методы исследования развития листа 86
1.5.5.7. KNOX- гены. Их строение и регуляция 86
1.5.5.8. Влияние мутации clausa на экспрессию гомеобокс- 88 гена LeT6 у томата
1.5.5.9. Различные гены, влияющие на рассеченность листа 92 томата
1.5.5.10. Действие Кл 1 на форму листа томата и 93 взаимодействие его с другими генами, отвечающими за морфогенез
1.5.5.11. Проявление мутации Curl 97
1.5.5.12. Проявление мутации Mouse ears 98
1.5.5.13. Генетическая природа мутаций Mouse ears и Curl 99
1.6. Трансгенные растения с генетической вставкой транспозонов
1.6.1. Общая характеристика транспозонов 103
1.6.1.1. Ретропозоны (LINE-элементы) 107
1.6.1.2. Ретротранспозоны 109
1.6.1.3. Мобильные элементы как диспергированные 110 повторяющиеся последовательности
1.6.2. Контролирующие элементы кукурузы 110
Глава 2. Материалы и методы исследований 117
2.1. Растительный материал 117
2.2. Методы исследований 130
Результаты и обсуждение 140
Глава 3. Взаимодействия генов при интрогрессии генома
3.1. Идентификация чужеродного генетического материала у отдаленных гибридов
3.2. Стабильность мейотического деления как результат проявления взаимодействия генов у отдаленных гибридов
3.2.1. Стабилизация мейоза у пшенично-ржаных амфидиплоидов 145
3.2.2. Стабилизация мейоза у гибридов L. esculentum х L. hirsutum 147
3.2.3. Взаимодействие геномов и формирование цитологической стабильности у тритикале-ржаных гибридов
Глава 4. Взаимодействие генов при интрогрессии отдельных хромосом
4.1. Идентификация чужеродных хромосом в замещенных и дополненных линиях
4.1.1. Идентификация замещений хромосом у линий яровой тритикале
4.1.2. Идентификация дополнений хромосом у культурного томата с хромосомами S. lycopersicoides
4.2. Сравнительный анализ наследования признаков у полнокомплектных форм и с 2Я/20-замещением
4.3. Эффекты транслокации 2RS.2RL-2BL и 2В/2Б-замещения на наследование признаков
4.4. Взаимодействие генов у дополненных форм томата 187
4.4.1. Цитогенетическая характеристика моносомно дополненных 187 растений как проявление взаимодействия генов при интрогрессии хромосомы Solarium lycopersicoides
Глава 5. Наследование признаков у трансгенных организмов. эффекты интрогрессии трансгена (ds-элемента кукурузы) на проявление и наследование признаков у томата
5.1. Взаимодействие трансгена и генома культурного томата в проявлении цитогенетической стабильности
5.2. Эффекты трансгена на наследование признаков у гибридов с участием трансгенных форм томата
Глава 6. Взаимодействия генов при внутривидовой гибридизации 210
6.1. Формирование листа томата - как результат взаимодействия неаллельных генов 210
6.1.1. Эффекты межгенных взаимодействий: взаимодействия между рецессивными мутациями генов, отвечающих за разные типы листа 210
6.1.2. Эффекты межгенных взаимодействий: взаимодействия между доминантными мутациями генов, отвечающих за различные типы листа 218
6.1.3. Эффекты межгенных взаимодействий: взаимодействия между доминантными и рецессивными мутациями генов, отвечающих за различные типы листа 223
Рекомендации для селекционно-генетической практики 225
Выводы 226
Список использованной литературы
- Цитогенетическая характеристика тритикале
- Стабильность мейотического деления как результат проявления взаимодействия генов у отдаленных гибридов
- Идентификация дополнений хромосом у культурного томата с хромосомами S. lycopersicoides
- Взаимодействие трансгена и генома культурного томата в проявлении цитогенетической стабильности
Введение к работе
Исследования взаимодействий генов ведут начало с одних из первых генетических экспериментов Бэтсона, Пеннета и др. Несмотря на это проблема понимания взаимодействия генов в настоящее время не только не решена, но приобрела новые аспекты, связанные с развитием генетики. Эти аспекты ассоциируются с изучением отдаленных гибридов и форм с чужеродным генетическим материалом, которые создаются в ходе отдаленной гибридизации. Развитие методов генетической инженерии требует понимания механизмов взаимодействия трансгена и генетического аппарата растения -реципиента. Несмотря на большое количество работ по отдаленной гибридизации и трансгенезу практически отсутствуют данные об изучении взаимодействий генетических систем в этих ситуациях. Вероятно, одной из основных проблем являются сложности четкой идентификации наличия чужеродного материала в таких формах. Другой проблемой является механизм выявления этих взаимодействий. И третьей важной проблемой является выбор объекта для проведения исследований. В нашей работе рассмотрены все три проблемы. В качестве модельных объектов взяты тритикале и томат - культуры, относящиеся к разным классам, генетически проработанные в разной степени, и обладающие рядом важных преимуществ по сравнению с другими объектами. Это будет подробно рассмотрено в литературном обзоре. При исследовании форм с чужеродным генетическим материалом использованы современные методы в сочетании с классическими - молекулярно-генетический анализ и молекулярная цитогенетика, дифференциальное окрашивание, цитологический анализ митоза и мейоза. Взаимодействия рассматриваются на четырех уровнях организации взаимодействующих генетических систем - на уровне взаимодействия геномов - первичные формы тритикале, тритикале-ржаные гибриды, межвидовые гибриды томата; на уровне интрогрессии хромосом и хромосомных перестроек - формы тритикале с замещением хромосомы, с
5 межгеномной транслокацией, томат с дополненной хромосомой; на уровне гена - трансгенные формы томата с As-элементом кукурузы; а также на уровне внутривидовых скрещиваний - генетический контроль признаков при внутривидовой гибридизации тритикале и взаимодействие генов, отвечающих за разные типы листа. Взаимодействия рассматриваются в виде цитологической стабильности в случае интрогрессий чужеродного генетического материала, функционального статуса растений, а также в виде генетических формул.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Взаимодействие генов - одна из ключевых проблем генетики. Это обусловлено прежде всего тем, что практически каждый признак, не говоря об отдельной ткани, об органе и непосредственно о самом организме - есть результат взаимодействия многих генов. Однако к настоящему времени имеется недостаточно сведений о подобных взаимодействиях. Как правило, взаимодействия генов рассматриваются на отдельных организмах и в достаточно узких направлениях - определение отдельных качественных признаков есть результат взаимодействия неаллельных генов, формирование количественных признаков принимается как результат взаимодействия олиго- или полигенов. Пониженная фертильность и жизнеспособность отдаленных гибридов являются результатом взаимодействия геномов при отдаленной гибридизации. Некоторые эффекты, описываемые как результат взаимодействий, по сути могут быть объяснены эпигенетическими процессами. В то же время на данный момент отсутствует система в подходе к изучению взаимодействий генов, особенно при изучении проявления разных (качественных и количественных) признаков как при внутривидовой, так и отдаленной гибридизации. Все это свидетельствует об актуальности изучения проблемы взаимодействий генов. Особенно это важно при сравнении взаимодействий генов при внутривидовой и отдаленной гибридизации, с учетом разных уровней интрогрессии генетического материала. Развитие современных генно-инженерных технологий и внедрение в практику генетически измененных организмов наряду с вопросами безопасности для человека и окружающей среды требует всестороннего изучения их генетики, особенностей влияния чужеродной ДНК на генетический аппарат модифицированного растения. Требуется тщательный подход к выбору объекта исследований для решения этой актуальной проблемы. В этом плане наиболее подходящими для решения данной проблемы объектами являются томат и тритикале - растения,
7 относящиеся к разным классам, но в то же время обладающие необходимыми свойствами для изучения взаимодействий генов. В случае томата -классического модельного объекта, важными преимуществами являются наличие большого числа маркерных признаков, возможность получения межвидовых гибридов и форм с наличием хромосомных дополнений, а также наличие генетически измененных форм. Тритикале - первая синтезированная человеком сельскохозяйственная культура, является уникальным объектом ввиду эволюционной молодости, генетического становления и возможностей хромосомной инженерии: создания форм с замещениями, транслокациями, дополнениями хромосом. Взаимодействие генов может проявляться в виде разных эффектов. Это не только статистические расщепления, но и эффекты в виде появления новых вариантов признаков, нарушений и стабилизации мейотического деления - одного из основных генетически обусловленных и важных механизмов. Исследование взаимодействий генов имеет важное фундаментальное значение, связанное прежде всего с пониманием генетических механизмов формирования признаков и их проявления в онтогенезе. Кроме того, решение проблем взаимодействия генов имеет важное практическое значение - при установлении природы взаимодействий генов возможно регулирование получения ожидаемых признаков, особенно хозяйственно ценных, путем подбора пар для скрещиваний. Для решения этой проблемы необходима тщательная идентификация исследуемого материала, которая требует использования не только классических, но и современных молекулярно-генетических и цитогенетических методов.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в проведении комплексного анализа эффектов взаимодействий генов при внутривидовой и межвидовой гибридизации и трансгенозе у представителей двух классов растений - тритикале и томата, с использованием форм с разной долей интрогрессий чужеродного генетического материала и проведением
8 тщательной его идентификации. В соответствии с этим были сформулированы следующие задачи:
С использованием генетических коллекций томата и тритикале провести сравнительную оценку наследования признаков при внутривидовой и отдаленной гибридизации.
Выявить особенности проявления и наследования качественных и количественных признаков у тритикале при наличии хромосомных замещений и без них.
Разработать модель взаимодействия генов при формировании и развитии листа томата.
Установить характер проявления цитогенетической стабилизации у первичных тритикале в ряду поколений и ее связь с формированием признаков, определяющих продуктивность.
Исследовать цитогенетические эффекты моносомных дополнений в виде отдельных хромосом S. lycopersicoides и их влияние на наследование морфологических признаков.
Выявить эффекты взаимодействий трансгена с геномом генетически модифицированного растения на примере Ds-элемента кукурузы у культурного томата.
Сопоставить эффекты взаимодействий генов на проявление и наследование качественных и количественных признаков у тритикале и томата с разной долей интрогрессий чужеродного генетического материала.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые проведено комплексное исследование эффектов взаимодействий генов при внутривидовой гибридизации, в присутствии чужеродных интрогрессий в виде трансгена, транслокации, замещения хромосомы, дополнения хромосомы, и наличия целого генома (в случае амфидиплоидов).
Впервые выявлен эффект 211/20-замещения на наследование высоты растений и длины главного колоса у тритикале, проявляющийся в появлении в потомстве большего количества низкорослых форм с более мощным колосом.
Впервые показано, что наличие в геноме тритикале замещения 2B/2D и транслокации 2RS.2RL-2BL обладает эффектами на проявление признаков, сходными с эффектами 2ИУ20-замещения.
Присутствие в геноме замещения или транслокации влияет на наследование признаков, локализованных в данной хромосоме, но может не оказывать влияния на признаки, локализованные в других хромосомах.
Показано, что качественные признаки - проявление опушения колоса и воскового налета на растении у тритикале контролируются взаимодействием генов. Типы взаимодействий генов различны в разных комбинациях скрещиваний.
Получены новые данные, показывающие, что стабилизация первичных тритикале, проявляющаяся в цитогенетической стабильности зависит от генотипа участвовавших в скрещиваниях родительских форм пшеницы и ржи.
Впервые показано, что транслокация 2RS.2RL-2BL и 2В/20-замещение вызывают укорочение вегетационного периода и снижение высоты растения.
Впервые установлено, что для изучения хромосомного состава тритикале удобным объектом являются гибриды F] тритикале х рожь.
Эффекты взаимодействий генетической системы культурного томата и Solarium lycopersicoides проявляются в виде нарушений мейотического деления и наследования признаков. Разные дополненные хромосомы S. lycopersicoides обладают разными эффектами на поведение в мейозе хромосом культурного томата.
Впервые выявлено, что интрогрессия в геном культурного томата методом генной инженерии Ds-элемента кукурузы вызывает нарушения процессов митоза и мейоза. В гемизиготном состоянии трансгена, у гибридов F[ с участием трансгенных форм приводит к достоверному повышению частоты нарушений в мейотическом делении.
Впервые установлены факты плейотропного действия гена Lanceolata, проявляющиеся в пониженной жизнеспособности гомозиготы по этому гену и в аномальном развитии апикальных меристем.
На основании данных генетического анализа показано, что гены, ответственные за разные морфологические типы листа, взаимодействуют между собой и при развитии листа включаются поэтапно. На первом этапе -фактически на стадии закладки меристем, начинает работать ген Lanceolata. После него, но уже непосредственно при закладке листа включаются мутации с, tp, е, Me.
Результаты диссертационной работы используются при чтении курсов по цитологии, методам цитогенетики, генетике, генетическому анализу, генетике онтогенеза с основами эмбриологии растений. Данные настоящей работы вошли в учебные пособия «Цитология и цитогенетика растений», «Практикум по цитологии и цитогенетике растений», «Генетика», «Генетический анализ», «Задачник по генетике», рабочие тетради для лабораторно-практических занятий и самостоятельной работы по цитологии, по генетике, по методам цитогенетики. Полученные данные и обобщения следует учитывать в селекционно-генетической работе при подборе пар и планировании скрещиваний, при постановке исследований с интрогрессионными линиями, с линиями с дополнениями, с замещениями хромосом и при работе с амфидиплоидами.
На защиту выносятся следующие положения:
Стратегия идентификации чужеродного генетического материала с использованием комплекса цитогенетических и молекулярно-генетических методов.
Взаимодействия генов в определении цитогенетической стабильности тритикале.
Эффекты 2Я/20-замещения на длину вегетационного периода, высоту растения, длину колоса.
Эффекты чужеродного генетического материала в виде трансгена, транслокации, замещения или дополнения хромосомы и генома на проявление признаков.
Тритикале-ржаные гибриды как объект для эффективной идентификации ржаных хромосом методом дифференциального окрашивания.
Формирование листа томата как результат взаимодействия генов.
Цитогенетическая характеристика тритикале
Причиной мейотической нестабильности могут быть самые разнообразные факторы. С развитием техники и методик исследований хромосом менялись представления о том, какой из изученных факторов, вызывающих мейотическую нестабильность, является главным, а какой второстепенным. Рассмотрим основные из них.
Продолжительность мейоза у октаплоидных тритикале меньше, чем у обоих родителей, тогда как у гексаплоидного тритикале она занимает промежуточное положение по сравнению с исходными родителями (пшеница и рожь) (Bennett, Smith, 1972, Bennett, Kaltsikes, 1973). Было высказано предположение, что причиной наблюдаемых нарушений в мейозе могут быть различия в продолжительности его у родительских форм и получаемого тритикале (Bennett et al., 1973; Weimark, 1973, 1975). Причиной асинапсиса, возможно, является недостаточная продолжительность стадий мейоза, на которых происходит формирование хиазм у ржаных хромосом (Preritz,1970). Однако, Lelley (1974) обнаружил широкую изменчивость по частоте хиазм между линиями, и предположил, что недостаточное физическое сцепление между гомологичными хромосомами является причиной десинапсиса. Кроме этого, было показано, что на образование хиазм сильное влияние оказывают генотипы исходных форм (Thomas, Kaltsikes, 1974, Lelley, 1974).
Однако причина, скорее всего, кроется не в целом геноме, а отдельных хромосомах или генах. При изучении продолжительности мейоза у тритикале разного уровня плоидности и разного геномного состава показано, что данный фактор не является главным (Roupakias, Kaltsikes, 1977). Причина более вероятна в генетических факторах, нежели простом изменении плоидности. М. Bennett (1976) показал, что при увеличении содержания ДНК и уровня плоидности главное влияние на мейотическую стабильность имеют факторы генотипа и окружающей среды. При этом не было обнаружено существенных связей между продолжительностью мейоза и частотой унивалентов и в опыте Roupakias и Kaltsikes (1977).
При изучении мейоза было показано, что отдельные хромосомы, например, пшеничная 1В, имеют тенденцию вызывать больше нарушений, чем другие (Shigenaga et al., 1971). Эта хромосома участвует в 34% всех моносомиков у сорта Rosner. В то же время остальные достаточно случайно присутствуют в мейотических нарушениях, за исключением одной из спутничных хромосом пшеницы - 6В и самой большой спутничной хромосомы ржи - 2R. Обе эти хромосомы обеспечивают сравнительно высокую частоту моносомиков: соответственно 12 и 9% (Darvey, barter, 1973, Merker, 1973). Gustafson (1976) высказал предположение, что, возможно, существует естественный отбор против гамет, содержащих спутничные хромосомы и крупные хромосомы, против 1В и/или 6В и реактивации ржаных ядрышкоорганизующих областей. Эту гипотезу подтверждает тот факт, что несколько высокоурожайных сортов пшеницы имеют либо lB/lR-замещение или 1 В/lR-транслокацию (Zeller, 1973, Mettin et al, 1973, Bennett, Smith, 1975).
Так, Шкутина и Хвостова (1971) отметили, что наименьшее число мейотических нарушений имели линии, у которых формировалось только одно ядрышко, а тетраплоидные тритикале, имеющие 1В и/или 6В хромосомы, имели очень высокий уровень мейотических нарушений.
Долгое время одной из основных гипотез главных причин мейотической нестабильности была гипотеза, связанная с отрицательным влиянием ржаных хромосом. Как замечено у гексаплоидного (Thomas and Kaltsikes, 1974, Lelley, 1975, Schlegel, 1978) и у октаплоидного (Weimark, 1975, Schlegel, 1978) тритикале, а также у пшенично-ржаных дополненных линий (Schlegel, 1978), в метафазе-1 мейотического деления хромосомы ржи образуют меньше закрытых бивалентов, чем пшеничные. Формирование унивалентов с большей частотой происходило из ржаных хромосом, имеющих теломерный гетерохроматин. Lima-de-Faria и Jaworska (1972) показали, что репликация ДНК в теломерном гетерохроматине стартует и заканчивается позже, чем в остальной хромосоме. При анализе изогенных линий тритикале, различающихся по размерам теломерных гетерохроматиновых блоков в разных ржаных хромосомах, а также пшенично-ржаных дополненных форм, было установлено, что они играют существенную роль в формировании нарушений у тритикале (Bennett and Kaltsikes, 1973, Thomas and Kaltsikes, 1974, Thomas and Kaltsikes, 1976, Merker, 1976, Roupakias and Kaltsikes, 1977, Jones, 1978, Naranjo and Lacadena, 1980; Drille et al., 1984).
Наряду с выше перечисленными были описаны и некоторые другие факторы, которые играют роль в проявлении мейотических нарушений у тритикале.
1. Генетически контролируемая нестабильность. Система 5В хромосомы пшеницы, которая вызывает гомеологичную конъюгацию хромосом (Riley and Miller, 1970, Thomas and Kaltsikes, 1971; Jouve, Giorgi, 1986).
2. Цитоплазма и/или ядерно-цитоплазматические взаимодействия. При сравнении форм тритикале, полученных на разных цитоплазмах (пшеницы и ржи), как правило, более стабильный мейоз наблюдается у линий с цитоплазмой пшеницы (Thomas and Kaltsikes, 1972, barter and Hsam, 1974). При этом некоторые авторы не обнаружили существенного эффекта цитоплазмы (Merker, 1973, Roupakias and Kaltsikes, 1977).
3. Геномная аллоциклия - геномы пшеницы и ржи ведут себя автономно в едином геноме (Stutz, 1962).
4. Разные системы размножения родительских видов -пшеница является самоопылителем, а рожь - перекрестником - могут стать весомой причиной мейотической нестабильности. Однако, использование самофертильных форм ржи обычно не приводило к существенному повышению мейотической стабильности (Lelley, 1975).
Несколько сообщений свидетельствовали о влиянии окружающей среды на частоту хиазм у пшеницы и тритикале. Поэтому очевидно, что мейотическая нестабильность является результатом комбинирования целого ряда факторов (Gustafson, 1983, Oettler, 1998)
Многочисленными работами показано, что улучшение мейотической стабильности приводит к повышению фертильности и соответственно урожая (Merker, 1971, 1973; Hsam and barter, 1973; Weimark, 1973; Muentzing, 1978; Федорова, 1987a, 19876).
Стабильность мейотического деления как результат проявления взаимодействия генов у отдаленных гибридов
При работе с отдаленными гибридами важное значение приобретает выявление генетического материала участвовавших родительских форм и установление гибридности. В зависимости от родства геномов, участвовавших в скрещиваниях видов, качестве основных методов идентификации гибридов используются геномная гибридизация in situ, дифференциальное окрашивание хромосом, молекулярно-генетическое маркирование, использование морфологических маркеров, подсчет числа хромосом в случае видов с разным числом хромосом, характеристика конъюгации хромосом в профазе I -метафазе I, фертильность пыльцы.
Для идентификации амфидиплоидов тритикале, как аллополиплоидов, полученных гибридизацией с последующим колхицинированием, использовали все перечисленные методы. При работе с ранними поколениями гибридов использовали классические методы цитологического анализа числа хромосом и конъюгации в мейозе. В качестве примера гибридизации in situ на рис. 3.1 представлены результаты геномной гибридизации in situ, выполненной на метафазных хромосомах линии гексаплоидной тритикале. Однако применение этого метода ограничивается как стоимостью анализа, так и необходимостью достаточно большого количества семян изучаемого образца, что не всегда возможно при работе с амфидиплоидами ранних поколений. В этом случае исследование мейотического деления, проявление морфологических признаков - основные методы изучения подобных растений.
В случае гибридов F тритикале рожь цитологические методы, основанные на подсчете числа хромосом и выявлении конъюгации которые позволяют идентифицировать хромосомы геномов ржи и пшеницы. В то же время использование геномной гибридизации in situ позволяет четко их определить (рис. 3.2.).
Однако возможности геномной гибридизации in situ значительно ограничиваются при использовании гибридов между видами с родственными геномами, как в случае гибридов Fj L. esculentum L. hirsutum. В этом случае и характер конъюгации хромосом в метафазе I может быть сходным с гибридами между образцами одного вида. Поэтому при планировании таких скрещиваний могут быть использованы маркерные формы культурного томата, обладающие рецессивными признаками, такими как, например, отсутствие антоциана, отсутствие воскового налета, карликовый рост, желтая точка роста и др., которые проявляются на ранних стадиях развития. По проявлению их можно установить гибридность на ранних стадиях. В нашем случае для получения гибрида использована маркерная форма Мо 504, характеризующейся карликовым ростом, отсутствием антоциана, сложной «кистью», удлиненным красным плодом. Как видно на рис. 3.3 гибриды F; имели признаки дикого вида, что свидетельствует о их гибридности. Морфологические маркеры, несмотря на ограниченность их использования, не потеряли актуальности, что и продемонстрировано в данном исследовании. Стоимость применения и простота их идентификации обеспечивают их использование при создании межвидовых гибридов.
Стабильность мейотического деления является определяющим фактором в формировании плодовитости отдаленных гибридов. На основе конъюгации хромосом основан метод геномного анализа (Карпеченко, 1937). Конъюгация хромосом - важный критерий для определения родства геномов, выявления возможностей интрогрессии генетического материала одного вида в другой (Ячевская, Наумов, 1990). Одним из существенных факторов интрогрессии чужеродного генетического материала в геном пшеницы является использованием форм пшеницы с геном ph, вызывающим конъюгацию гомеологичных хромосом разных видов (Симоненко, Сечняк, 1985; Цаценко, 1994; Власова, 2000; Семенова, Семенов, 2003; Lukaszcwski ct al., 2004; Лапочкина, 2005). С использованием этого мутанта на пшенице удалось получить интрогрессии признаков из разных видов эгилопса, пырея, разные рекомбинантные хромосомы между 2R и 2D хромосомами и др.
Пшенично ржаные гибриды являются стерильными. Это связано с практически полным отсутствием конъюгации хромосом пшеницы и ржи. Отмечено лишь несколько фактов завязывания семян у таких растений. У первичных тритикале первоначально также наблюдается высокая стерильность. В процессе отбора удается создать формы тритикале с регулярным мейозом и высокой фертильностью пыльцы. Стабилизация мейоза первичных форм тритикале зависит от генотипа использованных форм пшеницы и ржи. Примером служат данные, полученные нами при оценке мейотического индекса в двух гибридных комбинациях. У первичных форм тритикале, полученных от скрещивания мягкой пшеницы сорта Воронежская с яровой рожью Селенга, меиотическии индекс составил 76,9% уже в Сг-поколении (табл. 3.1). В другой комбинации скрещивания мягкой пшеницы сорта Саратовская 55 с яровой рожью Селенга в Cs-поколении этот показатель составил лишь 51,3%. Таким образом, удвоение числа хромосом является необходимым, но не единственным условием получения высоко фертильных первичных тритикале. Важным является генотип скрещиваемых форм, т.е. взаимодействие геномов скрещиваемых форм.
Идентификация дополнений хромосом у культурного томата с хромосомами S. lycopersicoides
Гибридизация тритикале с рожью - одно из направлений увеличения генетического разнообразия тритикале путем создания новых форм гексаплоидной и тетраплоидной тритикале. Тетраплоидная тритикале в настоящее время не имеет практического применения, что вероятно обусловлено и недостаточным ее генетическим разнообразием. В генетических коллекциях тетраплоидные образцы встречаются наиболее редко (Дубовец, 1988, 2000). Использование ржи для увеличения генетического разнообразия гексаплоидной тритикале является актуальным при работе с яровыми формами. Яровая рожь отличается коротким периодом вегетации, что особенно актуально для яровой тритикале. В наших исследованиях изучена коллекция яровой ржи различного происхождения, включающая более 30 образцов. С лучшими из них была осуществлена гибридизация. В целом, в скрещиваниях гексаплоидной тритикале с диплоидной рожью завязываемость гибридных семян обычно низкая и варьирует от 3,5 до 27,5 % (Бормотов и др., 1990). В нашем исследовании обнаружена высокая завязываемость гибридных семян при скрещивании линии 131/7 яровой тритикале с сортом яровой ржи Селенга, которая составила более 50%. Это явление повторилось в течение нескольких сезонов, что возможно обусловлено участием при создании этой линии тритикале сорта яровой ржи Селенга в качестве опылителя. Следует отметить и высокую жизнеспособность семян - около 70%. Несмотря на высокую завязываемость гибридных семян, у растений гибридов F] наблюдается высокий процент нарушений мейотического деления. Мейотический индекс у тритикале-ржаных гибридов составил от 1,5 до 4,6% в зависимости от комбинации скрещивания.
Цитологический анализ метафазных пластинок у тритикале-ржаных гибридов подтвердил гибридность семян, у которых имелось 28 хромосом. Анализ дифференциально окрашенных хромосом показал наличие в геноме гибридов 14 хромосом генома ржи R и 14 хромосом геномов пшеницы А, В, D. При проведении геномной гибридизации GISH была выявлена транслокация пшеничной хромосомы в геноме ржи (рис.3.2). Для идентификации транслокации на гибридах были проведен ПЦР-анализ на специфичные для хромосом D-генома маркеры. С использованием микросателлитного маркера Xgwm 349, специфичного для 2D хромосомы, показано присутствие этой хромосомы в геноме линии 131/7 (Рис. 3). Анализ результатов ПЦР показал, что данный фрагмент присутствует в формах, где имеется D-геном - это в мягкой пшеницы сорт Иволга, октаплоидной тритикале ПРАО-1, а также линии к-1185 гексаплоидной тритикале, несущей 2R/2D замещение (Соловьев, 2000). Маркеров, специфичных для других хромосом генома D, у исследуемой линии не выявлено.
В то же время в формах, которые не имеют D-генома - твердой пшенице, ржи, а также в линии тритикале СУ-35 без замещений, эта полоса отсутствует. Присутствие этой полосы у линии тритикале 131/7 и гибридов Fі тритикале линия 131/7 х рожь сорт Селенга свидетельствует о наличии хромосомы 2D, что было подтверждено дифференциальным окрашиванием. Идентификация транслокация была осуществлена непосредственно на линии 131/7.
Тритикале-ржаные гибриды характеризовались нормальным развитием, они имели мощный колос, прочный стебель, однако завязываемость зерен была очень низкая. На протяжении всех лет изучения были получены только несколько семян от самоопыления. При этом фертильность пыльцы у этих гибридов была достаточно высокой - более 30%. Этот показатель значительно выше, чем известно из данных других авторов - от 0,6 до 1,9%. (Бормотов и др., 1990). Опыление таких гибридов пыльцой тритикале и пшеницы не привело к серьезному увеличению завязываемости семян.
Исследование мейотического деления у гибридов F] тритикале линия 131/7 х рожь сорт Селенга показало наличие в метафазе I открытых и закрытых бивалентов, унивалентов. На некоторых пластинках были видны унивалентов, 6 закрытых бивалентов и 1 открытый бивалент (рис. 3.7). Это может быть объяснено конъюгацией гомологичных хромосом ржи, образующих закрытые биваленты, при этом одна пара хромосом ржи конъюгирует не полностью из-за транслокации в ржаной хромосоме линии 131/7, в результате формируется открытый бивалент. На других стадиях были отмечены следующие нарушения: в анафазе I и анафазе II - отставания хромосом и образование мостов; в метафазе II - отдельно лежащие хромосомы; к на стадии тетрад - микроядра. Мейотический индекс составил лишь 4,6% , при этом количество микроядер варьировала от одного до пяти. Все это свидетельствует о генетическом дисбалансе, который приводит к низкой завязываемости семян.
По морфологическим признакам тритикале-ржаные гибриды больше сходны с рожью. Это свидетельствует, что увеличение доли генетического материала ржи приводит к усилению проявления признаков ржи. В виду меньшего числа хромосом такие гибриды оказались удачными для определения хромосомной конституции тритикале, вовлеченных в скрещивание.
Взаимодействие трансгена и генома культурного томата в проявлении цитогенетической стабильности
В настоящей работе впервые показано, что чужеродная вставка может оказывать влияние на митотическое деление у морфологически стабильных трансгенных растений. Это проявляется в повышенной частоте образования мостов, отставаний хромосом в анафазе митоза (рис. 5.1). Показано достоверное превышение частоты нарушений в митозе у трансгенных растений и гибридов с их участием (табл. 5.1). Это свидетельствует, что трансгенные растения при стабильности морфологических признаков могут сохранять цитогенетическую нестабильность. Относительно возможности проявления нарушений в митотическом делении в присутствии Ds-элемента показано на примере кукурузы (Сингер, Берг, 1993). В то же время модель Ds-элемента кукурузы широко использована для разных генно-инженерных экспериментов на различных культурах, что привело к поиску ценных генов, включая гены
196 участием трансгенных форм, сорта Moneymaker с маркерной формой LA0784. Морфологически изучаемые трансгенные линии не имели отличий от исходного сорта. В то же время доля клеток с нарушениями в трансгенных растениях была достоверно выше, чем в исходном сорте. Подобная картина наблюдается и в отношении гибридов Fj. У гибридов в целом наблюдается повышение частоты нарушений, при этом у гибридов с участием трансгенной формы доля клеток с нарушениями превысила показатель у гибрида с исходным сортом Moneymaker более чем в два раза. Возможно, это связано со спецификой самого Ду-элемента кукурузы, как было отмечено выше. В то же время этот факт может быть проявлением непосредственно самой вставки. По крайней мере, уровень нарушений у гибридов первого поколения с участием трансгенных растений может быть обусловлен гемизиготным состоянием Ds элемента.
Для проверки этого предположения была проведено изучение цитогенетической стабильности мейотического деления трансгенных растений и гибридов с их участием использовали показатели конъюгации хромосом в метафазе I, а также частоту нарушений в анафазе I.
На стадии метафазы I оценивали конъюгацию хромосом - подсчитывали і клетки с нормальной конъюгацией, с открытыми бивалентами, с унивалентами и тривалентами (табл. 5.2). Исследования конъюгации хромосом в мейозе основываются на гипотезе Дарлингтона, заключающейся в том, что конъюгировать могут строго гомологичные хромосомы. Однако под влиянием генотипа и внешних условий у константных форм могут возникать определенные отклонения от нормальной бивалентной конъюгации. Они заключаются в образовании унивалентов, мультивалентов. Также в метафазе І у і таких форм может наблюдаться неправильная ориентация бивалентов и изредка между бивалентами возникает интерлокинг. Интерлокинг - это такая связь бивалентов, при которой хромосома одного бивалента проходит между обоими партнерами другого бивалента.
Как видно из результатов анализа, в метафазе I мейоза не все биваленты могут быть закрытого типа (то есть кольцеобразные, имеющие минимум две хиазмы). В разных клетках может наблюдаться неодинаковое количество открытых бивалентов, однако в нашем случае количество открытых бивалентов было не более одного на проанализированную клетку любой формы. Наличие открытых бивалентов не нарушает общего течения мейоза, но указывает на ослабление конъюгации.
Для сравнения образцов рассчитывали доли клеток с нарушениями и нормальные клетки. Как видно из таблицы 5.3 все случаи, кроме нормы, имеют долю менее 0,2 (и соответственно более 0,8), следовательно, необходимо использовать функцию преобразования. В данном случае мы используем так называемое арксинус преобразование частот (ф-преобразование) по формуле: Ф = 2 arcsinVp, где р = (n + 3/8)/(N +3/4). Полученные доли и результаты преобразования представлены в таблице 5.3. Из таблицы 5.3 видно, что сорт Moneymaker и маркерная форма LA0784 имеют более высокую долю клеток со всеми закрытыми бивалентами в сравнении с трансгенной формой tds 10 - 0,967, 0,96 и 0,933 соответственно. Кроме того, у гибрида с участием трансгенной формы доля таких клеток также снижена по сравнению с гибридом F] Moneymaker х LA0784. Следует отметить, что у трансгенной формы и гибрида с ее участием выявлена максимальная доля клеток с унивалентами 0,022 и 0,014 соответственно. Для сравнения у сорта Moneymaker, линии LA0784 и гибрида Fi Moneymaker х LA0784 она составила 0,006, 0,008, 0,007 соответственно. Для оценки достоверности различий используем критерий Фишера с предварительным преобразованием долей в радианы.
