Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Особенности биологии и среды обитания русского осетра 8
1.1.1 Морфологические и анатомические признаки вида 8
1.1.2 Характеристика ареала обитания популяций 11
1.1.3 Происхождение вида 15
1.2 Внутривидовая изменчивость и её анализ 16
1.2.1 Морфометрические маркеры 17
1.2.2 Биохимические маркеры 20
1.2.3 Молекулярно-генетические маркеры 22
1.2.3.1 Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD) 25
1.2.3.2 Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP) 29
1.2.3.3 Анализ микросателлитной ДНК (STR) 29
1.2.3.4 Анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) 34
1.2.3.5 Анализ полиморфизма митохондриальной ДНК 36
1.3 Принципы формирования ДНК-коллекций 41
1.4 Особенности генетического анализа осетровых рыб 45
2. Материалы и методы
2.1 Объект исследования 54
2.2 Отбор проб 55
2.3 Морфометрические измерения 56
2.4 Определение возраста рыб 57
2.5 Постановка экспериментальных скрещиваний 57
2.6 Молекулярно-генетические методы 58
2.6.1 Экстракция тотальной ДНК 58
2.6.2 RAPD-анализ 60
2.6.3 Микросателлитный анализ (STR) ядерной ДНК 64
2.6.4 Определение «baerii-like» (BL) и «gueldenstaedtii» (GUE) 65
митотипов
2.7 Статистический анализ данных 67
3. Результаты исследований
3.1 Исследование внутри- и межпопуляционного морфологического полиморфизма русского осетра. 69
3.2 Генетический полиморфизм русского осетра по ДНК-маркерам 79
3.2.1 Внутри- и межпопуляционная изменчивость русского осетра по RAPD-маркерам 79
3.2.2 Наследование микросателлитных маркеров в F1 84
3.2.3 Внутри- и межпопуляционная изменчивость вида по STR-маркерам 92
3.2.4 Определение «baerii-like» (BL) и «gueldenstaedtii» (GUE) митотипов в природных популяциях русского осетра 102
3.3 Индивидуальная идентификация популяционной принадлежности105
Заключение 109
Выводы 112
Литература
- Морфологические и анатомические признаки вида
- Биохимические маркеры
- Постановка экспериментальных скрещиваний
- Генетический полиморфизм русского осетра по ДНК-маркерам
Введение к работе
Русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833) относится к реликтовой группе хрящевых ганоидов, первые находки которых датируются верхнеюрским периодом (более 200 млн. лет). До недавнего времени вид был многочисленным в фауне внутренних водоемов Евразии (бассейнов Каспийского и Черного морей) и имел большое промысловое значение. На сегодняшний день русский осетр, как и другие 24 представителя отряда Acipenseriformes, отнесен к группе редких видов и включен в Приложение II CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) (Raymakers, 2006). Катастрофическое снижение численности русского осетра в основном обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений, препятствующих проходу половозрелых особей к местам нереста, расположенным в верховьях рек. Кроме того, высокий спрос и цена на черную икру и товарную осетрину привели к чрезмерному вылову (Vaisman, Raymakers, 2001).
Восполнение численности русского осетра в значительной мере осуществляется за счет искусственного воспроизводства на рыбоводных заводах. Так, например, в азовской популяции доля искусственно воспроизведенных рыб достигает 95% (Реков, 2000).
В связи с этим мероприятия по поддержанию численности вида должны учитывать сохранение его устойчивости, в значительной мере обусловливаемой его генетической гетерогенностью, и, соответственно, требуют знаний об эволюционно сформировавшейся популяционной структуре вида. Тем не менее, внутривидовая систематика русского осетра остается до сих пор предметом дискуссий. Являясь анадромным видом, русский осетр для размножения входит в определенные реки, а основную часть своей жизни проводит в малосоленых водах бассейнов трёх морей (Каспийского, Азовского, Чёрного), которые различаются по пространственным, температурным и продуктивным возможностям. Основываясь на поведенческих, экологических и меристических признаках, одни авторы подразделяют А. gueldenstaedtii на 3-4 географически изолированные формы с несколькими нерестовыми популяциями в каждой (Берг, 1948; Чугунов и др., 1964; Подушка, 2003), другие выделяют только популяции (Соколов, 2002; Vecsei et al., 2004).
В современной систематике наряду с морфологическим анализом широко используются методы оценки генетического полиморфизма с помощью молекулярных маркеров. Ранее проведенные исследования русского осетра выявили высокий уровень полиморфизма белков крови (Субботкин, 1987) и митохондриальной ДНК (Birstein, 2000; Корниенко и др. 2003; Doukakis et al., 2005; Rastorguev et al., 2008). Высокая шюидность генома (Birstein et al., 1997; Fontana et al., 2001), затрудняет анализ полиморфизма по ядерным маркерам. В литературе имеются данные по оценке полиморфизма некоторых видов осетровых рыб с помощью AFLP и микросателлитного (STR) анализа (Jenneckens et al., 2001; King et al., 2001; Congiu et al., 2002; Zane et al., 2002; Welsh et al., 2003). Популяционная структура и полиморфизм русского осетра по этим параметрам изучены в меньшей степени.
В связи с высокой экологической пластичностью, изменчивостью морфологических и биохимических признаков, сложной внутрипопуляционной организацией вида, ставшего редким, изучение популяционной структуры русского осетра имеет большое практическое и научное значение.
Целью настоящей работы является исследование внутри- и межпопуляционного генетического полиморфизма русского осетра с помощью морфологического, а также молекулярно-генетического анализов с использованием методов RAPD, STR и ПЦР-идентификации митохондриальных гаплотипов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
1. Исследовать уровень морфологической изменчивости азовской популяции
русского осетра и сравнить с ранее опубликованными данными по изменчивости
популяций Каспийского моря и северо-западной части Черного моря.
2. Изучить с помощью RAPD- и STR-маркеров внутри- и
межпопуляционную генетическую изменчивость вида.
Определить тип наследования ряда известных микросателлитных (STR) маркеров в экспериментальных скрещиваниях русского осетра.
Оценить эффективность использования микросателлитных маркеров для определения популяционной принадлежности особей русского осетра.
5. С целью определения частоты встречаемости "baerii-like" митотипа провести широкомасштабный скрининг трех (каспийской, азовской и черноморской) популяций русского осетра.
В ходе выполнения работы впервые с помощью морфологических и молекулярно-генетических маркеров был проведен сравнительный анализ изменчивости трех популяций русского осетра (азовской, каспийской и западно-черноморской). Исследована частота встречаемости митохондриального маркера («baerii-like» гаплотип) в азовской и черноморской популяциях. Для этих популяций определена также временная динамика частот встречаемости изученных митохондриальных гаплотипов. Предложена экспериментально обоснованная методика популяционной идентификации особей русского осетра с использованием базы аллельных частот STR-локусов. Получены молекулярно-генетические доказательства микроэволюционных процессов дивергенции черноморской и каспийской популяции с последующим отделением азовской популяции.
Полученные результаты имеют важное значение для изучения эволюционной систематики и филогении рода Acipenser и вида Acipenser gueldenstaedtii. Предложен набор генетических маркеров, который используется для индивидуальной паспортизации половозрелых особей русского осетра на осетровых рыбоводных заводах Каспийского бассейна. Выявленная временная динамика частот «сибиреподобного» («baerii-like») гаплотипа мтДНК и популяционных частот STR-аллелей может быть использована для более корректной оценки промыслового возврата особей русского осетра при искусственном воспроизводстве осетровых в Азовском бассейне.
В ходе выполнения экспериментальной части работы для постановки индивидуальных скрещиваний был создан лабораторный стенд для инкубации икры рыб, который зарегистрирован 27.05.2007 в Госреестре полезных моделей РФ (патент № 63172). Был предложен способ иммобилизации образцов очищенной ДНК, предусматривающий ее выделение, очистку и заключение в защитную оболочку для длительного хранения, что позволяет оптимизировать работу с тканевыми ДНК-содержащими пробами (дата приоритета 14.11.2007).
7 Материалы диссертации включены в состав учебных материалов для занятий студентов биолого-почвенного факультета ЮФУ по курсам «Генетика» и «Теория эволюции», а также специальным курсам кафедры генетики.
Морфологические и анатомические признаки вида
Среду обитания (биотоп) русский осетр меняет несколько раз в течение жизни. Ранний период развития проходит в речной воде, ювенильные особи по течению мигрируют в море, где растут до половозрелого состояния, после чего вновь возвращаются в реку для нереста. Это стратегия проходной формы, реже описывали в pp. Волге, Каме, Урале жилую форму (постоянно живущую в реке). Проходную форму разделяют на две расы (Берг, 1934): озимую (нерестовый ход осенью или в конце лета, зимовка в реке и здесь же весной нерест) и яровую (нерестовый ход и нерест весной того же года). Озимая раса более выражена у рыб, нерестящихся в протяженных полноводных реках (Волга, Дунай, Урал), что позволяет виду наиболее полно использовать нерестилища в среднем и верхнем течении (Артюхин, 2008).
Осетр совершает сезонные (кормовые) миграции, перемещаясь из одних участков моря в другие; анадромные (нерестовые и пост нерестовые). До гидростроительства нерестилища русского осетра располагались в крупнейших реках Европы: Дунай, Волга, Днепр, Дон, Кубань, Урал, Днестр, а также в более мелких реках Иранского и Кавказского побережий Каспийского моря, Колхидского и Анатолийского побережий Чёрного моря.
Главный фактор сезонных и анадромных перемещений осетра - изменение температуры морской воды. Заход производителей для нереста в Волгу начинается при температуре воды 2 — 4 С, а пик нерестовой миграции наблюдается при максимальных температурах воды в реке (22 — 27 С) (Журавлева, 2000). Оптимальная температура нереста азовской популяции русского осетра в р.Дон составляет 16 С (Аведикова, 1961, цит. по Подушка, 2003). При охлаждении осенью вод Северного Каспия осетр мигрирует в южную часть моря. В Азовском море ювенильные особи нагуливаются в основном в Таганрогском заливе и у кубанского побережья. В летний период взрослые рыбы распределены по всей акватории моря, а на зимовку сосредотачиваются в юго-западной части моря (район Арабатского и Казантипского заливов). Русский осетр, нерестящийся в реках Днепр и Дунай, нагуливается на отмелях в приустьевых районах Чёрного моря, также известны его кормовые миграции в Каркинитский залив полуострова Крым.
Осетр - преимущественно донный обитатель. Ювенильные особи в основном питаются зоопланктоном, взрослые - бентофаги, поедающие моллюсков и червей, что определяет их предпочтение песчаных или илистых грунтов, однако они избегает чистого ила (Легеза, 1972). Взрослые особи мигрируют летом в наиболее мелководные и кормные участки моря, а осенью продвигаются на глубины до 100 м (в Каспийском и Чёрном море). Зимой рыбы не питаются. Вследствие особенностей питания происходят ежегодные колебания интенсивности роста рыб, что приводит к неравномерному приросту хрящевых тканей и образованию характерных колец, ясно видимых на спиле первого луча грудного плавника. При половом созревании вследствие замедления роста годовые кольца образуют так называемую «нерестовую метку». Годовые кольца и «нерестовые метки» используются для определения возраста и времени нереста осетровых рыб (Бойко, 2005).
Экологические условия обитания русского осетра в Азово-Черноморском и Каспийском бассейне имеют ряд отличительных особенностей, к которым этот пластичный вид сумел прекрасно адаптироваться.
Каспий - озеро, расположенное в Арало-Каспийской низменности. Азовское и Черное моря, глубоко врезаясь в сушу, имеют связь с Мировым океаном через Средиземное море посредством проливов Босфор и Дарданеллы. Однако водообмен с океаном через эти проливы затруднен. Поэтому, также как и в Каспийском море, динамика солевого состава и уровня воды в Азово-Черноморском бассейне зависят от межгодовой изменчивости речного стока, а основным фактором изменения температуры воды является солнечная радиация (Добровольский, Залогин, 1982).
Соленость трех морей значительно ниже океанической (35 %о) и составляет: 17 %о в поверхностном слое Черного моря, 12-13 %о - в открытых районах Каспийского моря. Самое опресненное небольшое и неглубокое Азовское море имеет 12 %о в районе Керченского пролива, через который поступает более соленая черноморская вода, и 4-8 %о в Таганрогском заливе. Основной вклад в опреснение внутри евразийских морей вносят впадающие в них реки, несмотря на испарение с поверхности водоёмов.
Изолированность от океана объясняет и независимость колебания уровня морей. Приливно-отливные колебания уровня Черного моря не превышают 10 см из-за недостаточных размеров самого моря и затухания средиземноморских приливных волн в узких проливах. Наиболее заметные быстрые изменения уровня в Азово-Черноморском бассейне, как и в Каспии, связаны с действием ветров. В целом, долгосрочная динамика уровня этих морей трудно прогнозируемая и связана с межгодовым изменением стока рек.
Особенностью более глубокого Черного моря (максимальная глубина 2212 м) является образование двух четко выраженных слоев воды (стратификация), которые слабо смешиваются друг с другом. Поверхностный слой - примерно до 100 м — преимущественно речного происхождения, глубинный формируется нижнебосфорским течением из Мраморного моря. Свойства черноморской воды с глубиной резко меняются при переходе пограничного пикноклина: соленость с 17 до 20-30 %о, температура со средне сезонной до 8-9С. Ниже 200 м в Черном море нет кислорода, вода насыщена сероводородом — продуктом анаэробного разложения, т.е. условия для жизни имеются только в 100-200 метровом верхнем слое.
Стратификация водной массы характерна и для Каспийского моря, но она кратковременна, приурочена к летним месяцам, когда формируется термоклин вблизи от поверхности моря. В целом вся толща каспийских вод (средняя глубина 208 м) находится в подвижном состоянии, и вертикальные градиенты солености и температуры невелики и изменяются плавно вглубь.
Биохимические маркеры
Молекулярно-генетический анализ стал сегодня почти обязательным в филогенетических, таксономических и популяционных исследованиях. В зависимости от используемых ДНК-маркеров и поставленных целей проведение исследований возможно на различных уровнях: от индивида и популяции до отрядов и надотрядных категорий. По сравнению с доминирующими ранее методами анализа белкового полиморфизма ДНК-анализ обеспечивает получение гораздо более полной картины генетической изменчивости. Во многих случаях вариабельные генетические маркеры позволяют обнаружить межвидовые или межпопуляционные генетические различия, не распознаваемые методами электрофореза белков (Mamuris et al., 1999; Smith and McVeagh, 2000).
Использование анализа структуры ДНК для популяционных исследований началось с прямого определения нуклеотидной последовательности в конце 1970-х начале 1980-х. Первоначально, эта работа сосредоточилась на молекуле митохондриальной ДНК (мтДНК). Позже был разработан рестрикционный анализ полиморфизма длин фрагментов (RFLP - Restriction fragment length polymorphism), основанный на специфичном разрезании молекулы ДНК специальными ферментами эндонуклеазами (Lansman et al., 1981). Описано несколько сотен рестриктаз, различающихся по нуклеотидным сайтам, которые они опознают и разрезают. Процедура рестрикции нашла широкое применение в методологии определения первичной последовательности ДНК, в изучении экспрессии генов после их клонирования, для формирования различных рекомбинантных молекул, а также для выявления генетического полиморфизма. Полиморфизм ДНК, выявляемый этим методом, обусловлен точечными мутациями в сайтах рестрикции, инверсиями, дупликациями, делециями различной протяженности и т.п. между сайтами рестрикции. Изменения в первичной структуре ДНК ведут к изменению длины фрагментов, которые фиксируют в RFLP-анализе при разделении смеси фрагментов в агарозном или полиакриламидном геле и визуализируют авторадиографией или окрашиванием бромистым этидием. Этот метод оказался малоэффективен для разделения множества фрагментов различной длины.
Основным инструментом ДНК-анализа последние двадцать лет является полимеразная цепная реакция (ПЦР или PCR - Polymerase Chain Reaction), разработанная Кэри Мюллисом в 1983 г. (Mullis, 1990). Суть метода заключается в цикличном синтезе in vitro нуклеотидной последовательности участка ДНК, границы которого определяют ДНК-затравки - синтетические олигонуклеотиды (праймеры), комплементарные последовательностям на границах амплифицируемого фрагмента. Реакцию катализирует выделенная из термофильных бактерий Thermis aquations термостабильная 7од-полимераза (Lawyer et al., 1993), оптимум работы которой находится в области 70-72С. Процесс ПЦР автоматизирован, и многократное повторение циклов синтеза приводит к экспоненциальному увеличению числа копий специфического фрагмента ДНК (рис. 1.5). Чувствительность метода теоретически гарантирует обнаружение даже единичных молекул матрицы, так как за 30-40 циклов ПЦР о накапливается около 10 молекул ампликона.
На базе ПЦР было разработано множество методов ДНК-типирования. Например, метод амплификации полиморфной ДНК с помощью случайных праймеров (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990), который также как и RFLP-анализ (Pogson et al., 1995), применялся для решения задач рыбной отрасли. Используя различные инструменты, эти методы в результаты дают набор полос (фингерпринтинты) мультилокусной ДНК, позволяя исследовать геном в целом. При обработке множества гелей, полученных с помощью данных методик, возникают трудности в интерпретации и сравнении, что подтолкнуло к развитию однолокусных маркеров. Одними из первых эти маркеры применили для исследования рыб в Лаборатории морских разработок канадского университета Dalhousie (Taggart and Ferguson, 1990). Позже внимание исследователей сосредоточилось на одном классе локусов - микросателлитах, которые становятся распространенным инструментом изучения популяционно-генетических характеристик диких видов в природе и домашних пород в селекции.
Сегодня в популяционных исследованиях используется обширный арсенал молекулярно-генетических маркеров и методов, имеющих свои положительные и отрицательные стороны и разный уровень разрешающей способности. (собственно гены) напрямую связаны с фенотипом. Поэтому изменчивость определяемого ими признака, а, следовательно, и вариабельность генов ограничены приспособленностью к условиям среды, что объясняет более медленную скорость возникновения мутаций в генах по сравнению с некодирующими последовательностями. Селективная нейтральность маркера, т.е. отсутствие влияния на приспособленность особей, становится особенно важна в вопросе эволюционной истории популяций. В противном случае филогенетические древа популяций, основанные на данных о частотах аллелей и гаплотипов, окажутся статистически смещенными (Zhivotovsky and Feldman, 1995). Мультилокусные маркеры (RAPD, RFLP, AFLP) и микросателлиты в целом более нейтральны, чем белковые маркеры, поскольку локализованы в интронах и других некодирующих участках генома.
Преобладающая часть ДНК многоклеточных некодирующая, и скорость возникновения мутаций в таких областях генома примерно вдвое выше, чем в кодирующей (Алтухов и Салменкова, 2002).
Ниже дана краткая характеристика основных достоинств и недостатков некоторых молекулярных маркеров, которые используют для оценки генетического полиморфизма.
Постановка экспериментальных скрещиваний
К 10-40 мг тканевой пробы добавляли 400 мкл лизирующего буфера (0,4 М NaCl; 0,01 М TrisHCl, рН 8,0; 2 mM EDTA, рН 8,0; 2 % SDS) с протеиназой К (0,05 мг/мл). Лизис проводили в течение 1-5 часов при 56С в термостатирующем шейкере. После экспозиции к лизату добавляли 300 мкл 6 М NaCl, пробу перемешивали в течение 30 с и центрифугировали при 10 тыс.об./мин. в течение 30 минут. Верхнюю водную фазу отбирали в чистые пробирки и приливали к ней двойной объем 96 %-ого этанола.
Для формирования осадка ДНК пробы экспонировали при минус 20 С не менее 60 мин., затем осаждали ДНК центрифугированием при 10 тыс. об./мин. в течение 30 мин. Удаляли спирт и промывали осадок 70 %-ым этанолом. Осадок подсушивали и растворяли в бидистиллированной воде в течение 10 мин. при 50 С.
Выделение тотальной ДНК из музейного лютериала (спилы грудного плавника) проводили также методом солевой экстракции (Aljanabi, Martinez, 1999) с нашими модификациями. В выборке из 345 исследованных спилов с помощью модифицированного метода удалось выделить ДНК, в 265 случаях пригодную для ПЦР.
Навеску 10-40 мг механически измельченного спила помещали в 500 мкл 50 мМ ЭДТА и экспонировали 24 часа при комнатной температуре в шейкере S4 (ELMI). После чего жидкость удаляли, пробу дополнительно измельчали, подсушивали и помещали в 400 мкл лизирующего буфера (0,4 М NaCl; 0,01 М TrisHCl, рН 8,0; 10 mM EDTA, рН 8.0; 2 % SDS) с протеиназой К (0,1 мг/мл). Лизис проводили в течение 18 часов при 56 С в термостатирующем шейкере. Дальнейшая процедура соответствовала описанным выше этапам экстракции ДНК.
Качество и количество выделенной ДНК оценивали спектрофотометрически. Показателем чистоты служило значение соотношения коэффициента экстинции, измеренного на спектрофотометре при длине волны 260нм (D26o) к коэффициенту экстинции, измеренного при длине волны 280 нм (D28o)- Концентрацию ДНК в растворе рассчитывали по формуле: WHK]=D260x50xA, где А - кратность разведения. Степень деградации высокомолекулярной ДНК определяли визуально после проведения горизонтального электрофореза проб. Для этого наносили 10 мкл раствора ДНК с 5 мкл 6-кратного буфера в 0,9 % агарозный гель с бромидом этидиума (концентрация 0,5 мкг/мл). Проводили электрофорез в однократном ТВЕ-буфере при напряжении 10 В/см . Агарозный гель с пробами ДНК помещали в трасиллюминатор и фотографировали в проходящем УФ-свете (310 нм). Полученные электрофореграммы анализировали с помощью программного обеспечения "GelDoc" (BioRad).
В предварительных экспериментах из 30 случайных олигонуклеотидов, различающихся по размеру и содержанию GC-nap, нами были отобраны пять праймеров, с помощью которых были получены четкие, стабильно воспроизводимые, полиморфные RAPD-спектры (табл. 2.3; рис. 2.6).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли следующим образом. Реакционная смесь (25 мкл) для проведения полимеразной цепной реакции содержала 16,6 мМ (NH4)2S04, 67 мМ Tris-HCL (рН 8,8), 0,01 % Tween-20, 2 мМ MgCl2, по 150 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP), 150 пкМ праймера, 10 нг ДНК и 1,25 акт.единиц Taq-полимеразы (ООО «Синтол», Москва). Амплификацию проводили по следующей схеме: предварительная денатурация ДНК: 94 С - 4 мин., синтез ПЦР-продуктов (37 циклов): денатурация 94 С -30 с, отжиг праймеров 36 С - 30 с, синтез ДНК 72 С - 1 мин., достройка цепей: 72 С -10 мин. ПЦР проводили в термоциклере "Tetrad РТС-225" (MJ Research, США).
По окончании амплификации с RAPD праймером к пробам добавляли по 5 мкл буфера для нанесения проб, содержащего 0,25 % бромфенолового синего, 0,25 % ксиленцианола и 30 % глицерина, и наносили по 15 мкл образца в 6 %-ый полиакриламидный гель. В качестве стандарта молекулярного размера фрагментов ДІЖ использовали A/PstI (Fermentas).
С помощью программы Phoretix ID Database ("Nonlinear Dynamics", Великобритания) RAPD-профили представляли в виде общей бинарной матрицы типа «объект-признак», осуществляли расчет коэффициентов кросс-корреляции индивидуальных RAPD-спектров и кластерный анализ. В качестве out-group использовали RAPD-спектры севрюги Acipenser stellatus.
Электрофоретический анализ продуктов амплификации проводили в полиакриламидном геле (ПААГ). Для этого после завершения STR-ПЦР пробы смешивали с формамидом, содержащим 0,25 % бромфенолового синего и 0,25 % ксиленцианола, в соотношении 1:2. Затем их прогревали при 95 С в течение 3 мин. и охлаждали на льду. Охлажденные пробы немедленно наносили в 8 %-ый денатурирующий ПААГ, содержащий 0,5 % мочевины. Стандартами молекулярного размера аллелей служили несколько эталонных проб, для которых размер определяли предварительно с помощью капиллярного электрофореза.
После завершения электрофореза ПААГ окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин. и отмывали в дистиллированной воде.
Регистрацию электрофореграмм проводили с помощью сканера гелей Typhoon8600 (Molecular Dynamics) и программы записи изображения Typhoon Scanner Control (Molecular Dynamics).
Маркеры митохондриальной ДНК - «baerii-like» (BL) и «gueldenstadtii» (GUE) митотипы определяли с помощью метода видовой идентификации осетровых рыб (Мюге и др., 2008). Выделенную ДНК анализировали в мультиплексной полимеразной цепной реакции (мПЦР). Для идентификации митотипов использовали специфические олигонуклеотиды: общий для всех опорный праймер AR (5 TATACACCATTATCTCTATGT-3 ), уникальный для «gueldenstadtii» митотипа праймер AGF (5 -GCACAGACTATGTGGTATCCAGAA-3 ), для «baerii-like» митотипа праймер ABF (5 -CAGATGCCAGTAACAGGCTGA-3 ), видоспецифичный для A.baerii праймер ABRM (5 GTCTGTCTAGAACATAtG 3 ).
В состав ПЦР-смеси входили: 1х Taq-буфер (Силекс, Москва), 2,0 мМ MgCl2, по 0,5 мМ каждого dNTPs, 2,5-5,0 пМ праймеров, 1,0 акт.единица Taq-полимеразы (Силекс). мПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технологии, Москва) или в "Tetrad РТС-225" (MJ Research, США ) при следующих параметрах: предварительная денатурация при 95С - 2 мин., 35 циклов: 92 С - 20 с, 57 С - 30 с, 72 С - 30 с, этап досиитеза 72 С - 10 мин.
Генетический полиморфизм русского осетра по ДНК-маркерам
Характеристика RAPD-профилей, полученных для двух нерестовых популяций (каспийская и азовская) русского осетра, приведена в главе 2. Размер проанализированных фрагментов варьировал от 250 до 1000 пн. Результаты определения частот рецессивного нуль-аллеля ч), значения гетерозиготности Hj и их средних значений по всем локусам, а также процент полиморфных локусов для популяций русского осетра Азовского и Каспийского морей представлены аллеля Яj и гетерозиготности Н} RAPD-локусов русского осетра географически разделенных популяций не наблюдается. Общее количество RAPD-локусов по пяти использованным праймерам составило 295 фрагментов, из которых 274 являются информативными. RAPD-спектры характеризуются выраженной индивидуальной изменчивостью, которая оценена по вариабельности числа амплифицированных ДНК-фрагментов. Уровни индивидуальной изменчивости примерно одинаково высоки в обеих выборках: Р=83,2 % для азовской и / =82,8 % для каспийской популяций.
Следует отметить что, сравниваемые группы различаются по числу мономорфных локусов (табл. 3.5). Например, если праймер ОРА05 в каспийской группе инициировал амплификацию пяти таких локусов (-930, 570, 475, 420 и 300 пн), то в азовской у всех проанализированных особей встречались дополнительно два мономорфных локуса (-790 и 330 пн). Количество бэндов, присутствовавших на фингерпринтах RAPD-B3 всех азовских особей, составило 7, у каспийских особей - 6, причем аллель, размер которого равен - 400 пн, мономорфный в первом случае встречался в каспийской группе с частотой 0,477 и т.д.
В среднем наиболее высокие значения гетерозиготности и полиморфизма RAPD-локусов характерны для популяции из Каспийского моря (табл. 3.6).
Сравнение частот RAPD-фрагментов продемонстрировало достоверные различия выборок, тогда как значения гетерозиготносте популяций не имеют достоверных уровней различий (табл. 3.6).
Определение гетерозиготности в азовской выборке использовали для оценки возможного временного тренда в различных поколениях русского осетра. Значения этого показателя сравнивали для 27 особей поколений 1978 - 1983 гг. и 27 особей поколений 1993 - 2000 гг. Полученные величины 0,355+0,135 и 0,316+0,137 соответственно статистически достоверно не отличались, что не подтверждает существования вышеназванного тренда.
На основе матрицы генетических дистанций были построены гистограммы распределения генетических дистанций (D) для двух пар сравниваемых популяций русского осетра и для пары видов русского осетра и севрюги (рис. 3.6). A.stellatus использовали в качестве внешней группы сравнения. Распределение внутрипопуляционных генетических дистанций у представленных групп, также как и распределение межпопуляционных генетических дистанций было близко к нормальному распределению. Распределение суммарных генетических дистанций представляет собой два хорошо дифференцированных пика, соответствующих внутривидовым и межвидовым значениям.
Согласно данным RAPD-анализа сравниваемые выборки имеют высокий уровень внутри популяционного полиморфизма (табл. 3.5 и 3.6). Однако кластерный анализ (UPGMA), проведенный на основании RAPD-спектров, объединил всех особей двух популяций в одну иерархическую группу, внутри которой азовская популяция частично формировала собственные ветви, а частично входила в состав нескольких кластеров каспийской популяции (рис.3.7). В отличие от них все особи севрюги (внешняя группа) группировались в самостоятельный кластер. На фоне высоких значений внутрипопуляционного полиморфизма (Hj, Р) уровень межпопуляционной дифференциации русского осетра оказался недостоверным (FST=0,011). производителей для осетровых рыбоводных заводов. В сложившихся условиях главной популяционно-генетической задачей системы промышленного воспроизводства осетровых видов рыб является сохранение их внутривидовой структуры. Практически эта задача сводится к сохранению самого низкочастотного маркера, выявляемого при исследовании репрезентативной выборки. Наименьшая частота RAPD-аллеля в исследованных выборках составила 0,016. Используя это значение в вышеприведенных формулах (глава.2), получаем, что для сохранения наиболее редкого RAPD-аллеля в азовских популяциях русского осетра с 99%-ой вероятностью рекомендуемая численность особей из маточных стад, участвующих в искусственном воспроизводстве, должна составлять не менее 205 особей.
В итоге на основании данных RAPD-анализа отличить друг от друга популяции русского осетра оказалось невозможным. Ни один из использованных праймеров не инициировал амплификацию таксонспецифических фрагментов, с помощью которых можно было бы идентифицировать особей этих популяций на электрофореграммах. Все проведенные в дальнейшем анализы (оценка генетических дистанций, UPGMA-реконструкции, FSr тесты на дифференциацию) также не смогли дискриминировать эти популяции.
В целом, низкая степень дивергенции популяций русского осетра по ядерным маркерам ожидаема вследствие полиплоидности вида. В этом случае низкая частота гомозигот у полиплоидов ослабляет действие отбора и дрейфа генов.
