Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Нейрогормональная регуляция репродуктивной функции у рыб 9
1.2. Стероидогенпая ткань гонад и половые стероидные гормоны рыб 13
1.3. Интерреналовая железа и функция кортизола у рыб 19
1.4. Нарушение функций половых желез у рыб 20
1.5. Биология размножения русского осетра 23
1.6. Гормональная регуляция созревания гонад у рыб 26
2. Материалы и методы исследований 29
2.1. Характеристика материала 29
2.2. Методы исследований 31
3. Результаты исследований 38
3.1. Результаты исследований русского осетра в различные периоды жизни 38
3.1.1. Краткая характеристика состояния половых желез русского осетра в морской и речной периоды жизни 38
3.1.2. Содержание кортизола и половых стероидных гормонов в сыворотке крови русского осетра в морской период жизни 43
3.1.3. Содержание кортизола и половых стероидных гормонов в сыворотке крови русского осетра в период миграции 49
3.2. Результаты исследований русского осетра на завершающих этапах созревания гонад 53
3.2.1, Сравнительное исследование осетров разных биологических групп 53
3.2.1.1. Размеры ооцитов у самок русского осетра разных биологических групп 54
3.2.1.2.Гистологический анализ гипофизов самок озимого осетра после длительного периода выдерживания 55
3.2.1.3. Уровни стероидных гормонов в сыворотке крови русского осетра разных биологических групп на завершающем этане созревания гонад 56
3.2.1.4. Оценка гоиадотроиной активности гипофизов у созревших самок русского осетра разных биологических групп 61
3.2.2. Уровни кортизола и тестостерона в сыворотке крови самцов русского осетра после повторных гормональных стимуляций спермиации 62
3.2.3. Содержание кортизола и половых стероидов в сыворотке крови самок русского осетра с разным периодом созревания после гормональной стимуляции 65
3.2.4. Результаты исследования самок русского осетра, созревших после стимуляции гипофизарным препаратом осетровых и сурфагоном 67
3.2.4.1.Содержание кортизола и половых стероидов в сыворотке крови самок русского осетра после стимуляции овуляции гипофизарным препаратом осетровых и сурфагоном 68
3.2.4.2. Биотестирование гипофизов самок русского осетра после стимуляции овуляции гипофизарным препаратом осетровых и сурфагоном 71
3.2.5. Уровни стероидных гормонов при нарушении процессов созревания гонад русского осетра 74
3.2.5.1. Содержание кортизола и половых стероидных гормонов у самок русского осетра с разным ответом на гормональную стимуляцию 74
3.2.5.2. Содержание кортизола и андрогаюв у самцов русского осетра с разным ответом на гормональную стимуляцию созревания 80
3.2.5.3. Содержание стероидных гормонов в сыворотке крови самок русского осетра после гормональных воздействий при нормальном созревании ооцитов и па разных фазах атрезии овариальных фолликулов 81
4. Обсуждение результатов 87
4.1. Стероидные гормоны в регуляции гаметогенеза у русского осетра в разные периоды жизни 87
4.1.1. Кортизол 87
4.1.2. Тестостерон 89
4.1.3. 11-кетотестостерон 91
4.1.4. Эстрадиол 93
4.1.5. Связь уровней гормонов в крови с отсутствием ответа на гормональную стимуляцию 94
4.1.6. Связь уровней гормонов с ухудшением качества зрелых половых клеток 95
4.1.7. Связь уровней стероидных гормонов с атрезией овариальных фолликулов 96
4.2. Возможности применения результатов исследования для рыбоводных целей 97
4.2.1. Гормональный статус производителей осетра различных биологических групп в связи с их воспроизводством 98
4.2.2. Зависимость гормонального статуса самок осетра после овуляции от типа гормонального препарата 100
4.2.3. Влияние повторной гормональной стимуляции самцов осетра на уровни кортизола и тестостерона в сыворотке крови 102
Выводы 104
Практические рекомендации 105
Список цитироваііной литературы 107
- Стероидогенпая ткань гонад и половые стероидные гормоны рыб
- Краткая характеристика состояния половых желез русского осетра в морской и речной периоды жизни
- Уровни кортизола и тестостерона в сыворотке крови самцов русского осетра после повторных гормональных стимуляций спермиации
- Зависимость гормонального статуса самок осетра после овуляции от типа гормонального препарата
Введение к работе
Одной из основных проблем физиологии позвоночных животных является выяснение механизмов гормонального контроля половых циклов. У низших позвоночных, в том числе и у рыб, по сравнению с млекопитающими существует ряд особенностей в регуляции репродуктивной функции (Баранникова, 1981; Peter, 1986; Nagahama, 1987; King, Millar, 1990a, b; Баранникова и др., 1991a, Баранникова, Дюбин, 1992; Kime, 1993). Исследование этого вопроса у рыб представляет особый интерес, так как у них значительно шире разнообразие в способах размножения, чем у всех других позвоночных. Существует множество видов с различной экологией и разными типами жизненного цикла. Даже в пределах популяций одного вида, как, например, у осетровых (Acipenseridae) или лососевых (Salmonidae) могут образовываться внутрипопуляционные биологические группы, отличающиеся состоянием половых желез в начале нерестовой мш-рации (Берг, 1948; Гербильский, 1951; 1957, Баранникова, 1966, 1975а).
Известно, что развитие и созревание половых желез рыб происходит на основе комплексного взаимодействия внешних и внутренних факторов. Одним из возможных подходов к изучению механизмов регуляции созревания гонад является исследование содержания гормонов в сыворотке крови рыб в зависимости от сезона, репродуктивного никла, а также с учетом экологических особенностей исследуемого вида. В частности, представляет интерес изучение динамики половых стероидных гормонов в крови, которые являются важным звеном в эндокринной регуляции размножения. Они участвуют во всех этапах репродуктивного цикла, выполняя ряд функций для обеспечения нормального хода гаметогенеза, развития половых признаков, подготовки и осуществления нерестовой миграции, полового и родительского поведения (Баранникова, 19756; Fostieretal., 1983; Никитин и др., 1991; Kime, 1993; Yaron, 1995).
Наиболее интенсивно в этом направлении ведутся работы па представителях костистых рыб (Tclcostei), в то время как осетровым (Acipenseridae), которые относятся к более древней группе - хрящевым ганоидам (Chondrostei), не уделено достаточного внимания. Изучение особенностей гормональной регуляции
размножения осетровых представляет большой интерес с точки зрения эволюционной физиологии.
Одним из представителей осетровых является русский осетр (Acipcnser gueldcnstaedtii Brandt). Этот вид, как и большинство рыб из этой группы, относится к проходным рыбам, совершающим миграции из морей в реки для размножения. Начало созревания гонад проходит в морской период жизни, а окончательное дозревание - по мерс продвижения по реке и на нерестилищах,
В пределах ряда популяций выделяют две основные биологические группы -яровую и озимую, которые мигрируют в реки в различные сезоны и с разным состоянием воспроизводительной системы (Берг, 1948; Гербильский, 1951, 1957; Баранникова, 1966, 1975а), В этой связи особое значение для понимания гормональной регуляции гаметогеиеза у осетровых приобретает сравнительное исследование уровней стероидных гормонов в крови рыб одного вида, относящихся к разным биологическим группам.
В настоящее время поддержание численности осетровых в Вол го-Каспийском бассейне в значительной мере осуществляется за счет работы волжских рыбоводных заводов, работа которых включает в себя получение половых продуктов от половозрелых особей, с последующим их искусственным оплодотворением и выращиванием личинок.
Однако все представители осетровых обычно пс созревают в неволе без дополнительных стимулирующих воздействий. Поэтому для индукции созревания гонад рыб и получения от них жизнестойкого потомства в условиях рыбоводного завода применяют гормональные инъекции. Традиционно для этих целей использовали препараты ацетонированных гипофизов осетровых рыб (Гербильский, 1941; Боев, Артюхин, 1978; Баранникова и др., 1983), Однако, из-за уменьшения биологических ресурсов для получения гипофизов осетровых ведется поиск новых гормональных препаратов. В частности предполагается использовать синтетические аналоги гормонов, регулирующих синтез и секрецию гоиадотропипов гипофиза (Баранникова и др.,1983, 1985а, 1989а; Гончаров, 1984, 1990, 1991; Colombo ct al., 1988). В связи с этим, данные об уровнях стероидов в крови у рыб, созревающих после применения разных гормональных препаратов,
7 моїут быть использованы при разработке новых научно-обоснованных методов стимуляции гамстогенеза и созревания.
До недавнего времени, основным объектом волжского осетроводства являлся яровой осетр, мигрирующий в близком к зрелости состоянии. И хотя еще в 50-х годах была показана принципиальная возможность созревания озимого осетра в искусственных условиях (Гсрбильский, 1951; Баранникова, 1954; Казанский, 1962), эта группа рыб практически не использовалась, так как до начала работ по получению зрелых половых продуктов требовала длительного выдерживания (от 6 до 11 месяцев). В настоящее же время в связи с резким снижением численности всей популяции русского осетра его воспроизводство на рыбоводных заводах основывается на озимом осетре различных периодов хода. Эти формы осетра (озимый осетр осеннего хода и озимый осетр летнего хода), в отличие от ярового, имеют другие биологические особенности. Например, озимый осетр летнего хода, заходит в реки с гонадами, далекими от зрелости, и завершение гамстогенеза проходит в период миграции. При длительном содержании озимых рыб до созревания в условиях рыбоводных заводов прерывается естественный ход их ападромпой миграции. Это приводит к различиям в физиологическом состоянии особей из разных биологических групп. Благодаря данным о влиянии длительного содержания и искусственных условиях на физиологическое состояние рыб станет возможным успешное разведение разных форм осетра и, соответственно, сохранение генетического разнообразия воспроизводимой популяции.
Одной из проблем в изучении гормональной регуляции гамстогенеза осетровых является то, что в последнее время, среди осетровых все чаще встречаются особи с различными нарушениями обмена веществ и процессов созревания гонад (Романов, Шевелева, 1992; Моисеева и др., 1997; Рубан, 1999; Саенко, 2000; Баранникова и др., 2002 и др.). В данном случае характеристика уровней стероидных гормонов в крови может служить одним из показателей, отражающим их физиологическое состояние. Это обуслоплено тем, что содержание стероидов в крови может изменяться не только в зависимости от стадии созревания гопал (Баранникова, 19756; Баранникова и др., 2000а), но и под действием внешних стрессорных факторов (Donaldson, 1981; Epple ct al., 1982; Barton, Peter, 1987;
8 Pickering et al., 1987; Pickering, 1989; Дюбип, 1989; Баюнова, Семенкова, 1999; Шаляпина, Ордян, 2000).
Проведение комплексного анализа концентраций стероидных гормонов в крови у осетровых разных внутрипопуляционных биологических групп, в различные сезоны, на разных этапах созревания гонад, а также при нарушениях нормального развития половых желез, позволит лучше понять механизмы гормональной регуляции размножения осетровых и будет способствовать усовершенствованию методов их разведения,
В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы заключалась в исследовании состояния репродуктивной системы и содержания стероидных гормонов в сыворотке кропи у самок и самцов русского осетра на разных этапах полового цикла как в естественных условиях обитания (море, река), так и в условиях рыбоводного завода.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Провести гистологический анализ половых желез и анализ уровней стероидных гормонов (кортизола, тестостерона, 11-кетотсстостсроиа, эстрадиола-17В) в сыворотке крови осетра с гонадами на разных стадиях зрелости в морской период жизни и в период анадромной миграции.
Определить концентрации стероидных гормонов у осетра разных биологических групп на завершающем этапе созревания.
Изучить влияние длительного периода выдерживания в искусственных условиях на состояние воспроизводительной системы осетра.
Сравнить уровни стероидов в крони и гонадотропную активность гипофизов у самок осетра после применения глицеринового гипофизарного препарата осетровых и сурфагоиа.
Исследовать содержание кортизола и половых стероидов в сыворотке крови у самок осетра после гормональных воздействий при нормальном созревании ооцитов и при нарушениях функции гонад.
Стероидогенпая ткань гонад и половые стероидные гормоны рыб
Половые стероидные гормоны вырабатываются в гонадах всех позвоночных животных и обнаружены у многих групп беспозвоночных. Очевидно, основные этапы биосинтеза стероидов очень древние и сравнительно мало изменялись в эволюции, в результате чего многие стероидные гормоны по структуре универсальны среди позвоночных животных (Баранникова и др., 1975а; 1991а; Kime, 1993).
Локализация стероидогенных тканей в гонадах рыб. Несмотря на то, что локализация стсроидогснпои ткани в гонадах может отличаться у различных позвоночных, клетки, в которых происходит синтез стероидов, характеризуются по ультраструктуре определенными чертами. Л именно наличием в цитоплазме митохондрий с трубчатовезикулярными кристами, эндоплазматического ретикулума, представленного аграпулярной и гранулярной формами и липилных капель или липосом. Однако принципиальная возможность вырабатывать половые стероиды существует не только в половых железах, но и в ткани головной почки, иптеррепаловой ткани, в мозге рыб (Idler, Macnab, 1967; Bukovskaya et al., 1997).
При изучении стероидиродуцирующих тканей большое значение имело гистохимическое выявление одного из ключевых энзимов стероидогепеза - ЗР-гилроксистероиддегидрогеназы(Зр-ГСДГ) (Fosticret al., 1983; Nagahama, 1983).
В семенниках рыб описаны интерстициальные клетки, лежащие группами между дольками или канальцами семенника. Эти клетки обладают всеми признаками стсроидпродуцирующих: активностью 3[І-ГСДГ, специфической ультраструктурой и четкими изменениями на разных этапах полового цикла. Показано, что иптерстиниальные клетки рыб являются гомологом клеток Лейдига млекопитающих и основными источниками аидрогенов (Nagahama, 1983). Под действием ГТГ из прегненолона происходит синтез основных мужских половых стероидов: тестостерона и 11-кегготсстостерона (Borg, 1994). Лроматазная активность в семенниках рыб выражена очень слабо, поэтому выработка эстрадиола у самцов чрезвычайно мала (Христофоров, Мурза, 1998).
Активность Зр-ГСДГ обнаружена также у рыб в клетках цист, в стенках семенных канальцев, условно называемых клетками Сертоли (Дюбин, 1986). Однако в этих клетках нет четко выраженных структур, характерных для стероид ироду пирующих клеток.
В яичниках рыб синтез половых стероидов из холестерина происходит в специальных клетках теки фолликула, в которых локализуется активность Зр-ГСДГ. Для этих клеток характерны специфические для стсроидпродуиирующих клеток черты ультраструктуры (Поленов и др., 1978). На ранних этапах созревания в текс под действием ГТГ синтезируемый из предшественников прогестерон трансформируется в тестостерон, часть которого транспортируется в клетки фолликулярного эпителия (гранулеза), где также у многих видов рыб обнаружена активность Зр-ГСДГ (Дюбин, 1986; Васильева, 1988). Однако в этих клетках в ряде случаев не выявлено характерных особенностей ультраструктуры (Nagahama, 1983). По-видимому, в клетках гранулезы идет дальнейшее превращение тестостерона (ароматизация) в эстрогены, главным образом в эстрадиол-17р. Затем эстрадиол вновь переносится в клетки теки и уже оттуда выделяется в кровь. Наряду с тестостероном специальные клетки теки синтезируют 17-а-гидроксипрогестерон, который транспортируется в клетки гранулезы и там, под действием 20р-гидроксистероиддсгидрогеназы, превращается в 17а, 20р-дигидрокси-4-прсгие-2-он. Именно этот гормон принято считать основным действующим стероидом, который вызывает смещение зародышевого пузырька к оболочке ооцита, завершение мейоза и овуляцию.
Оба типа клеток яичника обладают рецепторами к гопадотропииам гипофиза. Действие гонадотропинов на клетки-мишени сопряжено с выходом кальция из внеклеточных пространств. В активацию сигнальной транедукпии генов под действием гонадотропинов вовлекается система адепилатциклазы - циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), а также полифосфоинозитид и кальций (Van der Kraak et al, 1992). В ходе развития фолликула происходит увеличение числа рецепторов и концентрации внутри клеточной цАМФ в клетках теки и гранулезы, а также рост ароматазной активности в клетках гранулезного слоя (Nagahama, 1987; Kanamori et al., 1987).
Половые стероидные гормоны рыб. Главной функцией всех половых стероидов у рыб является оказание непосредственного влияния на рост, развитие и созревание половых клеток, регуляцию развития вторичных половых признаков. Помимо этого они выполняют и внегонадпые функции, участвуя в формировании репродуктивного поведения и в выработке половых феромонов, благодаря которым осуществляегся синхронизация перехода в иерсстное состояние самки и самца и эффективность размножения (Lilcy, Stacey, 1983).
В половых железах рыб вырабатываются прогестины, апдрогены, эстрогены и в небольших количествах кортикостсроиды. В семенниках и яичниках могут обнаруживаться одинаковые стероиды, однако их соотношение на разных этапах полового цикла у самок и самцов различно (Ванякина, 1969; Персов, 1975; Scott, Bayncs, 1982; Borg, 1994; Kime et al., 1996; Груслова, 2001).
Наличие сходных половых гормонов у самок и самцов не удивительно, так как пути биосинтеза андрогенов и эстрогенов одинаковы. Исходным соединением для стсроидогснеза является холестерин, а ключевыми промежуточными продуктами синтеза - прогненолон и прогестерон.
Прогестерон был обнаружен в тканях всех позвоночных и многих беспозвоночных. Этот гормон, являясь важным звеном в синтезе стероидов, обладает самостоятельным физиологическим действием (Hoar, 1969; Баранникова, 19756). Рядом авторов было показано, что прогестерон и его производные, гидроксилировашше в 17 и 20 положениях, (такие как, например, 17-а-гидрокси-4-прегнеи-3-он и 17-а-20-р-дигидрокси-4-преген-3-он) участвуют в развитии и созревании женских половых клеток (Гончаров, 1969; Дстлаф, 1970; Lutes, 1985; Kime et al., 1996), а также в осуществлении реакции спермиации (Nagahama, 1987).
В настоящий период «классическими» половыми стероидами у костистых рыб считаются эстрадиол-17р\ тестостерон, 11-кетотестостерон, 17a,20(i- дигидрокси-4-прсгнен-2-он. Однако существует ряд стероидов, отличающихся по своей структуре от основных гормонов, но играющих важную роль в таких процессах, как созревание, овуляция, спсрмиация. В основном, речь идет о таких стероидах, как а или (І эпимерах по 3-му или 5-му атому углерода, или гидроксилированных в 6-, 7- или 21-м положениях. Так у некоторых костистых (карповых и камбаловых) большую роль в миграции зародышевого пузырька к периферии ооцита и инициации процесса овуляции играют «неклассические» прогестины: 17, 20(3, 21-тригидрокси-4-прегнси-З-оп; 5-прегнен-2р\17, 20р0-триол; 11-дсоксикортизол (Kime, 1993).
Краткая характеристика состояния половых желез русского осетра в морской и речной периоды жизни
Из-за сокращения возможности естественного нереста осетра, поддержание численности его популяции происходит за счет разведения на рыбоводных заводах. При искусственном разведении созревание гонад рыб осуществляется под воздействием экзогенных гормонов. В этом случае увеличение содержания гонадотропного гормона в крови происходит не под влиянием нерестовых условий, а в результате введения гормональных препаратов.
Данное исследование уровней стероидных гормонов в крови осетра на завершающем этапе созревания гонад (V СЗ) было проведено на особях, которые созревали в искусственных условиях.
В этой главе рассмотрены результаты ИФЛ уровней кортизола и половых стероидных гормонов (тестостерона, 11-кетотсстостерона и эстрадиола) в крови осетра после воздействия гормональными препаратами, стимулирующими овуляцию и спермиацию.
При обработке данных учитывалась принадлежность исследуемых особей к той или иной биологической группе. Кроме того, у самок рассматривались такие параметры, как наличие или отсутствие овуляции, процент нормально развивающихся эмбрионов на стадии гаструляции, период созревания после гормональной инъекции; а у самцов - наличие или отсутствие спермиации, качество спермы.
Дополнительно были проведены измерения ооцитов, гистологический анализ гипофизов (после длительного выдерживания) и гонад (при нарушениях процессов созревания), а таюке определение гонадатороппой активности гипофизов (после овуляции) у самок осетра разных биологических групп. Для сохранения генетического разнообразия искусственно воспроизводимых видов осетровых необходимо разведение особей, принадлежащих к разным биологическим группам. Однако от принадлежности особи к той или иной биологической группе зависит продолжительность содержания рыб на рыбоводном заводе до созревания, так как они мигрируют в реки в разные сроки и с разным состоянием воспроизводительной системы. Так яровой осетр, с близкими к зрелости гонадами (IV СЗ), заходит в реку весной непосредственно перед нерестом. Озимый же осетр начинает нерестовую миграцию осенью с гонадами далекими от зрелости (III СЗ). В результате озимый осетр по сравнению с яровым подвергается длительному выдерживанию в бассейнах с относительно невысокой проточностыо. А это означает, что у озимых рыб задолго до нереста прерывается естественный ход их анадромной миграции. В связи с этим возникает необходимость изучения физиологического состояния рыб после длительного содержания в условиях рыбоводных заводов. Для этого исследования были выбраны особи трех биологических групп осетра: 1) яровой - особи отлавливались в апреле в близком к зрелости состоянии, содержались в бассейнах до созревания не более I месяца; 2) озимой осеннего периода хода - особи отлавливались с августа по октябрь, содержались в бассейнах до созревания 6-8 месяцев; 3) озимой летнего периода хода - особи отлавливались с мая по июнь, содержались в бассейнах до созревания в течение 11 месяцев. Нами проведены сравнительные исследования размеров ооцитов и степени их поляризации в разных биологических группах осетра, изменения гистологической структуры гипофизов у самок после длительного выдерживания, и уровней стероидных гормонов в крови на завершающем этапе созревания гонад. Осетр, как и другие представители осетровых, не созревает спонтанно в искусственных условиях. Поэтому для стимуляции созревания применяется метод гипофизарных инъекций (Гсрбильский, 1941). Для ответа самок на введение гипофизариого препарата, необходимо, однако, чтобы их яичники находились на завершенной преднерестовой стадии (IV СЗ). Эта стадия характеризуется смешением ядра к оболочке в ооцитах старшей генерации. Установлено, что нормальная реакция на инъекцию ГТП наступает в том случае, если показатель поляризации 0,07. В связи с тем, что самки осетра разных биологических групп отлавливаются не только в разные сроки, но и с гонадами на разных стадиях зрелости, было необходимо провести оценку степени зрелости гонад у самок озимых форм, у которых была прервана нерестовая миграция на ее ранних этапах. Для этого были проведены измерения размеров ооцитов и степени их поляризации у двух форм озимого осетра (осеннего и летнего периодов хода) после длительного выдерживания перед началом гормональной стимуляции овуляции. Было выяснено, что к момензу наступления нерестовых температур у самок озимого осетра осеннего и летнего хода ооциты старшей генерации имели одинаковые размеры. Л именно, их диаметр был равен 121,2+1,2 усл. ед. и 120,3+2,12 усл. ед., соответственно. Оценка положения ядра в ооцитах у особей озимых форм показала, что к концу выдерживания произошло смещение ядра к оболочке. Степень поляризации их ооцитов составляла 0,06 (озимые самки осеннего хода) и 0,07 (озимые самки летнего хода). Дополнительно проводилось взвешивание икринок после овуляции. В результате было установлено, что масса окулировавших ооцитов у ярового осетра (20,4±0,5 мг), озимого осеннего хода (19,8+0,8 мг) и озимого летнего хода (20,4±0,2 мг) достоверно не различалась. Был проведен гистологический анализ гипофизов самок озимого осетра летнего периода хода, после выдерживания в бассейнах в течение 11 месяцев. Состояние половые желез исследуемых рыб соответствовало IV СЗ.
Результаты гистологического анализа показали, что после длительного периода выдерживания морфологическое состояние передней доли гипофизов самок осетра сходно с гистологическими картинами, которые можно наблюдать в гипофизах зрелых мигрантов русского осетра в преднерестовый период. Л именно, па препаратах хорошо видно, что в вентральной зоне передней доли гипофиза в базофильных клетках происходит накопление значительного количества гормонсодержащего коллоида (фото 9). В отдельных местах можно наблюдать картины образования крупных лакун между тяжами базофильных клеток, заполненных коллоидом (фото 10). Повсеместно видны расширения кровеносных сосудов. Все это свидетельствует об интенсивной секреции гормон содержащего коллоида с одновременной подготовкой к его выведению в кровеносную систему.
Уровни кортизола и тестостерона в сыворотке крови самцов русского осетра после повторных гормональных стимуляций спермиации
Вплоть до настоящего времени искусственная стимуляция созревания осетровых рыб осуществлялась с использованием ГГП, для приготовления которого заготавливались гипофизы от идущих на нерест рыб. В последние годы встал вопрос о возможности изготовления ГГП из гипофизов особей, созревших после гормональной стимуляции ГГП или сурфагоном. Однако стимуляция созревания под воздействием этих двух препаратов происходит на разных уровнях. После ведения ГГП созревание происходит в основном за счет экзогенного ПТ, содержащегося во вводимом препарате, тогда как под воздействием сурфагона в гипофизе рыб происходит выработка собственного ПТ. В связи с этим, необходимо было определить, как отражается созревание под влиянием ГГП и сурфагона на содержании гонадотропного гормона в собственном гипофизе рыб.
Для этого было проведено сравнительное биотестирование ацетонироваппых гипофизов самок осетра из разных биологических ірупп (яровых и озимых летнего периода хода), созревших после дробного введения ГГП и сурфагона (V СЗ). Дополнительно было проведено тестирование гипофизов интактпых самок озимого осетра летнего периода хода с гонадами на IV СЗ после длительного периода
На основании проведенного биотсстировапия можно заключить, что минимальная эффективная доза ацетонированного препарата гипофиза иитактных самок осетра соответствует 0,1 мг на 1 лягушку Rana temporaria L. Для пересчета полученных данных на другой вид Rana ridibunda, традиционно используемый для биотестирования, используется коэффициент 3. Таким образом, активность 1 мг аиетонированного препарата гипофиза иитактных самок соответствует 3,3 Л.Е.
Активность препарата, полученного из гипофизов самок осетра, созревших в результате введения ГГП, несколько ниже и соответствует примерно 2,5 Л.Е. в I мг препарата. Активность препарата, полученного из гипофизов самок осетра, созревших в результате введения сурфагона, еще ниже и соответствует 1,2-1,5 Л.Е. Па фоне ухудшения экологической обстановки среди осетров разных биологических групп все чаще встречаются рыбы с различными нарушениями воспроизводительной функции. В первую очередь это проявляется па заключительных этапах созревания половых желез рыб. Физиологический механизм и дальнейшие последствия нарушений функции гонад у осетровых недостаточно выяснены. Характеристики уровней стероидных гормонов в крови могут быть использованы как показатель, отражающий физиологическое состояние репродуктивной системы исследуемых рыб. Исследование уровней стероидных гормонов у рыб, по-разному отвечающих на гормональную инъекцию, даст дополнительные данные о механизмах гормональной регуляции созревания у рыб на заключительном этапе. Среди инъецированных самок осетра встречались особи, которые не созревали после гормональной инъекции, а также самки, икра которых была не способна к развитию (О %НРЭ). В связи с этим все самки осетра, которым вводили гормональные препараты, разделялись па три группы: 1) созрели, %ИРЭ 50; 2) созрели, %НРЭ = 0; 3) не созрели. Данные от каждой группы рыб рассматривались отдельно, в связи с тем, что у рыб разных биологических групп сроки выдерживания отличаются, а это может оказывать влияние на гормональные характеристики у рыб с нарушениями нормального хода созревания. Полученные результаты ИФЛ приведены в Таблицах 21-23. У не созревших рыб содержание гормонов определялось по истечению ожидаемого времени созревания. Самки ярового осетра. Несмотря на более «щадящие» условия, в которых находились самки ярового осетра, среди нормально созревающих особей были и не ответившие созреванием на гормональную стимуляцию, а также одна самка, давшая икру с 0 %НРЭ (табл. 21).
Зависимость гормонального статуса самок осетра после овуляции от типа гормонального препарата
Яровые формы осетра, на которых было основано осетроводство до середины 90-х годов, начинают нерестовую миграцию с близкими к зрелости гонадами и нерестятся обычно в нижнем течении рек. Сроки выдерживания яровых рыб в заводских условиях не превышают одного месяца. Как правило, такие особи хорошо отвечают на гормональную инъекцию (ГГП или сурфагон). Это наиболее подробно изученная группа рыб.
Нами было установлено, что для яровых самок и самцов осетра, созревших в результате гормональной стимуляции, характерны определенные уровни исследованных гормонов, которые мы рассматриваем как базовые (табл. 1Ы2). Близкие значения стероидных гормонов в сыворотке крови созревших самок и самцов других видов осетровых - севрюги и белуги отмечены в работах других авторов (Баранникова и др., 1999; Ссмснкова, Баюнова, 1998; Семенкова и др., 2000; Scmenkova et ah, 2001; 2002).
В отличие от яровых форм осетра, озимые группы и, особенно, озимый осетр летнего хода заходят в Волгу с далекими от зрелости гонадами (III или III-IV СЗ). Созревание озимого осетра происходило (до строительства каскада водохранилищ) весной следующего года в верхнем течении Волги после многомесячной анадромной миграции и зимовки (Лукин, 1949; Гербильский, 1957; Баранникова, 1975).
В настоящее время озимый осегр летнего хода потерял практически все нерестилища и нуждается в искусственном разведении на рыбоводных заводах, однако для завершения процессов гаметогенеза необходимо его длительное выдерживание в бассейнах или прудах. Условия содержания осетра на рыбоводных заводах (ироточность, температура воды и др.) отличаются от естественных, что отражается па процессах гаметогенеза и качестве зрелых половых клеток.
При заходе в реку у озимых и яровых мигрантов русского осетра в дельте Волги весной отсутствуют достоверные различия в содержании половых стероидов (Баранникова и др., 1997). Прерывание нерестовой миграции у осетровых, как показано рядом исследователей (Баранникова и др., 1990, 20006; Scmenkova et al., 1997; Семенкова, Баюнова, 1998), сопровождается снижением уровней кортизола и тестостерона в сыворотке крови. Несмотря на это, процессы гаметогеиеза у значительной части рыб после длительного выдерживания проходят нормально и завершаются получением зрелых половых клеток (Баранникова и др., 2001).
Определение уровней стероидных гормонов у интактных самцов озимого осетра после длительного содержания в условиях рыбоводных заводов (без гормональной стимуляции) показало, что для них характерны пониженные (р 0,001) уровни кортизола по сравнению с яровыми самцами.
У озимых самок осетра, созревших после введения ГГП, уровень кортизола был ниже по сравнению с яровыми самками, несмотря на то, что дозы вводимого гормонального препарата и условия эксперимента были одинаковыми. Та же закономерность наблюдалась ранее при сравнении концентрации кортизола у озимой и яровой белуги после созревания (Семенкова, Баюнова, 1998).
Различия в уровнях кортизола у рыб из разных биологических групп можно объяснить проявлением стрессорной реакции на содержание в неволе. Известно, что при остром стрессе происходит быстрое увеличение концентрации кортизола в сыворотке крови. Хроническое воздействие неблагоприятных факторов, в том числе и длительная задержка осетра перед плотиной Волжской ГЭС, наоборот, сопровождается снижением уровня кортизола в циркуляции (Pickering et al., 1987; Pickering, 1989; Баранникова и др., 1990; Semenkova et al., 1997, 1999).
Представляют интерес данные и по другим гормонам. Было выяснено, что у интактных самцов озимого осетра помимо пониженных концентраций кортизола наблюдалось и достоверно более низкое содержание 11-кетотестостерона (р 0,05) в сыворотке крови по сравнению с яровыми самцами. После спермиации подобные различия между озимыми и яровыми самцами были отмечены в отношении тестостерона (р 0,05).
Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемые закономерности в содержании стероидных гормонов у осетров из разных биологических групп возникли под влиянием длительного выдерживания рыб озимой формы в искусственных условиях. Еще одним подтверждением влияния длительного выдерживания могут служить наши данные о снижении гонадотропної! активности гипофизов у созревших самок озимого осетра по сравнению с яровым осетром (табл. 13).
Несмотря на влияние длительного выдерживания на гормональный статус озимого осетра в целом уровни исследованных стероидов в сыворотке крови остаются в пределах физиологической нормы. Это подтверждается тем, что ооциты у озимых самок весной достигают дефинитивных размеров, которые не отличаются от таковых у яровых форм (гл. 3.2.1.1), а также успешным получением от этих рыб зрелых половых клеток. Гистологический анализ гипофизов у самок озимого осетра летнего периода хода также указывает па его нормальное функционирование (гл. 3.2.1.2). К концу выдерживания гипофизы этих рыб находятся в таком же состоянии, как и у особей из естественных мест обитания перед нерестом. Таким образом, можно считать, что даже при длительном прерывании естественного хода анадромной миграции (у озимого осетра летнего хода) у значительной части особей возможно нормальное функционирование органов воспроизводительной системы, что позволяет использовать этих рыб для искусственного воспроизводства после выдерживания в бассейнах рыбоводных заводов в течение І 0-11 месяцев.
Таким образом, нами показано, что изменения уровней стероидных гормонов в крови осетров различных биологических групп на завершающих этапах созревания в искусственных условиях проходят по единой схеме. Это свидетельствует о способности озимого осетра летнего хода к сохранению нормальной репродуктивной функции, несмотря на прерывание нерестовой миграции. Полученные данные можно рассматривать как подтверждение теории проф. Н.Л. Гербильского (1962, 1967) о высокой адаптационной пластичности русского осетра.
