Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Биология, молекулярная эволюция и филогения осетровых рыб 8
1.1.1. Происхождение и разнообразие 8
1.1.2. Осетровые рыбы Амура 9
1.1.3. Полиплоидия 15
1.1.4. Межвидовая гибридизация 19
1.1.5. Филогенетика и систематика 25
1.1.6. Популяционная генетика 38
1.1.7. Гены ядерной 188рДНК 49
1.2. Краткая характеристика используемых методов и маркеров 60
1.2.1. Полимеразная цепная реакция и RAPD-анализ 60
1.2.2. Секвестрование ДНК 65
ГЛАВА 2. Материалы и методы 68
2.1. Получение геномной ДНК 69
2.2. RAPD-PCR анализ 69
2.3. PCR-амплификация ШрДНК 70
2.4. Клонирование 18SpHHK 71
2.5. Секвенирование последовательности 18S рДНК 74
2.6. Статистический анализ молекулярных данных 2.6.1. Обработка RAPD-данных 75
2.6.2. Обработка данных секвенирования 18S рДНК 78
2.6.3. Филогенетические реконструкции 81
2.6.4. Многомерное шкалирование (MDS) 83
2.6.5. Тесты для пседогенов 84
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 90
3.1. Генетическое разнообразие и таксономическая идентификация осетровых рыб по данным изменчивости мультилокусных RAPD-маркеров з
3.1.1. Молекулярная идентификация и особенности генетического разнообразия межвидовых гибридов амурского осетра, полученных при искусственном скрещивании 91
3.1.2. Дискриминация межвидовых гибридов в природных популяциях осетровых рыб Амура 101
3.2. Молекулярная эволюция, генетическое разнообразие и филогенетические связи 18S рДНК 114
3.2.1. Генетическое разнообразие последовательностей 18S рДНК амурского осетра и калуги 116
3.2.2. Разнообразие последовательностей 18S рДНК у гибридов осетровых рыб 123
3.2.3. Филогенетический анализ 486 пн последовательностей 18S рДНК осетровых рыб: гены и псевдогены? 131
3.2.5. Филогенетические связи амурского осетра по данным полной последовательности 18S рДНК 149
Заключение 158
Выводы : 161
Список литературы
- Происхождение и разнообразие
- PCR-амплификация ШрДНК
- Молекулярная идентификация и особенности генетического разнообразия межвидовых гибридов амурского осетра, полученных при искусственном скрещивании
- Филогенетический анализ 486 пн последовательностей 18S рДНК осетровых рыб: гены и псевдогены?
Введение к работе
Актуальность проблемы. Отряд Acipenseriformes (осетры и веслоносы) - древняя группа рыб, ведущая свое происхождение из Юрского Периода (Grande, Bemis, 1991). Осетры и их ближайшие филогенетические родственники веслоносы считаются живыми ископаемыми, поскольку за последние 200 млн лет своего существования они не подверглись крупным морфологическим изменениям (Gardiner, 1984). Широкое использование этой группы в коммерческих целях привело к масштабному вылову осетровых, что отразилось на значительном уменьшении их численности. В настоящее время все представители рода Acipenser включены в списки Международной конвенции по редким видам (CITES). Генетические исследования обнаружили, что кариотипическая эволюция осетровых рыб сопровождалась ограниченным числом изменений в хромосомах (Birstein et al., 1997). Скорость молекулярной эволюции осетров на уровне белков, последовательностей митохондриальной и ядерной ДНК тоже оказалась пониженной (Brown et al., 1996; Birstein et al., 1997), что ассоциируется с недавней дивергенцией этой группы (Choundhury, Dick, 1998). Недавнее открытие у видов Acipenser (Krieger, Fuerst, 2002, 2004; Krieger et al., 2006) множественных копий ядерного гена 18S рРНК делает осетров уникальной группой среди позвоночных. Все осетровые являются полиплоидами (4w-8w-16w) и обладают большим (120-500) числом хромосом (Birstein et al., 1993; Blacklidge, Bidwell, 1993). Эти факторы, возможно, явились причиной относительно простой межвидовой и межродовой гибридизации, усугубляемой перекрытием зон нереста. Гибридизация делает систематику Acipenseridae весьма запутанной (Birstein, 2002). Статус редких видов, высокий эволюционный возраст, особенности морфологической и молекулярной эволюции делают эту группу особенно привлекательной для всестороннего изучения, и прежде всего - для ее сохранения в природе во всем генетическом разнообразии.
Цель и задачи исследования. Цель работы - исследование особенностей молекулярной эволюции и механизмов формирования генетического разнообразия у амурского осетра, калуги и их гибридов как основы сохранения генофонда аборигенных видов. Основные задачи исследования:
Дать оценку генетического разнообразия осетровых рыб Амура из природных популяций и полученных при искусственном разведении, включая межвидовые гибриды, с помощью мультилокусных RAPD-PCR-маркеров;
Клонировать и секвенировать участок гена 18S рРНК амурского осетра, калуги и межвидовых гибридов (A. schrenckii х A. baerii и A. schrenckii х Н. dauricus), а также полную последовательность 18S рДНК амурского осетра;
3. Провести детальный анализ полиморфизма, дивергенции, функциональной
значимости и филогенетических связей клонированного участка гена 18S рРНК осетровых
рыб Амура и их гибридов;
4. По результатам секвенирования полной последовательности 18S рДНК амурского
осетра и данным из Genbank провести анализ филогенетических связей амурского осетра с
другими видами осетровых рыб.
Научная новизна. Практически все полученные в работе результаты являются новыми и приоритетными. Впервые выполнено сравнительное исследование генетической изменчивости двух видов осетровых рыб из природных популяций Амура; дан анализ особенностей наследования RAPD-локусов в Fi генерации межвидовых гибридов: геномы
гибридов содержат часть признаков обоих родителей, а также гибрид-специфичные локусы, отсутствующие в геномах родительских видов; наследование некоторых признаков зависит от направления скрещивания. Впервые клонирована и секвенирована полная последовательность ядерного гена 18S рРНК амурского осетра, проведены ее структурно-функциональный и филогенетический анализы. Впервые клонированы и секвенированы 486 пн участки 18S рДНК амурского осетра, калуги, гибридов амурского осетра с калугой и с сибирским осетром. Показаны множественность аллелей этих генов у дальневосточных видов осетровых рыб и повышение генетического разнообразия рДНК при межвидовой гибридизации. Доказано существование среди аллельных вариантов функциональных последовательностей 18S рДНК и последовательностей, эволюционирующих под ослабленным селективным давлением. Даны высокие оценки шанса выживания осетровых рыб Амура, при условии отсутствия антропогенного пресса; обнаружение в природных популяциях межвидовых гибридов рассматривается как один из факторов риска. RAPD маркеры признаны полезными для генетического мониторинга природных популяций осетровых рыб Амура в целях сохранения их генофонда.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты важны для понимания общих закономерностей формирования гибридного генома, эволюционной судьбы дуплицированных генов, а также механизмов генерирования и поддержания генетического разнообразия у полиплоидных видов животных в целом. Уточнение филогенетических связей осетров Амура является вкладом в разработку систематики и филогении Acipenseriformes. Поскольку осетры имеют большой экономический интерес, молекулярные данные могут быть использованы для сертификации коммерческих продуктов. В связи со статусом редких видов, данные об особенностях генетического разнообразия осетров Амура крайне необходимы для разработки эффективных мер по их сохранению и рациональному природопользованию.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 статьей в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 209 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 54 рисунками. Список литературы включает 316 наименований, из них 276 на иностранных языках.
Происхождение и разнообразие
Интересной особенностью кариологической эволюции осетровых является полиплоидия. В первичных данных число хромосом, полученное на метафазных пластинках клеток на стадии 60 бластомеров и клеток жаберного эпителия Н. huso и A. ruthenus, было оценено в 60 (2/7=60) (цит по: Fontana et al., 2001). Однако используемые в то время методы не позволяли идентифицировать мелкие хромосомы. Более достоверные данные были получены Оно с сотрудниками (Ohno et al., 1969) из давленных препаратов соматических тканей Scaphirhynchus platorynchus. Их исследования показали, что диплоидный набор осетровых равен 112 хромосомам, из них 48 — микрохромосомы. Высокое число хромосом позволило авторам выдвинуть гипотезу, что S. platorynchus является тетраплоидом. Они были уверены, что их гипотеза может быть подтверждена путем открытия видов с 60 хромосомами. Динджеркус и Хауэлл (Dingerkus, Howell, 1976) обнаружили в некоторых тканях веслоноса (Polyodon spathuld) клетки с 2«=120, из которых 72 были точечными микрохромосомами. Объединяя хромосомы в группы по четыре, авторы сделали вывод, что этот вид является тетраплоидом. Однако пока не были доступны специфические хромосомные маркеры, достоверность этого вывода была низкой, так как микрохромосомы могут быть сгруппированы различными способами. Если 120-хромосомные виды считать тетрашгоидами, то 240-хромосомные виды должны считаться октаплоидами. Эти данные были поддержаны многими исследователями (см: Васильев, 1985; Birstein, Vasil ev, 1987; Birstein, et al., 1997b; Birstein, DeSalle, 1998; Flajshans, Vajcova, 2000). Арефьев (1983) был единственным, кто выразил сомнения в тетраплоидном происхождении 120-хромосомных видов. Доказательство диплоидности 120-хромосомных видов было впоследствии предоставлено Фонтана (Fontana, 1994).
Внести ясность в этот вопрос помогло изучение количества ядерной ДНК. Еще в 1951 году Мирский и Рис, а затем, в 1957 году, Виалли (цит. по: Fontana, 2001) методом гистофотометрии определили, что количество ядерной ДНК у A. sturio равно 3.2 пикограмма на ядро (пг/я). В 1969 году Оно, используя этот же метод, установил, что количество ядерной ДНК у S. platorhynchus равно 3.6 пг/я. Эти цифры оказались выше, чем у других костистых рыб, количество ядерной ДНК у которых составляет около 1.7 пг/я (Bachmann et al., 1972). На основе этих данных Оно с соавторами(Оппо et al, 1969) предположили, что S. platorhynchus мог быть тетраплоидом. Фонтана (Fontana, 2001) показал, что количество ядерной ДНК A. naccarii (6.26 пг/я) в два раза превышает таковое у Н. huso (3.60 пг/я) и A. sturio (3.58 пг/я), предположив на этом основании, что A. naccarii являлся тетраплоидом, а два других вида - диплоидами.
Используя метод проточной цитометрии, Блэклидж и Бидуэлл (Blacklidge, Bidwell, 1993) определили количество ДНК у 7 видов осетров из Северной Америки; Бирштейн с соавторами (Birstein et al., 1993b) провели аналогичный анализ для 8 видов осетров с территории бывшего Советского Союза. В итоге, исключив различия в количестве ДНК, обусловленные разными методами определения, эти авторы разделили осетров по уровню плоидности на три группы. Доказав что 120-хромосомные осетры — это тетраплоиды, они выделили три группы видов: с An, &п и \6п. Для последней группы они обозначили количество хромосом равным около 500, приводя в качестве примера сахалинского осетра (A. mikadoi).
Возможными причинами феномена полиплоидии осетровых рыб являются спонтанная полиплоидизация и гибридизация (Blacklidge, Bidwell, 1993). Согласно данным Арефьева (Arefjev, 1989), в природных условиях различные виды осетровых рыб могут гибридизовать и давать плодовитое потомство. Убедительным доказательством полиплоидизации является обнаружение методом проточной цитометрии триплоидных (377) особей г озерного {Acipenser fulvescens) и заливного (Acipenser oxyrinchus desotoi) осетров (Blacklidge, Bidwell, 1993).
Аналогичные результаты были получены при окраске ядрышкообразующих регионов (ЯОР) хромосом осетровых рыб (Birstein, Vasiliev, 1987; Fontana, 1994). Области ЯОР - это места расположения сайтов рибосомной ДНК, их можно выявить окраской серебром; серебро окрашивает кислые белки, которые в интерфазе ассоциируют с ЯОР во время транскрипции генов рРНК. Выявление ЯОР таким способом свидетельствует, прежде всего, об их транскрипционной активности (Schwarzacher et al., 1978). Эта методика использовалась для исследования эволюции кариотипа осетровых рыб (Birstein, Vasiliev, 1987; Fontana, 1994), а высокое (4-13) количество ЯОР (активных сайтов рДНК), наряду с большим числом хромосом, обнаруженных у исследованных видов осетровых, говорит в пользу полиплоидизации. Если бы размер генома этой группы рыб увеличился в результате эндорепликации, количество хромосом, равно как и количество ядрышек, осталось бы прежним, а ядрышки могли бы увеличиться в размерах (Birstein, Vasiliev, 1987).
Доказательства факта полиплоидизации в эволюции осетровых рыб, а также того, что количество ДЫК у 120-хромосомных видов примерно в два раза больше, чем минимальное количество ДЬЖ у позвоночных, позволили предположить, что в данной группе имела место еще одна тетраплоидизация, до разделения на мало- и многохромосомные виды, при этом диплоидные предки 120-хромосомных осетрообразньтх вымерли (Васильев, 1985). Тетраплоидное происхождение было доказано для веслоноса P. spathiila (Dingerkus, Howell, 1976) и шипа ,4. midiventris (Арефьев, 1983).
Таким образом, в эволюции осетровых рыб произошли две последовательные тетраплоидизации. И если первую можно только предполагать, хотя и с большой вероятностью, то вторую можно считать доказанной. Первая тетраплоидизация, если она имела место, произошла еще до расхождения семейств Acipenseridae и Polyodontidae от их общего, уже тетраплоидного предка (Васильев, 1985). Изучение ископаемых остатков дает основания полагать, что первая тетраплоидизация произошла не позднее верхнего Мела (около 80 млн. лет назад) (Васильев, 1985). С другой стороны, поскольку осетровые населяют водоемы Старого и Нового Света в пределах умеренных широт, и многие из них являются строго пресноводными, есть основания предполагать, что первая тетраплоидизация произошла в верхнем Меле, не позднее отделения Северной Америки от Европы (Васильев, 1985). Карлсон с сотрудниками (по: Васильев, 1985) на основании данных по 35 электрофоретическим локусам, из которых только два оказались дуплицированными, делают вывод, что первая тетраплоидизация произошла около 300 млн. лет назад, т.е. на уровне семейства Chondrosteidae (первые находки датируются нижним Лиасом, около 200 млн. лет назад (Васильев, 1985)) или на уровне предков этого семейства.
Время второй тетраплоидизации установить труднее из-за недостатка данных по кариотипам некоторых видов осетров. На основании исследования гемоглобинограмм Гераскин делит осетровых на две группы: стерлядь, шип, белуга и калуга составляют первую группу, а русский, ленская популяция сибирского осетра, амурский и озерный осетры - вторую (по: Васильев, 1985). Количество хромосом у второй группы видов приблизительно в два раза выше, чем у первой. Хотя кариотип озерного осетра не изучен, если данные о кариологии и результаты исследования гемоглобина осетров совпадают, есть все основания отнести A. fulvescens ко второй группе. Это, в свою очередь, дает основания предполагать наличие среди осетровых Нового Света видов, произошедших от предка с вторично тетраплоидным кариотипом. Из этого можно заключить, что вторая тетраплоидизация произошла не позднее разделения Старого и Нового Света. Также нельзя исключать, что она могла произойти позже у формы, населявшей водоемы Азии и Европы, а затем, 58-37 млн. лет назад, проникшей в Северную Америку; разделение родов Huso и Acipenser, по палеонтологическим данным, датируется 10 млн. лет назад (Васильев, 1985).
На основании данных по кариологии и искусственной гибридизации Николюкиным был впервые поднят вопрос о правомерности выделения рода Huso из рода Acipenser (по: Васильев, 1985). Цитогенетические данные проводят границу не между этими двумя родами, а между мало- и многохромосомными видами. Поэтому, согласно изложеному выше, филогенетическая схема осетровых рыб может быть представлена следующим образом (рис. 3). Из этой схемы следует, что самостоятельность рода Huso можно признать только в том случае, если темпы его эволюции превышали темпы эволюции многохромосомных видов, а оснований для этого нет (Васильев, 1985). Поэтому автором предлагается считать, что все виды подсемейства Acipenserinae принадлежат к роду Acipenser с двумя основными группами — много- и малохромосомные виды. Последний состоит из двух подгрупп: род Huso и 120-хромосомные виды рода Acipenser. При этом две разнохромосомные группы можно возвести в ранг родов, причем малохромосомный род будет состоять из двух групп.
PCR-амплификация ШрДНК
Филогенетические реконструкции по данным RAPD-PCR-анализа и секвенирования выполняли с помощью методов ближайшего связывания NJ (Saitou and Nei, 1987), невзвешенного попарно-группового метода UPGMA (Sneath and Sokal, 1973), минимальных связей MST (Rohlf, 1973), минимальной эволюции ME (Minimum Evolution) (Rzhetsky, Nei 1992), максимальной парсимонии MP (Maximum Parsimony) (Felsenstein, 1982; Swofford et al, 1996) и максимального правдоподобия ML (Maximum Likelihood) (Felsenstein, 1982). Для оценки достоверности каждого ветвления в филогенетических реконструкциях использовали бутстреп-анализ (bootstrap analysis) (Felsenstein, 1985) при 1000 репликациях для методов UPGMA, NJ и ME и при 100 репликациях для MP и ML.
Алгоритм филогенетического древа MST основан на математической теории графов. Суть алгоритма заключается в построении мультиреберной структуры на основе теоретически ожидаемой минимальной структуры (подграфа), к которому постепенно в процессе построения древа добавляется одна новая ветвь с минимальным весом (дистанцией между парой объектов). Новая ветвь выбирается так, чтобы не нарушить исходную структуру реконструкции. В нашей работе реконструкция древа MST проводилась в программе Arlequin 3.11, где используется алгоритм Крускала с модификацией Рольфа (Rohlf, 1973). Считается, что топология древа, подобная MST, позволяет оценить межпопуляционные связи внутри вида более точно, чем традиционные кластерные методы, так как последние направлены в основном на оценку межвидовых филогенетических связей (Crandall, Templeton, 1996).
Метод минимальной эволюции (ME). Дерево, построенное с помощью этого алгоритма, отображает наименьшие значения суммы всех ветвей (S). Параметр S выявляется для всех возможных топологий, затем осуществляется поиск наиболее оптимальной топологии, отображающей наименьшее значение S. Количество возможных топологий резко увеличивается с увеличением количества таксонов. При большом количестве таксонов топология ME сходна с топологией NJ. Аналогичная зависимость наблюдается при разном количестве признаков (число пар нуклеотидов в исследуемом участке ДНК). Топология ME более корректна при использовании длинных последовательностей ДНК; для коротких последовательностей более пригоден алгоритм NJ (Kumar et al., 2004).
Метод максимальной парсимонии (MP) оптимизирует поиск наилучшей топологии по минимальной сумме эволюционных событий (мутационных шагов или изменений состояния признаков) и базируется на филогенетически информативных позициях (изменчивость по таким сайтам среди исследуемого набора последовательностей позволяет различить две разные топологии). Данный метод направлен на реконструкцию эволюционных отношений по принципу родства, а не сходства, в отличие, например, от дистантных методов. Серьезным недостатком данного подхода является невозможность учета неравномерности хода эволюции, а также неустойчивость в отношении параллельных и обратных замен.
Метод максимального правдоподобия (ML) является одним из приемов статистической проверки гипотез. При использовании этого метода задается вероятностная модель замены нуклеотидов, ряд параметров может быть оценен непосредственно в ходе анализа набора данных. На основе заданной модели рассчитываются значения функции правдоподобия всех возможных древ, отвечающих исследуемому набору признаков, наилучшее из которых имеет максимальное значение функции правдоподобия. Этот расчет проводит оценку длин ветвей при условии найденной топологии таким образом, чтобы значение функции правдоподобия было наибольшим. Преимуществом является возможность учета самых разнообразных факторов эволюционного процесса. Данный алгоритм поиска топологии наиболее устойчив к неравенству скоростей в линиях и разнообразию типов нуклеотидных замен.
Достоверность всех полученных реконструкций проверяли методом бутстреп-анализа. Суть метода заключается в том, что на основе имеющегося набора последовательностей формируют псевдовыборки, в которых одни нуклеотиды случайным образом удаляются, другие, наоборот, дублируются. Для каждой псевдовыборки из 500-1000 таких реплик строится филогенетическое древо, затем формируется одно — консенсусное древо. Для каждого узла рассчитывается бутстреп-индекс, показывающий, какой процент промежуточных древ его содержат. Показатели бутстрепа можно интерпретировать как оценку мощности филогенетического сигнала, поскольку они будут тем выше, чем больше число замен поддерживает данное ветвление.
Основной целью метода MDS является поиск и интерпретация латентных (т.е. непосредственно не наблюдаемых) переменных, дающих возможность пользователю объяснить сходства между объектами, заданными точками в исходном пространстве признаков (Боровиков, 2004). Многомерное шкалирование — это способ наиболее эффективного размещения объектов, приближенно сохраняющий наблюдаемые между ними расстояния. Другими словами, MDS размещает объекты в пространстве заданной размерности и проверяет, насколько точно полученная конфигурация сохраняет расстояния между объектами. Особенность метода MDS в том, что он позволяет анализировать как матрицы коэффициентов корреляции, так и произвольный тип матрицы расстояний или сходства. Таким образом, на входе всех алгоритмов MDS используется матрица, элемент которой на пересечении ее z-й строки и у -го столбца, содержит сведения о попарном сходстве анализируемых объектов (объекта / и объекта j). На выходе алгоритма MDS получаются числовые значения координат, которые приписываются каждому объекту в некоторой новой системе координат (во "вспомогательных шкалах", связанных с латентными переменными, откуда и название "многомерное шкалирование"), причем размерность нового пространства признаков существенно меньше размерности исходного. В общем случае метод MDS позволяет таким образом расположить объекты в пространстве некоторой небольшой размерности (двух или трехмерной), чтобы достаточно адекватно воспроизвести наблюдаемые расстояния между ними. В результате можно "измерить" эти расстояния в терминах найденных латентных переменных. В нашей работе метод многомерного шкалирования позволяет отобразить в трехмерном пространстве дифференциацию общей выборки на группы, используя матрицу попарных генетических дистанций Нея (Nei, 1972).
Молекулярная идентификация и особенности генетического разнообразия межвидовых гибридов амурского осетра, полученных при искусственном скрещивании
Куаттро с соавторами (Quattro et al., 2001), отметили тот факт, что для видов с ограниченным распространением и/или физическими барьерами (что часто встречается у пресноводных видов), существенная доля генетического разнообразия может быть распределена между отдельными локациями, в зависимости от времени, прошедшего с момента колонизации и изоляции. К такой категории видов принадлежат и осетровые рыбы. Среди ихтиологов существует мнение, что в р. Амур имеется четыре популяции амурского осетра, обитающие на определенных участках реки (Крыхтин, Горбач, 1994; Krykhtin, Svirskii, 1997). И хотя исследованные нами образцы (за исключением гибридов) выловлены на одном и том же участке р. Амур, генетически они, как показали MST реконструкции (см. рис. 16), структурированы. Нельзя исключить, что в выборку попали представители разных пространственных группировок, совершающих в этот период на данном участке реки нерестовую миграцию. В любом случае, генетическая подразделенность вида вообще, и амурского осетра в частности, повышает его шансы на выживание. Локальные адаптации уникальны и консервативны, их формирование происходит в ряду многих поколений под действием естественного отбора и среды, с которой связана естественная история популяций, поэтому их сохранение необходимо для выживания вида и сохранения его генофонда во всем многообразии (Waples е al., 2001).
Появление фенотипических гибридов (предположительно между А. schrenckii и Н. dauricus) в природной популяции амурских осетров, вероятнее всего, является следствием искусственного воспроизводства, осуществляемого рыбоводными заводами КНР. В аквакультуре этой страны отдается предпочтение гибридам ввиду их высокой, по сравнению с родительскими видами, продуктивности. Специалистами Хф ТРШРО-Центра в 2005 и 2006 гг. зафиксированы факты выпуска в р. Амур с рыбоводного завода в г. Фуюань (КНР) особей гибридного происхождения вместо "чистых" видов. В условиях очень низкой численности молоди естественного происхождения на данном участке Амура, выпуск гибридной молоди крупного размера и отличающейся высокой выживаемостью, на наш взгляд, следует рассматривать как фактор риска для природных популяций осетровых рыб. Так, в 2005 году среди 1802 разновозрастных экземпляров амурских осетровых рыб, отловленных в ходе научно-исследовательского лова, по морфологическим признакам были идентифицированы как гибриды 12 особей (в том числе 10 половозрелых), что в целом для бассейна Амура составляет 0.66% особей. В то же время, по результатам учета численности молоди на 60 км участке Амура возле г. Хабаровск доля гибридов в октябре 2005 года составила 66.6%. Известно, что ежегодно рыбы из рыбоводных хозяйств проникают в нативные популяции конспецифичных или близкородственных видов. Например, в некоторых реках Норвегии число рыб фермерского происхождения превышает численность рыб из природных популяций (Heggberget et al., 1993). Генетические последствия подобных инвазий могут быть самыми разнообразными. Искусственное разведение приводит к накоплению редких аллелей, которые неизбежно будут внесены в генофонд природных популяций, снизив тем самым общее генетическое разнообразие (так называемый эффект Раймана-Лайкре) (Ryman, Laikre, 1991). К негативным генетическим эффектам можно отнести также гибридизацию со случайно интродуцированными особями, приводящую к разрушению локально адаптированных генных комплексов из-за аутбредной депрессии. В результате нарушается воспроизводство видовых генофондов, усиливаются деструктивные процессы в популяциях с нарушением исторически сложившегося оптимального для вида соотношения внутри- и межпопуляционной компонент генного разнообразия, необходимых для поддержания структурированности вида (Altukhov, Salmenkova, 1994; Алтухов и др., 1997). Хотя нами идентифицировано всего 2 гибрида из 46 исследованных природных особей осетров, что составляет около 4% выборки, мы пока не можем дать корректную оценку уровня разбавления генофонда природных популяций осетровых рыб Амура их межвидовыми гибридами. Для этого (что ясно следует из ихтиологических наблюдений, см. выше) необходимо исследование популяционных выборок из разных участков реки. Однако сам факт обнаружения гибридных особей в условиях роста на территории КНР количества рыбоводных хозяйств нельзя недооценивать, такая ситуация представляет реальную угрозу для реализации стратегии выживания аборигенных популяций осетровых видов рыб. В мировой практике этой проблеме уделяется большое внимание. Так, уже неоднократно обсуждался вопрос о реинтродукции искусственно полученных особей в природную среду в связи с необходимостью восстановления численности редких видов (Binkowski, Doroshov, 1985; Waldman, Wirgin, 1998), но, к сожалению, единого мнения так и не найдено (Stockwell et al., 1996; Utter, 1998; Waples, 1999). Вместе с тем, получены достоверные данные о том, что виды интродуценты (в том числе случайные) в некоторых случаях могут полностью вытеснить аборигенные популяции (Панов, 1989; Heggberget et al., 1993; Altukhov et al., 2000). Наши данные о генных потоках {Nm = 1-5) свидетельствуют, что в зависимости от обстоятельств между сравниваемыми таксонами и гибридами могут преобладать дифференцирующие (дрейф генов) или интегрирующие (поток генов) процессы, и это обстоятельство можно рассматривать, как повышающее фактор риска природных популяций осетровых рыб Амура.
Филогенетический анализ 486 пн последовательностей 18S рДНК осетровых рыб: гены и псевдогены?
Настоящее исследование включает RAPD-PCR анализ выборки из 46 особей природных популяций осетровых рыб Амура, а также 70 сеголеток, полученных в результате семи индивидуальных скрещиваний (внутри и между видами, включая разные роды) на базе научно-исследовательской станции ТИНРО-центра, основанный на данных по 173 и 252 локусам, соответственно; клонирование, секвенирование, структурно функциональный и филогенетический анализы 110 участков 18S рДНК (размером 486 пн) амурского осетра, калуги и гибридов амурского осетра с калугой и сибирским осетром; а также определение полной (1746 пн) последовательности 18S рДНК амурского осетра (7 клонов) и реконструкции ее филогенетических связей с аналогичными участками родственных и филогенетически более далеких видов.
Согласно RAPD данным, аборигенные популяции амурского осетра Acipenser schrenckii и калуги Huso daiiricus, ранее генетическими методами не изучавшиеся, сохранили достаточно высокий уровень генетического разнообразия, намного превышающий таковой в выборках, полученных при искусственном разведении (вероятнее всего, вследствие использования ограниченного числа производителей). Вместе с тем, получены генетические свидетельства гибридного происхождения двух особей (фенотипических гибридов); наличие гибридов в природных популяциях Acipenseridae расценивается как один из факторов риска.
Для каждого из 4 сравниваемых видов осетровых рыб (амурский и сибирский осетры, стерлядь и калуга) выявлены таксон специфичные RAPD маркеры. Диагностические фрагменты для гибридных особей первой генерации не обнаружены, но для них выделены некоторые особенности RAPD спектров: сохранение в одном геноме маркерных фрагментов ДНК обоих родителей (1), наличие специфичных фрагментов ДНК, отсутствующих у родителей (2), и зависимость частоты встречаемости некоторых фрагментов ДНК от направления скрещиваний (3). Если две первые особенности достаточно широко обсуждаются в литературных источниках, третья упоминается лишь в единичных исследованиях искусственных популяций лососевых рыб, что заслуживает особого внимания и дальнейшего исследования.
Статистические методы по данным изменчивости RAPD спектров отчетливо разделяют особей исходных видов и Fi гибридное потомство с дифференциацией на группы с разным направлением скрещивания. В природной популяции для дискриминации видов и гибридов наиболее эффективными оказались точный тест на дифференциацию популяций и многомерное шкалирование. Таким образом, мультилокусные RAPD-PCR маркеры могут служить удобным и надежным инструментом для проведения генетического мониторинга популяций амурских осетровых рыб с целью сохранения их генофонда, а также использоваться для видовой идентификации коммерческих продуктов.
Феномен множественности аллелей 18S рДНК, свидетельствующий о неполной реализации механизмов согласованной эволюции, был недавно обнаружен у североамериканского вида A. fulvescens. Проведенные нами исследования позволили не только выявить в геномах осетровых рыб Амура множественные варианты 18S рДНК, но впервые получить доказательства того, что они (при минимальных межвидовых отличиях характера распределения нуклеотидного разнообразия) подвергаются разным эволюционным ограничениям, предполагающим высокую вероятность наличия среди изученных копий как генных, так и псевдогенных последовательностей. Основной ролью псевдогенизации, по крайней мере, у осетровых рыб, очевидно, является улучшение свойств функциональной последовательности.
Впервые получены генетические свидетельства снижения эффективности механизмов согласованной эволюции 18S рДНК в геномах осетровых рыб при высоких потоках генов, обусловленных гибридизацией, которые выражаются в существенном повышении общего генетического разнообразия последовательностей данного семейства у гибридов, включая появление гибрид-специфичных мутаций, а также "сглаживание" различий между генами и псевдогенами. Такой результат, может быть, прежде всего, обусловлен взаимодействиями (генные конверсии и рекомбинации) между локусами с последовательностями рДНК различной функциональной значимости, индуцированными межвидовой/межродовой гибридизацией. Выявленные особенности молекулярной эволюции рДНК осетровых рыб, их высокое разнообразие на молекулярном уровне, очевидно, дают эволюционное преимущество, помогая видам более успешно адаптироваться к изменениям внешней среды.
Структурно-функциональный и филогенетический анализы полной последовательности 18S рДНК амурского осетра, выполненные впервые, позволили выявить видоспецифичные мутации A. schrenckii, а также выделить среди изученных клонов предположительно функциональные последовательности. Филогенетический анализ генов 18S рРНК с привлечением имеющихся к настоящему времени данных из GenBank (по А. fulvescens, A. sturio и A. ruthenus) с высокой вероятностью разделил евразийские виды осетровых рыб с североамериканским озерным осетром и указал на высокую филогенетическую близость амурского осетра со стерлядью.
Таким образом, в настоящей работе получены новые данные о характере генетического разнообразия осетровых рыб и механизмах, генерирующих это разнообразие, имеющие научный и практический интерес. Дальнейшее изучение механизмов согласованной эволюции рДНК (включая их нарушение при межвидовом скрещивании) и филогенетических связей между видами осетровых рыб по данным полной последовательности гена 18S рРНК представляется нам наиболее перспективными и актуальными направлениями исследований.
