Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на биологические объекты 11
1.2. Биологический и терапевтический эффекты НИЛИ 20
1.3. Биохимические последствия окислительного стресса в живых системах 31
1.4. Генетические последствия окислительного стресса в живых системах 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Постановка эксперимента .54
2.2. Получение биологического материала 55
2.2.1. Получение плазмы крови 55
2.2.2. Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизатов 55
2.2.3. Приготовление гомогенатов тканей 55
2.3. Биохимические и биофизические методы исследования 55
2.3.1. Хемилюминесцентный анализ 55
а) Измерительная аппаратура 55
б) Определение активности хемилюминесценции плазмы крови в системе НгОг-люминол 56
в) Определение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови 57
2.3.2. Определение содержания диеновых конъюгатов 57
2.3.3. Определение содержания шиффовых оснований ..59
2.3.4. Определение содержание малонового диальдегида 59
2.3.5. Определение содержания белка ...60
2.3.6. Определение активности супероксиддисмутазы 60
2.3.7. Определение активности каталазы 61
2.3.8. Определение концентрации гемоглобина 62
2.3.9. Определение оксидазной активности церулоплазмина 62
2.3.10. Определение суммарной пероксидазной активности (СПА) 63
2.3.11. Определение содержания внеэритроцитарного гемоглобина...63
2.3.12. Определение содержания мол екул средней массы 64
2.3.13. Определение концентрации мочевины 65
2.3.14. Определение эффективности безызлучательного переноса энергии с остатков триптофана мембранных белков на пирен..65
2.3.15. Определение относительной микровязкости липидного бислоя
и микровязкости зон белок-липидных контактов мембран 66
2.3.16. Определение полярности липидной фазы и зон белок-липидных
контактов мембран ; 67
2.4. Генетические методы исследования 67
2.4.1. Приготовление препаратов для подсчета анафаз в клетках костного мозга крыс 67
2.4.2. Приготовление препаратов для подсчета анафаз в эпителиоцитах роговицы глаз крыс 68
2.4.3. Изучение генотоксичности тканей с помощью SOS-lux теста...68
2.5. Определение лейкоцитарной формулы крови 69
2.6. Статистическая обработка результатов исследования 69
ГЛАВА 3. Результаты исследования 71
3.1. Влияние инфракрасного низкоинтенсивного лазерного излучения (ИНИЛИ) на Н20г-люминолзависимуюхемшіюмииесце}щшо в различных: тканях крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе 71
3.2. Влияние ИНИЛИ на интенсивность перекисного окисления липидое (ПОЛ) и активность антиоксидантно и системы в различных тканях крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе 80
3.3. Влияние ИНИЛИ на структурное состояние мембран эритроцитов крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе 94
3.4. Влияние ИНИЛИ на показатели эндогенной интоксикации в крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе 104
3.5. Влияние ГБО и ИНИЛИ на мутационный процесс в соматических тканях зісивотньїх 115
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 130
Выводы 150
Список литературы 152
- Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на биологические объекты
- Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизатов
- Определение содержания диеновых конъюгатов
- Влияние инфракрасного низкоинтенсивного лазерного излучения (ИНИЛИ) на Н20г-люминолзависимуюхемшіюмииесце}щшо в различных: тканях крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе
Введение к работе
Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), получившее в последнее десятилетие широкое применение в клинической практике в России, в странах СНГ и ряде других зарубежных стран, используется в медицине в двух основных направлениях: при фото динамической терапии (ФДТ) опухолей, где используется поражающий эффект НИЛИ (Dougherty, 1993; Соколов и др., 1995) и при лечении широкого круга различных воспалительных заболеваний (Илларионов, 1992; Козлов, 1997; Утц, Волнухин, 1998; Fujimaki е.а., 2003). Его позитивные клинические эффекты отмечены при лечении различных заболеваний и патологических процессов и подтверждены в контролируемых клинических исследованиях, в том числе с использованием двойного слепого метода (Cowen е.а., 1997; Bensadoun е.а., 1999; Hirschl е.а,, 2002).
При взаимодействии НИЛИ с организмом человека регистрируются разнообразные биологические эффекты. Вместе с тем многие аспекты, касающиеся механизмов биологического действия лазерного излучения в инфракрасном спектре, на сегодняшний день остаются неясными. В частности, не получил пока четкого освещения в литературе вопрос о механизме формирования стойких, длительно сохраняющихся структурно-функциональных изменений в органах и тканях после проведенного курса низкоинтенсивной инфракрасной (ИК) лазеротерапии. Однако многолетний врачебный опыт убеждает в том, что изменения, возникающие в биосистеме при ИК лазерном воздействии, в принципе могут сохраняться в течение длительного времени. Выяснилось, что при использовании инфракрасных лазеров с большой импульсной мощностью лечебный эффект бывает зачастую значительно лучше, чем при использовании красной области спектра, в том числе и гелий-неонового лазера. Для анализа механизма лечебного действия инфракрасного низкоинтенсивного лазерного облучения (ИКЛО) очень важно иметь экспериментальные доказательства схожести
7 эффектов действия ИКЛО и ГНЛО на клеточных и молекулярных моделях in vitro и in vivo.
Если оценивать общую направленность изменений, обеспечивающих положительный клинический эффект от ИНИЛИ, то можно отметить, с одной стороны, стимуляцию репаративных и адаптивных процессов, составляющих основу восстановления структуры и функции пораженной ткани, а с другой - повышение общей резистентности организма за счет стимуляции комплекса местных и системных саногенетических механизмов. При этом очевидно, что необходимым условием для реализации биостимулирующего эффекта НИЛИ (рост, размножение, дифференцировка, повышение функциональной активности) является активация механизмов, осуществляющих синтез и доставку пластических материалов и энергетическое обеспечение усиленной клеточной функции. Иными словами, в результате фотовоздействия на организм должен сформироваться стойкий структурный след в биоткани, основу которого составляет наработка новых белковых молекул (ферментов, структурных, транспортных, рецепторных и других), вследствие активации генетического аппарата клетки.
Положения, изложенные выше, являются теоретическим обоснованием возможности реализации ряда биоэффектов ИНИЛИ через вовлечение генетического аппарата клетки. Совершенно очевидно, что действие ИНИЛИ на живой организм может проявляться на разных уровнях его структурно-функциональной организации. Однако, поскольку усиление биологической функции и повышение мощности адаптивных систем требуют своего пластического обеспечения, особенно важным представляется взаимодействие лазерного излучения с первичной информационной системой клетки - ее геномом (Бриль, Панина, 2000).
Электромагнитная природа НИЛИ предполагает возможность его взаимодействия со множеством регуляторных механизмов в живых системах. Важнейшей регуляторной системой организма является система свободнорадикальных процессов (СРП). С ней связаны такие биологические
8 явления, как окислительное фосфорилирование в митохондриях, генерация и проведение нервного импульса, клеточное деление, синтез ряда гормонов, механизмы регуляции мембранной проницаемости и активности мембранных ферментов (Владимиров, 1989).
Действие ИНИЛИ на процессы, происходящие в организме, может не проявляться на фоне оптимального функционирования физиологической или биохимической системы, но может быть выражено при сдвигах функционального состояния этих систем, например, при действии экстремальных факторов среды. Для изучения молекулярных механизмов антистрессорного действия ИНИЛИ в нашей работе использована модель ГБ О- индуцированного окислительного стресса. Выбор этой модели стрессорного воздействия связан с необходимостью изучения механизмов окислительного стресса и адаптации к нему организма как наиболее сложной проблемы биологии и медицины. Актуальность данной проблемы обусловлена тем, что случаи кислородной интоксикации встречаются в практике ГБО-терапии при передозировке кислорода или повышенной индивидуальной чувствительности организма (Лукаш и др., 1991). Особого внимания заслуживает, в связи с антиоксид антным и мембраностабилизирующим действием, низкоинтенсивное инфракрасное излучение лазера, применяемое для коррекции окислительного стресса, вызванного ГБО.
Основными и универсальными механизмами развития стрессорной реакции, возникающей при действии на организм различных факторов, и, в частности, ГБО-индуцированного окислительного стресса, являются интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) на фоне повышенной активности прооксидантной системы, истощения потенциала эндогенной антиоксидантной системы (АОС) и дестабилизации структуры клеточных мембран. Мембраны клеток являются мишенью для действия стресс-факторов и фармакологических веществ. В связи с этим изучение молекулярных механизмов функционирования биомембран в норме, при стрессорных процессах и в условиях корригирующего влияния ИНИЛИ необходимо, прежде всего, для разработки современных методов и критериев оценки нарушений нативного структурно-функционального состояния компонентов биомембран, а также поиска эффективных способов профилактики и лечения различных стрессорных состояний. В этом плане определенный интерес представляет изучение механизма реализации биологической активности ИНИЛИ, регулирующего СРП.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение роли ИНИЛИ в регуляции свобод норадикальных процессов в тканях и мембранах эритроцитов (МЭ) крыс, их структури о-функционального состояния, а также его влияние на генетический аппарат в норме и после ГБО-индуцированного окислительного стресса.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
Исследовать влияние ИНИЛИ на интенсивность хемилюминесценции (ХЛ) и процессов ПОЛ, активность антиоксидантних ферментов, структурное состояние мембран эритроцитов, показатели эндогенной интоксикации и мутационные процессы в различных тканях интактных животных.
Изучить влияние ИНИЛИ на индукцию свободнорадикальных процессов, оцениваемых по интенсивности Н202-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, содержание молекулярных продуктов ПОЛ и активность компонентов антиоксидантной системы -супероксиддисмутазы, каталазы, церулоплазмина в различных тканях животных, предварительно подвергнутых ГБО-индуцированному окислительному стрессу.
Исследовать действие ИНИЛИ на стабильность и структурное состояние мембран эритроцитов животных (с помощью флуоресцентного зонда пирена), предварительно подвергнутых ГБО-индуцированному окислительному стрессу.
4, Изучить влияние ИНИЛИ на показатели эндогенной интоксикации в крови крыс по уровню фракций молекул средней массы, мочевины и лейкоцитарному индексу интоксикации после ГБО-индуцированного окислительного стресса.
5. Оценить генотоксичность ИНИЛИ по уровню SOS-ответа E.coli С 600 и уровень аберраций хромосом в тканях животных, подвергнутых ГБО- индуцированному окислительному стрессу.
В общетеоретическом плане и в практическом отношении выяснение молекулярных механизмов действия ИНИЛИ, его участия в регуляции важнейших процессов жизнедеятельности клеток в результате разрешения поставленных задач может оказаться ключом к решению наиболее актуальной проблемы медицины, связанной с расширением сферы использования низкоэнергетических лазеров. Весьма интересным и практически значимым представляется исследование антиоксидантною эффективности ИНИЛИ при стрессе с целью дальнейшего применения в лечебной и профилактической медицине, по крайней мере, в тех диапазонах доз и режимах воздействия, которые обычно применяются в курсовой лазеротерапии.
Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на биологические объекты
По своей природе лазерное излучение, как и свет, относится к электромагнитным колебаниям оптического диапазона, от ультрафиолетового до инфракрасного. Собственно слово ЛАЗЕР является аббревиатурой английского термина «Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation», что в переводе означает: усиление света стимулированным излучением.
Одной из важнейших характеристик лазерного излучения является его спектральная характеристика или длина волны, измеряемая в нанометрах (нм) или микрометрах (мкм) [1 мкм = 1000 нм]. Согласно данным P.J. Muller (1990), глубина проникновения лазерного излучения, как и монохроматического света, во многом определяется длиной волны излучения.
Все процессы, связанные с поглощением света в живых системах, названы фотобиологическими, а им предшествуют фотохимические реакции, вызванные непосредственным поглощением светового излучения в виде отдельных порций - квантов (hy), фотоакцепторами, имеющими в своем спектре максимум, который совпадает с максимумом в спектре источника облучения, и тогда происходит резонансное поглощение (Рубин, 1987).
Фотобиологической активностью обладает свет в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях. По своей природе фотобиологические процессы достаточно разнообразны и специфичны. В основе их лежат фотофизические и фотохимические реакции, возникающие в организме при действии света. Фотофизические реакции преимущественно обусловлены нагреванием объекта до различной степени и распространением тепла в биотканях. Элементарная фотохимическая реакция связана с перемещением электронов на орбитах в атомах поглощающего свет вещества. На молекулярном уровне фотохимические реакции могут выражаться в виде фотоионизации вещества, его фотоокислении или восстановлении, фотодиссоциации молекул, их перестройке - фотоизомеризации, либо в непосредственном разрушении вещества — фотолизе. Фотохимическое и фотофизическое действие может оказывать только тот свет, который поглощается биологическим объектом.
При взаимодействии лазерного излучения с биологической тканью имеют место обычные оптические эффекты, возникающие при прохождении света через неоднородную среду. Часть падающего на биоткань лазерного излучения отражается от ее поверхности из-за несоответствия коэффициентов преломления света самой ткани и окружающей ее среды. Проникающее в ткань лазерное излучение подвергается многократному рассеиванию, поглощению различными биологическими структурами и частичному преобразованию во вторичное излучение. Поглощенная часть световой энергии может быть преобразована в молекулах биологического вещества в энергию колебательных процессов, электронного возбуждения или диссоциации молекул, переводя те или иные биологические соединения в активное состояние. Другая часть поглощенной энергии идет на возбуждение флуоресценции или фосфоресценции.
Свет рассматривается как внешний фактор, способный внести изменения в биологические системы. Все типы возбуждений макромолекул укладываются в диапазон энергии кванта от 0,1 до 5 эВ. Показано, что квант света способен изменять конформационную структуру белка. Перенос электрона в макромолекулярных комплексах сейчас рассматривается, наряду с процессами конформационной релаксации, как один из фундаментальных механизмов трансформации энергии в биологических системах. Энергоперенос к тому же является одним из необходимых условий функционирования ферментов. Пусковым моментом в сложном механизме действия лазерного излучения на биологические объекты является восприятие световых лучей фоторецепторами, трансформация их молекулярной композиции и изменения их физико-химического состояния, В дальнейшем происходит активизация биохимических реакций с инициацией в ферментах активных и аллостерических центров и ростом их количества. Подтверждением этому является большое число исследований, свидетельствующих о положительной динамике ферментативной активности после лазерной физиотерапии (Девятков и др., 1987; Козлов и др., 1993; Владимиров, 1994; Кару, 2000; Клебанов, 2002; Владимиров и др., 2004).
В различных спектральных диапазонах свет обладает специфическим действием на организм. Ультрафиолетовое излучение преимущественно поглощается молекулами нуклеиновых кислот, белков и липидов. Наиболее сильно УФ-лучи воздействуют на азотистые основания нуклеиновых кислот, поэтому они в большей мере подвергаются фотохимическим превращениям, нередко приводя к мутациям и гибели клеток. В зависимости от длины волны и мощности У Ф-из лучения может наблюдаться различная степень инактивации молекул белка и липидов: от снижения ферментативной активности белков и снижения функциональных свойств клеточных мембран до необратимого изменения клеточных структур (Девятков и др., 1987).
Свет в видимой области спектра преимущественно поглощается хроматофорными группами в белковых молекулах, пигментами и кислородом. Наиболее важная роль здесь принадлежит гемоглобину, меланину и ряду ферментов. Воздействие лазерного излучения с длиной волны 0,63 мкм на ткани живого организма, на разные участки поверхности тела и органов при плотности мощности 0,1 - 500 мВт/см2 с экспозицией от нескольких секунд до нескольких минут вызывает различные реакции организма
Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизатов
После отбора плазмы крови осадок эритроцитов ресуспендировали в 10 мл охлажденного физиологического раствора или забуференного 0,01 М трис-HCl буфером рН 7,4 раствора ОД 5 М NaCl, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Процедуру повторяли трижды. Из полученного плотного осадка эритроцитов готовили суспензии необходимой концентрации на забуференном рН 7,4 физиологическом растворе.
Для получения гемолизатов необходимой концентрации отмытые эритроциты гемолизировали в соответствующем объеме дистиллированной воды путем энергичного встряхивания содержимого пробирки. . Приготовление гомогенатов тканей
Мозг и печень промывали в ледяном физиологическом растворе и высушивали фильтровальной бумагой. Для получения 10%-х гомогенатов тканей навески печени и мозга после предварительного размельчения гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10-кратном объеме (вес ткани/объем) физиологического раствора на холоду. Часть полученных гомогенатов обрабатывали тритоном Х-100 (конечная концентрация 0,1%) и инкубировали в течение 10 мин. при 37С на водяной бане, затем центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Для определения активности ферментов использовали надосадочную жидкость.
а) Измерительная аппаратура Хемилюминесцентный анализ проводился на установке для регистрации индуцированной ХЛ, собранной в нашей лаборатории (Левин, 1988). В качестве детектора использовали фотоэлектронный умножитель ФЭУ-37. Базовым прибором служил сцинтилляционный спектрометр «22028 RFT» (Германия), оснащенный счетчиком импульсов и времени с индикацией на световом табло, выходом на печатающее устройство и линейным измерителем скорости счета с выходом на самописец с лентой, отградуированной непосредственно в импульсах в секунду. Прямоугольная стеклянная измерительная кювета термостатировалась с помощью внешнего водяного термостата в пределах 37±0,5С. Конструкцией камеры была предусмотрена возможность перемешивания содержимого кюветы и дозированного введения в нее реагентов по светозащитным трубопроводам, б) Определение активности хемилюминесценции плазмы крови в системе Н2О2-ЛЮМИНОЛ
Метод (Шестаков и др., 1979) основан на катализируемом соединениями металлов переменной валентности (железа или меди) распаде перекиси водорода с образованием радикалов Н02 и ОН , которые вызывают интенсивную окислительную ХЛ люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона) (Владимиров и др., 1991).
В реакционную кювету вносили исследуемую биологическую жидкость (плазму крови, гомогенат мозга, печени) в объеме 0,1 мл и 2,9 мл трис-HCl буфера (рН=7,35), содержащего 50 мкмоль люминола. В течение 100 сек вели прогрев при 37С инкубационной смеси в камере ФЭУ с параллельным измерением фонового свечения, затем процесс индуцировали введением 0,5 мл 350 мМ перекиси водорода, включая одновременно счетчик импульсов. Измеряли светосумму импульсов за 500 сек и выражали в условных единицах как разность индуцированного и фонового свечения. При этом на самописце имело место графическое представление процесса, происходящего в кювете.
Метод основан на определении реактивности нейтрофильных лейкоцитов путем стимуляции цельной крови дрожжевыми клетками для увеличения квантового выхода реакции ЛХЛ (Прокофьев и др., 1995).
Цельную кровь собирали в бюксы с гепарином (20 ME гепарина на 1 мл крови). 0,05 мл цельной крови переносили в силиконизированную кювету с системой для хемилюминесцентного анализа, содержащую 2,9 мл раствора Хенкса рН=7,4 без красителя с 0,1% глюкозой, 0,01 мл раствора люминола, 0,02 мл взвеси дрожжей. Люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона) марки х. ч. был очищен многократно перекристаллизацией в HCI и растворен в концентрации 5 10 5 М в 0,5% дим етил сульфоксид е. Дрожжи (Sacchoromyces cerevisial), предварительно инактивированные при 60С в течение 1 ч, разводили раствором Хенкса до концентрации 2x10 кл/мл.
Подготовленные ex tempora образцы помещали в термостатированное (37С) кюветное отделение хемилюминометра, разработанного в лаборатории НИИБ на базе сцинтилляционного спектрометра «22028 RFT» (Германия). В качестве детектора был применен ФЭУ-37. Измерение проводили при непрерывном перемешивании содержимого кюветы. Выходной сигнал ФЭУ измеряли методом счета фотонов.
Динамику метаболических изменений клеток оценивали по следующим параметрам: длительности латентного периода до начала развития медленной вспышки (в с), светосумме медленной вспышки до достижения максимума свечения (в отн. ед.), высоте медленной вспышки (в мм).
Определение содержания диеновых конъюгатов
Активность каталазы в лизатах эритроцитов и супернатантах гомогенатов тканей определяли методом М.А. Королкжа и др. (1988), основанным на способности перекиси водорода связываться с солями молибдата аммония в стойкий комплекс, дающий желтое окрашивание.
Инкубационная смесь включала ОД мл супернатанта гомогената или 0,02 мл гемолизата и 2 мл 0,03% раствора НгОд. В контрольную пробу вместо белка вносили бидистиллят. Пробы инкубировали в течение 10 мин при 25С, затем реакцию останавливали добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Окраску измеряли при длине волны 410 нм. Об активности каталазы судили по степени уменьшения окраски в опытных пробах по сравнению с контрольными. Активность фермента рассчитывали с помощью коэффициента миллимолярной экстинкции Н202, равного 22,2 х 10 мМ" см", и выражали в нмоль Н2О2 на 1 мг гемоглобина - в эритроцитах, в нмоль Н2О2 на 1 мг белка - в тканях.
Для расчета активности СОД и каталазы в эритроцитах определяли содержание гемоглобина. Концентрацию гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Гемоглобин в присутствии окислителя и цианид анионов образует в водном растворе гемиглобинцианид, окраска которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе (Меньшиков, 1987).
Определение гемоглобина осуществляли с помощью стандартного набора фирмы «Эколаб» (Россия). Смешивали 0,8 мл 1% гемолизата и 3,2 мл трансформирующего раствора. Затем выдерживали 15 мин и измеряли экстинкцию в кювете длиной 1 см при длине волны 540 нм против трансформирующего раствора. Параллельно обрабатывали калибровочную пробу, содержащую 0,8 мл калибровочного раствора гемиглобинцианида, соответствующего пробе с содержанием гемоглобина 150 г/л. Расчет содержания гемоглобина проводили по формуле:
C = Eon/EKajlx30, где Еоп - экстинкция опытной пробы; ЕКал - экстинкция калибровочной пробы. Концентрацию гемоглобина выражали в г/л.
Определение оксидазной активности церулоплазмина Оксидазную активность церулоплазмина (ЦП) в плазме крови определяли модифицированным методом Ревина (Колб, Камышников, 1982).
Принцип метода состоит в катализируемом ЦП окислении парафенилендиамина кислородом с образованием окрашенных продуктов. К 0,05 мл плазмы крови приливали 4 мл 0,4 М ацетатного буфера рН 5,5 и 0,5% раствора солянокислого парафенилендиамина. В контрольную пробу добавляли 1 мл 3% раствора фторида натрия для ингибирования оксидазной активности ЦП. Контрольную и опытную пробы помещали в термостатируемую при 37С водяную встряхивающуюся баню на 1 час. После инкубации и остановки реакции 3% фторидом натрия в опытной пробе спектрофотометрировали против контроля в 1 см кварцевых кюветах при длине волны 540 нм. Активность ЦП в мкМ определяли по формуле: Е54о х 5,79 = мкМ, где 5,79 - молярный коэффициент экстинкции при толщине поглощающего слоя в 1 см.
Использованный нами метод явился модификацией метода окрашивания железосодержащих белков при гель-электрофорезе (Мауэр, 1971). В основе метода лежит реакция окисления бензидина перекисью водорода, идущая с образованием окрашенных продуктов. Эта реакция катализируется белками, обладающими пероксидазной активностью.
Для приготовления рабочего реактива в 100 мл 7% уксусной кислоты растворяли 16 г ацетата натрия (тригидрат). Раствор при комнатной температуре последовательно насыщали этилендиаминтетраацетатом натрия - ЭДТА (-500 мг) и бензидинсульфатом (—50 мг) в течение 15-20 мин, фильтровали, К 100 мл полученного раствора приливали 1 мл 1М раствора перекиси водорода. Рабочий реактив готовили перед употреблением.
Для определения СПА к 4 мл рабочего реактива добавляли 0,02 мл плазмы (сыворотки) крови. Пробы спектрофотометрировали при 600 нм в 1-см кюветах против рабочего реактива, регистрируя максимальную экстинкцию (Е max), развивающуюся через 2-7 минут.
Влияние инфракрасного низкоинтенсивного лазерного излучения (ИНИЛИ) на Н20г-люминолзависимуюхемшіюмииесце}щшо в различных: тканях крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе
Спонтанная хемилюминесценция (СХЛ) тканей животных возникает главным образом в процессе свободнорадикального окисления (СРО) липидов и липопротеидов (Тарусов и др., 1961; Барабой, 1984). Присутствие в тканях биоантиоксидантов удерживает этот процесс СРО на относительно низком стационарном уровне. Лишь при резком усилении СРО липидов и израсходовании резерва тканевых биоантиоксидантов создаются условия для появления вспышки СХЛ. Развитие окислительного стресса, как правило, сопровождается повышением интенсивности хемилюминисценции. Добавление НзО в реакционную среду, содержащую НЬ и люминол, сопровождается развитием индуцированной ХЛ, которая возникает при рекомбинации свободных радикалов и, следовательно, прямо отражает изменение их содержания (Теселкин и др., 1996). .
Метод регистрации интенсивности СХЛ биологических тканей, жидкостей и клеточных суспензий высокочувствителен и отражает быстропротекающие сдвиги равновесия ПОЛ -»АОА (антиоксидантная активность). С помощью приведенного метода измеряли несколько параметров ХЛ, которые характеризуют различные стороны свободнорадикального перекисного окисления липидов.
Уровень амплитуды вспышки ХЛ (Н), инициированной перекисью водорода, характеризует резистентность тканей и липидов к перекисному окислению. Величина ее прямо пропорциональна окисляемости липидов и концентрации металлов переменной валентности и обратно пропорциональна содержанию природных антиоксидантов в исследуемом биосубстрате. Светосумма ХЛ (Sm), инициированной Нг02, указывает на скорость расходования свободных радикалов липидной природы вследствие их взаимодействия с природными антиоксидантами (Бабенко и др., 1983).
В мозге интактных животных уровень Н равен 80,80 ± 10,50 мм, a Sm -800,70 ± 13,16 отн.ед. хемилюминесценции (табл. 3.1 Л.).
После действия ГБО (0,5 МПа, 1 ч) наблюдалось уменьшение интенсивности ХЛ - высоты быстрой вспышки на 43% ( 0,01), при этом значение светосуммы оставалось на контрольном уровне. Параметры ХЛ в мозге крыс при ГБО оставались на уровне контроля и в постгипероксическии период. Проведение 5 сеансов ИНИЛИ крысам, подвергнутым окислительному стрессу, также достоверно снижало интенсивность эндогенного СРО липидов в мозге животных: высоты быстрой вспышки на 33% ( 0,05), светосуммы ХЛ на 15% ( 0,001) как по сравнению с контролем, так и с крысами, перенесшими острый окислительный стресс.
Снижение уровня свечения в различных группах исследуемых животных можно рассматривать как объективный показатель устойчивости и совершенства регуляции гомеостаза головного мозга, уникальность его антиоксидантных систем. Головной мозг теплокровных животных является строгим «аэробом» и занимает одно из ведущих мест среди других органов по потреблению кислорода и глюкозы. Значительная часть кислорода, потребляемая мозгом, расходуется на окисление глюкозы. Ткань мозга обладает эволюционно выработанной мощной системой антиоксидантной защиты, которая даже в условиях повышенного парциального давления кислорода способна поддерживать низкий уровень перекисного окисления липидов.
Иная динамика показателей НгОг-индуцируемой люминолзависимой ХЛ наблюдается при исследовании тканей печени. Печень участвует в регуляции практически всех видов обмена веществ и обеспечивает необходимые условия жизнедеятельности для других органов и тканей. Кроме того, печень является основным органом, где происходит обезвреживание экзогенных субстратов (ксенобиотиков) и токсических веществ, образующихся эндогенно в других органах. В печени особенно активна система микросомального окисления. Липидные перекиси нарушают целостность эндоплазматического р етикулума и вызывают структурно-функциональные нарушения системы цитохрома Р-450 (Болдырев, 1990). Цитохром Р-450 в печени является мембраносвязанным ферментом и при повреждении мембран эндоплазматического ретикулума при различных патологических состояниях происходит его инактивация (Арчаков, 1978).
В табл.3.1.1. и на рис.3.1.1. и 3.1.2. представлены результаты определения интенсивности ХЛ в ткани печени крыс. У интактных животных в печени уровень высоты быстрой вспышки составляет 124,50 ± 10,50 мм, а Sm - 50,30 ± 6,77 отн.ед. ХЛ. Как следует из полученных результатов, действие ИНИЛИ на интактных крыс приводило к увеличению интенсивности Н на 18%, a Sm на 54% ( 0,05).
Пребывание животных в условиях ГБО приводило к резкой генерации АФК в ткани печени. После действия ГБО (0,5 МПа, 1 ч) достоверно возрастала высота быстрой вспышки на 40% (0,001), а светосумма на 343% (0,001) по сравнению с контролем. В постгипероксический период уровень свободнорадикальных процессов в печени незначительно снижался, на что указывает уменьшение на 17% и 44% интенсивности Н и Sm по сравнению с животными в условиях ГБО (3 группа). При этом интенсивность Н и Sm на 32% ( 0,05) и 150% ( 0,001) превосходила контроль.
Действие ИНИЛИ на крыс, перенесших окислительный стресс в постгипероксический период (5 группа) приводило к существенному снижению уровня СРП в печени. Причем, светосумма ХЛ опускалась ниже контроля на 7%, а высота быстрой вспышки приближалась к контрольным значениям в печени крыс, которым проводили ИНИЛИ в постгипероксический период, и на 63% и 15% была меньше, чем в группе крыс в постгипероксический период без реабилитации (4 группа).
Позитивная динамика СРП в печени крыс, прошедших реабилитацию с помощью ИНИЛИ, вероятно связана со специфическими функциями печени как органа, осуществляющего разрушение, утилизацию и выведение поврежденных макромолекул и клеток крови (контроль внутреннего гомеостаза), для чего, возможно, необходимо поддерживать повышенный уровень свободнорадикальных процессов. В частности было показано, что нарушение функционального состояния приводит к активации цитохрома Р-450 (Владимиров, Арчаков, 1972). Особенности СРО липидов в плазме крови крыс, подвергнутых ГБО-индуцированному окислительному стрессу, сопоставимы в целом со СРП в мозге и печени.
